核酸分子杂交七年制.pptx

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1、核酸分子杂交核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridization）是指用是指用标记的标记的已知已知DNA或或RNA片段片段检测样品中检测样品中未知核酸序列未知核酸序列，通过，通过碱基互补配对碱基互补配对原则发生同原则发生同源性结合，再经源性结合，再经显影或显色显影或显色的方法，将结合的的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。核酸序列的位置或大小显示出来。探针探针(probe)：带有可检测标记的已知序列的：带有可检测标记的已知序列的DNA或或RNA片段。片段。第1页/共49页应用：应用：克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定克隆基因的筛选、酶切图谱的

2、制作、基因组中特定基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。目前核酸基因序列的定性、定量检测和疾病的诊断等方面。目前核酸分子杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用分子杂交不仅在分子生物学领域中具有广泛地应用,而且在而且在临床基因诊断上的应用也日趋增多。临床基因诊断上的应用也日趋增多。检测对象检测对象:克隆化的基因组克隆化的基因组DNA,、细胞总、细胞总DNA、总、总RNA。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细。杂交方法不同，被检测的核酸可以是提纯的，也可以在细胞内杂交胞内杂交,即细胞原位杂交。即细胞原位杂交。核酸分子杂交特点：核酸分子杂交特点：高度的灵敏性高度的灵敏性(pg)

3、、高度的特异性、高度的特异性第2页/共49页第一节第一节 核酸分子杂交的基本原理核酸分子杂交的基本原理一、变性（一、变性（denaturation）二、复性（二、复性（renaturation）三、杂交（三、杂交（hybridization）四、预杂交（四、预杂交（prehybridization）第3页/共49页 基本原理基本原理：DNA变性、复性与分子杂交变性、复性与分子杂交第4页/共49页Hybridization第5页/共49页Tm：50%DNA解链的温度，又称融解温度。解链的温度，又称融解温度。（G、C含量）含量）Tm=69.3+0.41*(G+C)%融解温度：融解温度：50杂杂化核

4、酸分子解链温化核酸分子解链温度称为寡核苷酸探度称为寡核苷酸探针的针的Tm值。值。寡核苷酸探针的长寡核苷酸探针的长度、碱基的含量和度、碱基的含量和核酸的序列决定了核酸的序列决定了探针的探针的Tm值。值。实际操作中，常选实际操作中，常选择择低于低于Tm值值5-10进行杂交。进行杂交。Tm=4 X（G+C）+2 X（A+T）第6页/共49页杂交温度：杂交温度：Tm=81.5+161.6logM+0.41（G+C）%-500/n-0.61（甲甲酰酰胺胺%）M为为Na+摩尔浓度，摩尔浓度，n为探针的复杂性为探针的复杂性 例例如如，一一个个长长度度为为500bp的的探探针针，（G+C）含含量量为为50%，

5、杂杂交交体体系系中中含含5 X SSC（0.75mol/L Na+）和和50%甲酰胺，则其甲酰胺，则其Tm值为：值为：Tm=81.5+(-2.07)+20.5 1 30.5=68.4 50%甲酰胺溶液甲酰胺溶液,温度一般选择低于温度一般选择低于 Tm值值20-25杂交温度应杂交温度应:68.4 -25=43.2 甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，甲酰胺是一种变性剂，能干扰碱基堆积力和氢键的形成，降低核酸杂交的降低核酸杂交的Tm值，值，50%的甲酰胺可以使的甲酰胺可以使Tm降低降低30第7页/共49页53535353影响核酸分子杂交的因素影响核酸分子杂交的因素探针的浓度、长度、复

6、杂性探针的浓度、长度、复杂性离子强度离子强度温度与变性剂（甲酰胺）温度与变性剂（甲酰胺）杂交条件的严谨性杂交条件的严谨性 第8页/共49页预杂交预杂交prehybridization概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的概念：为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异非特异性结合性结合，在杂交前用封闭物将这些，在杂交前用封闭物将这些非特异性位点封闭非特异性位点封闭。这一杂交前的处理过程称为预杂交。这一杂交前的处理过程称为预杂交。常用的封闭物：常用的封闭物：（1）变性的非特异性变性的非特异性DNA:如鲑鱼精如鲑鱼精DNA、小牛胸腺、小牛胸腺DNA，又称为覆盖又称为覆盖DNA。（2）高分子化合

