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1、限制酶限制酶的定义1限制酶的种类2型限制酶的应用3II型限制型限制酶DNA甲基化酶4第1页/共40页限制酶的定义1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶是可以识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶，简称限制酶限制酶。限制酶在基因工程中广为使用。第2页/共40页 限制性核酸内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶。细菌通过自身的限制酶，破坏入侵的外源DNA，从而保护自身。第3页/共40页 30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种“限制”病毒生存的办法则可归功于细
2、胞内部可摧毁外源摧毁外源DNADNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌大肠杆菌的EcoR IEcoR I和EcoR EcoR IIII，以及来源于流感嗜血杆菌（流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）的Hind IIHind II和Hind IIIHind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。限制酶的发现第4页/共40页命名EcoR IEscherichia属名属名Coli种名种名Ry13株系株系编号编号第5页/共40页切割频率 切割频率是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期的切割概率。可以估算该限制性核酸内切酶在某种D
3、NA分子中的切点数。前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、碱基排列在DNA分子上是随机分布的。这样每个位点上，每一种碱基出现的概率即为1/4。如果某限制性核酸内切酶的识别序列是6 bp，则其切割频率为(1/4)6=1/4096，即每隔4.1kb就可能有一个切割点。当识别序列为n个 bp，则其切割频率为（1/4）n。第6页/共40页限制酶的种类2I I型限制酶型限制酶 通常其切割位点与识别位点相距千个碱基,不能准确定位切割位点。例如：EcoB、EcoK。IIII型限制酶型限制酶 所识别的序列多为短的回文序列，切割位点与识别位点一致。是基因工程上，实用性较高的限制酶种类。例如：EcoRI、Hind
4、III。IIIIII型限制酶型限制酶 切割位点与识别位点相距24-26个碱基，不能准确定位切割位点。例如：EcoPI、HinfIII。第7页/共40页什么是回文序列？GAATTAAGC TTAATTCGAATATTCCTTATAAG第8页/共40页IIII型限制酶型限制酶ApaI识别序列：5GGGCCC3BamHI识别序列：5GGATCC3BglII识别序列：5AGATCT3EcoRI识别序列：5GAATTC3HindIII识别序列：5AAGCTT3KpnI识别序列：5GGTACC3NcoI识别序列：5CCATGG3NdeI识别序列：5CATATG3NheI识别序列：5GCTAGC3NotI识
5、别序列：5GCGGCCGC3SacI识别序列：5GAGCTC3SalI识别序列：5GTCGAC3SphI识别序列：5GCATGC3XbaI识别序列：5TCTAGA3XhoI识别序列：5CTCGAG3第9页/共40页 II型限制酶切割DNA后形成粘性末端粘性末端或平末端平末端分别由错位切和平切错位切和平切形成。能形成粘性末端的酶在基因工程中应用最多。粘性末端和平末端 55NNNNNNGTTAACGTTAACNNNNNN3 3 33NNNNNNCAATTGCAATTGNNNNNN5555NNNNNNGTT AACGTT AACNNNNNN3333NNNNNNCAACAA TTGTTGNNNNNN5
