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1、荧光显微镜荧光显微镜Fluorescence microscopy 荧光显微镜是用来观察研究样品荧光现象的光学显微镜，目前主要由光源、滤片系统、光路系统等组成。广泛应用在生命科学领域，可对组织和细胞的结构、形态、蛋白质表达、亚细胞结构等进行定位、定性观察及分析。第1页/共45页荧光显微镜荧光显微镜仪器型号：OLYMPUS IX73 研究级倒置荧光显微镜Fluorescence microscopy参加过仪器使用培训，通过网上仪器知识考试，网上提前预约，管理员审核通过方可使用。注意事项：汞灯使用时尽量减少启动次数；灯熄灭后要等待冷却才能重新启动；点燃灯泡后不可立即关闭，以免水银蒸发不完全而损坏电
2、极，一般需要等15min 放置地点：401-1312室 管理员：吴安庆老师第2页/共45页显微镜参数1主机功能：系统具有明场、相差、微分干涉、荧光观察功能；2透射光光源：外置电源供应器100W卤素灯透射光照明装置；3物镜：长工作距离万能平场半复消色差相差（荧光）物镜：4（数值孔径N.A.0.13）、10（N.A.0.3），20（N.A.0.7）、40（N.A.0.6），60X（N.A.0.7）4物镜转盘：6孔以上编码型物镜转盘,与软件连接后能够保存物镜信息，随物镜转换能够自动校准标尺；5载物台：精确定位功能手动载物台；具备XY锁定和复位功能,可重现标本位置，游标尺的精度100m；6聚光镜：超长
3、工作距离万能聚光镜，孔位数5；第3页/共45页7荧光照明器：主机反射荧光系统可采用复眼照明技术，平均荧光视野亮度，便于量化分析；8.荧光光源：130W以上长寿命荧光光源,光导管传输，长度1.5米，符合RoHS 和WEEE法令要求；9.高通透性荧光激发块：紫外，BP340-390,DM410，BA420-IF 蓝色，BP460-495,DM505，BA510-IF 绿色，BP530-550,DM570，BA575-IF；10荧光激发块转盘：编码型荧光激发块转盘，7孔位设计，便于今后扩展应用,无需工具即可更换滤色镜组,与软件连接后能够随图片保存荧光滤色镜组信息；11滤色镜：透射用日光平衡滤色片、绿
4、色滤色片，荧光用减光片ND6/ND25；12DIC附件：40X、60X物镜配置微分干涉附件。显微镜参数第4页/共45页 基本原理基本原理激发滤镜：激发滤镜：从光源中分滤出一定波长范围的激发光。从光源中分滤出一定波长范围的激发光。（一般有紫外、蓝色和绿色激发滤片）（一般有紫外、蓝色和绿色激发滤片）带通滤色镜带通滤色镜(BP)BP)：有宽、窄带之分。如：有宽、窄带之分。如：BP450-490BP450-490 长、短通滤色镜组合长、短通滤色镜组合（LP LP+KPKP）：）：LP450+KP490LP450+KP490 双色镜：双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。双色分光镜；反射短波长，透
5、过长波长。阻断滤镜：阻断滤镜：吸收和阻挡激发光进入目镜；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。吸收和阻挡激发光进入目镜；选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。多为长通滤色镜；多为长通滤色镜；LP490LP490紫外蓝绿高压汞灯被荧光探针染色的生物样本激发被标记结构的荧光光学图像光学成像滤镜分光第5页/共45页标本制作要求 （一）载玻片载玻片厚度应在0.81.2mm之间，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激发光在标本上聚集。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。（二）盖玻片盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。（三）标本组织切片或其他标本不能太厚
6、，如太厚激发光大部分消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不充分激发。另外，细胞重迭或杂质掩盖，影响判断。（四）封裱剂封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.59.5时较亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/l pH9.09.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。（五）镜油一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用上述甘油代替。第6页/共45页荧光显微镜的不足荧光显微镜的不足:1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重荧光的同时采集及共定位。2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。3.荧光漂白及对细胞组织