7、物：高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖牛血清白蛋白、聚蔗糖400、脱脂奶粉脱脂奶粉第9页/共49页基本实验步骤：基本实验步骤：electrophoresisTransferBlockblocksubstrateprobeMigrationhybridization第10页/共49页第二节第二节 核酸探针核酸探针probe：带有：带有可检测标记的已知可检测标记的已知DNA或或RNA片段，片段，用于检测待测样品中的靶核酸序列。用于检测待测样品中的靶核酸序列。核酸探针的类型核酸探针的类型 核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法 核酸探

8、针的检测核酸探针的检测 第11页/共49页按化学本质分：按化学本质分：DNA探针探针 RNA探针探针 按标记物分：按标记物分：放射性标记探针放射性标记探针核酸探针的类型核酸探针的类型 3H、32P、35S、125I等等优点：高特异性，高灵敏度优点：高特异性，高灵敏度缺点：存在放射性污染，半衰期短缺点：存在放射性污染，半衰期短非放射性标记探针非放射性标记探针生物素，地高辛、荧光素等生物素，地高辛、荧光素等第12页/共49页常用的探针标记法：常用的探针标记法：（1）化学标记法化学标记法：光敏生物素标记法：光敏生物素标记法（2）酶促标记法酶促标记法：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利将标记物预先

9、标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的方法将标记物掺入到探针分子上。用酶学的方法将标记物掺入到探针分子上。切刻平移法、随机引物法、末端标记法等切刻平移法、随机引物法、末端标记法等第13页/共49页 （1）化学标记法：化学标记法：通过分子上的活性基团直接将标通过分子上的活性基团直接将标记物结合到核酸分子上记物结合到核酸分子上.光敏生物素标记法光敏生物素标记法:强光强光10-20分钟，光敏基团与核酸探针的分钟，光敏基团与核酸探针的磷酸基团以共价键结合。磷酸基团以共价键结合。第14页/共49页（2）酶促标记法：）酶促标记法：将标记物预先标记在核苷酸分子上，然后利用酶学的将标记物预先标记在核苷酸分子上，然

10、后利用酶学的 方法将标记物掺入到探针分子上。方法将标记物掺入到探针分子上。缺口平移法、随机引物法、末端标记法等缺口平移法、随机引物法、末端标记法等32P或或35S同位素标记同位素标记的单核苷酸的单核苷酸dig-dUTP的结构的结构第15页/共49页（1）缺口平移法）缺口平移法由由DNA酶酶和大肠和大肠杆菌杆菌DNA聚合酶聚合酶共同完成。共同完成。DNA酶酶：在双链在双链DNA上随机打开若上随机打开若干个单链缺口，产干个单链缺口，产生生3-OH端端大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合聚合酶酶：53DNA聚聚合酶活性；合酶活性；53外切核酸酶活性外切核酸酶活性（nicktranslation）“边切除、边聚

11、合边切除、边聚合”第16页/共49页最合适的缺口平移片段一般为最合适的缺口平移片段一般为50-500个核苷酸。个核苷酸。DNA酶酶的的用量用量和和E.coli DNA聚合酶聚合酶的的质量质量会影响产会影响产物片段的大小。物片段的大小。DNA模板中的模板中的抑制物抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性如琼脂糖会抑制酶的活性,故应使故应使用仔细纯化后的用仔细纯化后的DNA。第17页/共49页随机引物（随机引物（4-6nt）：含：含有各种可能排列顺序的寡有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。核苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶聚合酶Klenow片段：片段：53DNA聚合酶活性聚合酶活性 弱弱35

12、外切核酸酶活性外切核酸酶活性 无无53外切核酸酶活性外切核酸酶活性（2）随机引物法）随机引物法（random priming）第18页/共49页产物平均长度为产物平均长度为400-600个核苷酸。个核苷酸。Klenow片段没有片段没有5 3外切酶活性外切酶活性,反应稳定反应稳定,可以可以获得大量的有效探针。获得大量的有效探针。反应时对模板的要求不严格反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。模板也可进行反应。第19页/共49页DNA聚合酶聚合酶Klenow片段标记法片段标记法T4 DNA聚合酶标记法聚合酶标记法末端脱氧核苷酸转移酶标记法末端脱氧核苷酸转移