6、55NNNGCGGCCGCGCGGCCGC NNN33NNNCGCCGGCGCGCCGGCGNNN 5 5NNNGC GGCCGCGC GGCCGC NNN33NNNCGCCGG CGCGCCGG CGNNN5 HaeHae的识别序列的识别序列的识别序列的识别序列NotNot 的识别序列的识别序列的识别序列的识别序列第10页/共40页5粘性末端和3粘性末端5NNGCGGCCGCGCGGCCGC NN33NNCGCCGGCGCGCCGGCGNN 5 5NNNGC-GC-OH OH P-P-GGCCGCGGCCGC NNN33NNNCGCCGG-CGCCGG-P P HOHO-CG-CGNNN5
7、5粘性末端3粘性末端5NNGGTACCGGTACCNN33NNCCATGGCCATGGNN 5 5NNGGTAC-OH P-CGGTAC-OH P-CNN33NNC-P HO-CATGGC-P HO-CATGGNN 5 第11页/共40页同尾酶 切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。5-G5-GGATCGATCC-3 C-3 3-C3-CCTAGCTAGG-5G-5 BamH IBcl I5-T5-TGATCGATCA-3 A-3 3-A3-ACTAGCTAGT-5T-5 5-A5-AGATCGATCT-3 T-3 3-T3-TCTAGCTAGA-5 A-5 Bgl 5-
8、U5-UGATCGATCY-3 Y-3 3-Y3-YCTAGCTAGU-5U-5 Xho 第12页/共40页同裂酶 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶子序列，这类酶称为同裂酶。识别序列和切割位点都相同的叫同序同切酶，识别序列相同但切割位点不同的叫同序异切酶。例如：Hpa和MspI为同序同裂酶（CCGG）。XmaI和SmaI为同序异裂酶，都识别CCCGGG，但Xma I的切点在CCCGGG，形成带有CCGG的粘性末端；而Sma I的切点则在CCCGGG，形成平末端。第13页/共40页有些限制酶识别的序列不是回文序列。Acc 的识别切割位点分别是GTAGAC 和 GTCTACBbvC 的
9、识别切割位点分别为CCTCAGC和GGAGTCG特殊的II型限制酶GTATCGACCATAGCTGCCTCAGCGGAGTCG第14页/共40页1)DNA1)DNA的纯度2)DNA2)DNA的甲基化程度3)3)酶切消化反应的温度4)DNA4)DNA的分子结构5)5)限制性核酸内切酶的缓冲液6)6)StarStar活性（星活性）影响限制性酶活性的因素第15页/共40页 限制酶消化DNA底物的反应效率，很大程度上取决于所使用的DNA的纯度。DNA制剂中的含有蛋白质、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS以及高浓度的盐离子等都有可能抑制限制酶的活性。提高限制酶对低纯度DNA的反应效率，一般采用三种方法：增
10、加限制酶的用量。扩大酶催化反应的体积。（以使潜在的抑制因素被相应地稀释）延长酶催化反应的保温时间。DNADNA的纯度第16页/共40页DNADNA的甲基化程度 识别序列中特定核苷酸的甲基化作用，会严重影响酶的催化效率。为避免这样的问题，在基因克隆中使用的质粒DNA是从失去甲基化酶的大肠杆菌菌株中提取的。第17页/共40页酶切消化反应的温度 不同的限制酶具有不同的最适反应温度。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度是37，有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37，SmaI是25、ApaI是30；有些高于标准的37，例如MaeI是45、BclI是50、MaelII是55。第18页/共40页DNA
11、的分子结构 DNA分子的不同构型对限制酶的催化效率也有很大的影响。某些限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量，要比消化线性DNA的高出许多倍，最高的可达20倍。第19页/共40页核酸内切限制酶的缓冲液II型限制酶的最适pH一般是6-8,缓冲液中通常含有Mg2+。第20页/共40页Star活性（星活性）限制酶在一些特定条件下使用时，识别位点的特异性降低，可以把不同于正常识别的序列切断，这个现象叫Star活性。Star活性出现的频率，根据酶、底物DNA、反应条件的不同而不同。Star活性主要受低粒子强度、高pH值以及过高的甘油浓度的影响。第21页/共40页第22页/共40页第23页/
12、共40页第24页/共40页 消化DNA样品后，需要钝化内切酶的活性，终止反应。方法：1）65温浴5-10分钟，使酶失活。2）加入EDTA除去酶分子的镁离子，是使酶失活。3）加SDS或者尿素使酶解聚沉淀。4）用等体积的酚抽提酶解产物，提取DNA。限制性内切酶反应的终止第25页/共40页限制性内切酶的保存限制酶于-20用50的甘油保存。第26页/共40页 基因工程中常用的工具酶有限制酶限制酶、DNA聚合酶聚合酶、DNA连接酶连接酶、逆转录酶逆转录酶、碱性磷酸酶碱性磷酸酶、末端末端转移酶转移酶、甲基化酶甲基化酶。型限制酶在基因工程中的的应用3第27页/共40页 将目的基因导入受体细胞前，需要用相同相
13、同的限制酶将目的基因和载体切成相同的粘性末端，再通过碱基互补配对的方式，在连接酶的作用下，目的基因和载体完成连接。最后将连接好的重组载体导入细胞。NNAAGCTTNN NNGGATCCNNN NNTTCG AANN NNCCTAGGNNN HindIIIBamHIHindIIIBamHI双酶切法第28页/共40页AGCTTNN NNG ANN NNCCTAG第29页/共40页为什么通常要用两种限制酶？可以有效防止载体自连造成空载体。第30页/共40页HindIIIBamHI连接酶第31页/共40页可不可以用一种酶切割目的基因和载体？可以，此时切割后的载体载体需要加入碱性磷酸酶处理。碱性磷酸酶处
14、理。碱性磷酸酶可以去除去除酶切后切口的磷酸磷酸，从而使粘性末端在加入连接酶后不能重新结合。5NNNGCGGCCGCGCGGCCGC NNN33NNNCGCCGGCGCGCCGGCGNNN 5 5NNNGC-GC-OH OH p-p-GGCCGCGGCCGC NNN33NNNCGCCGG-CGCCGG-p p HOHO-CG-CGNNN5 5NNNGC-OH GGCCGCGC-OH GGCCGC NNN33NNNCGCCGG HO-CGCGCCGG HO-CGNNN5 碱性磷酸酯酶单酶切法第32页/共40页pAGCTTNN NNA-OH HO-ANN NNTTCGAp DNA连接酶第33页/共4
15、0页 基因工程中，很多情况下，基因组中靠近目的基因两侧的碱基并没有没有合适的酶切位点。怎么办？Hsp70A：Ex-F5 CGCCATATGCCAGCTATCGGAATCGATTTGG 3 Nde IHsp70A：Ex-R5 GCGGCCGCATAAAGGTGGGGAGAGCTTACAAC3 Not I 通常是设计合适的PCRPCR引物，让目的基因在PCR扩增后，两侧含有酶切位点。第34页/共40页 DNA甲基化酶4甲基化酶：可以从活性甲基化合物(如S-腺苷甲硫氨酸)上将其甲基转移到其他化合物的酶。可形成各种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行化学修饰形成甲基化产物。DNA甲基化酶：以S-腺
16、苷甲硫氨酸为甲基供体，将甲基转移到DNA特定的碱基上的过程。第35页/共40页 原核生物的甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。第36页/共40页 Dam甲基化酶在 GATC 序列中的腺嘌呤上引入甲基。一些限制酶（如BamH、Bcl、Sau3A等）的识别位点中含 GATC 序列。有些限制酶对Dam甲基化的DNA 敏感，不能切割相应的序列，如 Bcl。有些限制酶对Dam甲基化的DNA不敏感，如 BamH、Sau3A等。第37页/共40页甲基化酶对限制酶的影响：1.修饰酶切位点。构建 DNA 文库时，用 Alu（AGCT）和 Hae（GGCC）部分消化基因组 DNA 后，将得到的片段用 M.EcoR甲基化酶处理，然后加上合成的 EcoR 接头，再用 EcoR来切割时只有接头上的位点可被切割，从而保护基因组片段。2.产生新的酶切位点有些酶只识别经过甲基化的序列。Dpn 是依赖甲基化的限制酶，TCGATCGA 受 M.Taq 处理后形成甲基化(A)产物 TCG*ATCG*A，其中 G*ATC 即为 Dpn 位点。第38页/共40页第39页/共40页感谢您的观看！第40页/共40页