13、酶标记法T4多核苷酸激酶标记法多核苷酸激酶标记法（3）探针的末端标记：在）探针的末端标记：在5或或3端通过酶促反应加上标记物端通过酶促反应加上标记物酶切酶切第20页/共49页核酸探针检测方法核酸探针检测方法同位素标记探针：放射自显影检测杂交信号同位素标记探针：放射自显影检测杂交信号 放射自显影是指利用放射线在放射自显影是指利用放射线在x线片的成影作用来线片的成影作用来检测杂交信号。检测杂交信号。取出杂交膜，在取出杂交膜，在Whatman滤纸上晾干，用保鲜膜滤纸上晾干，用保鲜膜包好，在暗室中置于包好，在暗室中置于X线片上，加增感屏，固定于暗盒线片上，加增感屏，固定于暗盒内，内，-70曝光适当时间

14、（曝光适当时间（1-7天），在暗室中取出天），在暗室中取出X线线片，显影、定影，即可在片，显影、定影，即可在X线片上读出杂交带。线片上读出杂交带。第21页/共49页非放射性标记探针：非放射性标记探针：偶联反应偶联反应+显色反应显色反应Dig：半抗原，可通过半抗原，可通过抗原抗体反应抗原抗体反应系统与系统与显色体系显色体系偶联偶联Dig-DNA探针探针 +抗抗Dig抗体抗体-碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（或辣根过氧化物酶（HRP）+底物底物 ：BCIP+NBT 蓝紫色蓝紫色或或 DAB 红棕色红棕色；TMB 蓝色蓝色第22页/共49页 核酸分子杂交核酸分子杂交 固相杂交固相杂交

15、 液相杂交液相杂交膜上印迹杂交膜上印迹杂交 核酸原位杂交核酸原位杂交 核酸分子杂交的分类核酸分子杂交的分类第三节第三节 核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术第23页/共49页一、膜上印迹杂交一、膜上印迹杂交 印迹技术印迹技术：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定：将凝胶中待测的核酸分子转移到一定 的固相支持物上的方法。的固相支持物上的方法。指将待测核酸序列结合到一定的指将待测核酸序列结合到一定的支持物支持物上，然后与上，然后与存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。存在于液相中的核酸探针进行杂交的过程。第24页/共49页1固相支持物的选择固相支持物的选择特点：特点：较强的结合核酸的能力较强的结合核酸的能

16、力（10g/cm2）;与核酸分子结合后，不影响核酸与探针的杂交反应与核酸分子结合后，不影响核酸与探针的杂交反应;与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等；与核酸分子的结合稳定、牢固，能经受杂交、洗膜等；非特异性吸附少，经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉非特异性吸附少，经洗膜能将非特异性吸附的探针洗脱掉;具有良好的机械性能，柔软性好、韧性强，便于操作。具有良好的机械性能，柔软性好、韧性强，便于操作。常用的固相支持物：常用的固相支持物：硝酸纤维膜（硝酸纤维膜（NC）、尼龙膜、）、尼龙膜、PVDF膜（聚二氟乙烯膜）等膜（聚二氟乙烯膜）等第25页/共49页固相支持物的选择固相支持物的选择良好的固

17、相支持物应具备的条件：良好的固相支持物应具备的条件：具有较强的结合核酸分子的能力（具有较强的结合核酸分子的能力（10g/cm10g/cm2 2）与核酸分子结合后不影响其与探针分子的杂交反应与核酸分子结合后不影响其与探针分子的杂交反应与核酸分子结合牢固与核酸分子结合牢固非特异性吸附少非特异性吸附少具有良好的机械性，柔软性好、韧性强，便于操作具有良好的机械性，柔软性好、韧性强，便于操作常用的固相支持物常用的固相支持物 硝酸纤维膜、尼龙膜、硝酸纤维膜、尼龙膜、PVDFPVDF膜等膜等第26页/共49页 1、硝酸纤维膜：、硝酸纤维膜：是目前使用最多的固相支持物，对是目前使用最多的固相支持物，对单链单链

18、DNA具有较强的吸附作用，具有较强的吸附作用，RNA经过一些特殊的变性剂处理后，也易于结合到此膜上经过一些特殊的变性剂处理后，也易于结合到此膜上 在在高盐浓度高盐浓度下，其结合能力下，其结合能力80-100g/cm2 吸附的单链吸附的单链DNA或或RNA在真空干烤后依靠在真空干烤后依靠疏水作用疏水作用而吸附在膜上而吸附在膜上 优点优点 杂交信号本底较低杂交信号本底较低 缺点缺点 由于是靠疏水作用结合由于是靠疏水作用结合DNA，这种结合并不十分牢固，随杂交，这种结合并不十分牢固，随杂交 及洗膜过程及洗膜过程DNA会慢慢脱离硝纤膜而使杂交信号下降会慢慢脱离硝纤膜而使杂交信号下降 对小分子量的对小分

19、子量的DNA片段（片段（200bp）结合能力不强）结合能力不强 靠高盐与靠高盐与DNA结合，故不适用于电转移结合，故不适用于电转移 易破碎易破碎第27页/共49页2、尼龙膜：、尼龙膜：对对单链和双链单链和双链DNA及及RNA的结合能力达到的结合能力达到350-500g/cm2。对小分子量的核酸片段也有较强的结合能力。对小分子量的核酸片段也有较强的结合能力。真空干烤或紫外交联，核酸与膜以真空干烤或紫外交联，核酸与膜以共价结合共价结合。优点优点 吸附力强（共价结合）、机械性能好（不易破碎、可重复使用）吸附力强（共价结合）、机械性能好（不易破碎、可重复使用）缺点缺点 对蛋白具有高度亲和力，不宜使用于

20、非同位素探针；对蛋白具有高度亲和力，不宜使用于非同位素探针；杂交信号的本底也高。杂交信号的本底也高。第28页/共49页3、PVDF膜（聚二氟乙烯）：膜（聚二氟乙烯）：1.与尼龙膜相似与尼龙膜相似2.其疏水性碳氟化合物可加强与核酸中磷酸成分的离其疏水性碳氟化合物可加强与核酸中磷酸成分的离子反应，而比尼龙膜结合力更强子反应，而比尼龙膜结合力更强3.且在预杂交中很容易被封闭且在预杂交中很容易被封闭4.杂交本底低杂交本底低5.结实耐用，可多次杂交。结实耐用，可多次杂交。第29页/共49页2印迹方法印迹方法 Mechanics of transfer虹吸印迹法（虹吸印迹法（Capillary）真空转移法

21、（真空转移法（Vacuum）电转移法（电转移法（Electrophoretic）Blot DNA to membrane第30页/共49页 Capillary Blotting(upward)no special equipment required!1975年年 E.Southern Southern DNA 印迹转移技术印迹转移技术DNA片段片段15kb，18小时小时第31页/共49页Electrophoretic blotting不宜用硝酸不宜用硝酸纤维素膜纤维素膜一般一般23小时，小时，最多最多6 8小时小时especially good for small fragments res

22、olved by PAGE第32页/共49页Vacuum blotting3060分钟分钟more efficient and quantitative than capillarymust apply vacuum evenly and not too strongly第33页/共49页3印迹类型印迹类型 Southern印迹杂交印迹杂交 Northern印迹杂交印迹杂交 斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交 反向斑点杂交反向斑点杂交 菌落或噬菌斑杂交菌落或噬菌斑杂交第34页/共49页提取提取DNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳碱变性碱变性转移到转移到NC膜，高

23、温烘烤膜，高温烘烤与与DNA或或RNA探针探针杂交杂交放射自显影放射自显影Southern blotting hybridization 检测靶分子为检测靶分子为DNA,检测靶分检测靶分子是否含有目的基因。子是否含有目的基因。可用于可用于基因组基因的定性及定量分析、基因组基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切图谱分析、克隆基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。基因突变分析等。预杂交预杂交第35页/共49页Paper TowelsSouthern Blotting hybridizationtissueSDSProt KPhenolChloroSpin提取提取DNA限制性内切酶消化限制性内切酶消化琼

24、琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳碱变性、转移到碱变性、转移到NC膜膜与与DNA或或RNA探针探针杂交杂交放射自显影放射自显影第36页/共49页Prehyb/Hybridization/Rinses第37页/共49页 检测靶分子为检测靶分子为DNA,检测靶分子是否检测靶分子是否 含有目的基因。含有目的基因。DNA指纹图谱指纹图谱Southern印迹杂交的应用：印迹杂交的应用：第38页/共49页Northern blotting hybridization检测靶分子为检测靶分子为RNARNA极易被极易被RNase 降解降解RNA酶抑制剂酶抑制剂0.1%DEPC处理水处理水(焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯)第3

25、9页/共49页与与Southern blotting hybridization不同之处：不同之处：不需要限制性核酸内切酶酶切。不需要限制性核酸内切酶酶切。变变性性方方法法不不是是碱碱变变性性，而而是是采采用用聚聚乙乙二二醛醛和和二二甲甲基基亚亚砜砜、甲醛、甲基氢氧化汞等方法。甲醛、甲基氢氧化汞等方法。应用：应用：检测某一组织或细胞中已知的检测某一组织或细胞中已知的特异特异mRNA的表达水平的表达水平。比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。比较不同组织或细胞的同一基因的表达情况。Northern blotting hybridization第40页/共49页 pancreas kidney

26、skeletal liver lung placenta brain heartmuscleGEF mRNASouthern blotting hybridization第41页/共49页优点：优点：简单、迅速简单、迅速（直接点样）；（直接点样）；可在同一张膜上进行多个样品的检测；可在同一张膜上进行多个样品的检测；应用：应用：同一种样品经不同倍数的稀释同一种样品经不同倍数的稀释,可以得到可以得到半定量半定量的结果；的结果；核酸粗提样品的检测效果也较好。核酸粗提样品的检测效果也较好。Dot and slot blotting hybridization将变性后的将变性后的DNA或或RNA直接点样

27、与膜上直接点样与膜上第42页/共49页Reverse dot hybridization 直接将不同的探针点印并固定在膜上，再将待测直接将不同的探针点印并固定在膜上，再将待测的的DNA样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判样品与探针杂交，这样一次杂交反应就可以判断断DNA是否含有这些探针的同源序列。是否含有这些探针的同源序列。DNA chip第43页/共49页Colony or phage hybridization从重组从重组DNA文库中筛选阳性克隆文库中筛选阳性克隆第44页/共49页二、核酸原位杂交二、核酸原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）用

28、标记的已知核酸序列为探针，与细胞涂片或组织切片用标记的已知核酸序列为探针，与细胞涂片或组织切片 中核酸进行杂交检测的方法。中核酸进行杂交检测的方法。每张标本所用杂交液较少，每张标本所用杂交液较少，20100l，为了避免杂，为了避免杂 交交 液蒸发后造成杂交液浓缩，需使用密闭的湿盒。液蒸发后造成杂交液浓缩，需使用密闭的湿盒。在组织或细胞内进行在组织或细胞内进行DNA或或RNA精确定位和定量。精确定位和定量。第45页/共49页 探针与分裂中期染色体探针与分裂中期染色体DNA杂交，研究特定核酸序列杂交，研究特定核酸序列 在染色体中的精确定位；在染色体中的精确定位；探针与细胞内探针与细胞内RNA进行杂

29、交，观察该组织细胞中特定进行杂交，观察该组织细胞中特定 基因的表达水平；基因的表达水平；用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织细胞进用特异性的细菌、病毒的核酸作为探针对组织细胞进 行杂交，确定有无该行杂交，确定有无该病原体的感染病原体的感染。应用：应用：第46页/共49页 The result of FISHThe digoxigenin-labeled probe was visualized with anti-DIG-rhodamine（red）The biotin-labeled probe,with avidin-FITC（green）第47页/共49页核核 酸酸 杂杂 交交 分分

30、 类类 表表杂交方法杂交方法适适 用用 范范 围围Southern 印迹印迹检测经凝胶电泳分开的检测经凝胶电泳分开的DNA分子，需转印到膜上分子，需转印到膜上Northern 印迹印迹检测经凝胶电泳分开的检测经凝胶电泳分开的RNA分子，需转印到膜上分子，需转印到膜上斑点及狭缝印迹杂交斑点及狭缝印迹杂交检测未经分离的、固定在膜上的检测未经分离的、固定在膜上的DNA或或RNA分子分子菌落或噬菌斑杂交菌落或噬菌斑杂交检检测测固固定定在在膜膜上上的的、经经裂裂解解后后从从细细菌菌或或噬噬菌菌体体中中释释放放出的出的DNA分子分子原位杂交原位杂交检测细胞或组织中的检测细胞或组织中的DNA或或RNA分子分子第48页/共49页感谢您的观看。感谢您的观看。第49页/共49页