7、的照射损伤。4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。5.只能在二维环境下观察。6.样品不能太厚。第7页/共45页激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜（LaserscanningConfocalMicroscopy，LSCM）以激光作为光源，采用光源针孔与检测针以激光作为光源，采用光源针孔与检测针孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以孔共轭聚焦技术，对样本进行断层扫描，以获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统获得高分辨率光学切片的荧光显微镜系统第8页/共45页共聚焦显微镜的类型点（慢）扫描共聚焦显微镜 分辨率高，图像清晰，采集图像速度慢线（狭缝）扫描共聚焦显微镜 分辨率低，速度快，噪音高转
8、盘式扫描共聚焦显微镜 性能介于上述两者之间第9页/共45页激光共聚焦扫描显微镜激光共聚焦扫描显微镜OLYMPUS FV1200 研究级倒置荧光显微镜 参加过仪器使用培训，通过网上仪器知识考试，网上提前预约，管理员审核通过方可使用。注意事项：1、开机和关机需要管理员来操作2、换样本的时候需要将物镜降下来，或点击软件上Escape3、能用普通荧光显微镜观察拍照的样本就不要用共聚焦显微镜，节约激光器寿命。放置地点：401-1312室管理员：吴安庆老师收费：200元/小时 第10页/共45页上转换共聚焦扫描显微镜上转换共聚焦扫描显微镜多线氩离子激光器(458 nm,488 nm,515 nm)半导体激
9、光器：405 nm,559 nm,635 nm上转换专用激光器：808 nm,980 nm活细胞CO2培养系统OLYMPUS FV1200放置地点：401-1111管理员：吴艳普通激光共聚焦显微镜的功能上转换材料的成像检测普通共聚焦：400元/小时上转换共聚焦：1000元/小时院内5折，校内8折只允许3天后15天内的预约第11页/共45页仪器参数仪器参数针孔光栏分光镜发射荧光单色器及检测器多线氩离子激光器(458 nm,488 nm,515 nm)半导体激光器：405 nm,559 nm,635 nm上转换专用激光器：808 nm,980 nm计算机图像存储与处理及控制系统IX83第12页/共
10、45页仪器参数仪器参数第13页/共45页仪器参数仪器参数第14页/共45页仪器参数仪器参数第15页/共45页基本原理基本原理第16页/共45页仪器特点 1、光源 用激光做光源，从理论上消除了色差。因为激光的单色性强、光源波束集中、波长相同。2、采用了共扼聚焦技术 在物镜的焦平面上放置了一个小孔，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差。第17页/共45页激光器扩光器样品滤光片针孔检测器入射光发射光长通滤光片仪器特点第18页/共45页入射光发射光长通滤光片激光器扩光器样品滤光片针孔检测器仪器特点第19页/共45页入射光发射光长通滤光片激光器扩光器样品滤光片针孔检测器仪器特点第20页/共45页3、点与
11、面扫描技术 共聚焦显微镜：将样品分解成二维或三维空间上的无数点，用十分细小的激光束（点光源）逐点逐行扫瞄、成像，通过计算机软件组合，最后得到一个整体平面的或立体的像。4、图像信号及处理：光电倍增管放大信号，计算机采集和处理光信号。仪器特点第21页/共45页更灵敏：共聚焦显微镜采用了光电倍增技术，可将很微弱的荧光信号放大。只要有信号就能被检测到。定位更精确：不仅可以定位到细胞水平，还可以定位到亚细胞水平、和分子水平。这也是荧光标记的抗体被称为分子探针的原因。光漂白和荧光淬灭作用小：由于利用光源光束点扫描，检测过程快，时间短，计算机精确控制激发光强度，光漂白和荧光淬灭作用很小。激光共聚焦显微镜的优
12、势激光共聚焦显微镜的优势第22页/共45页石蜡切片，冰冻切片，涂片，印片、铺片，培养的粘附细胞，悬浮细胞，各种染色，非染色荧光标记的组织（包括活组织）激光共聚焦显微镜的样本激光共聚焦显微镜的样本第23页/共45页共聚焦显微镜的应用共聚焦显微镜的应用1)高清晰成像2)半定量荧光强度分析3)荧光探针表达量测定4)分层扫描5)多种荧光标记同时检测第24页/共45页 1 1、高清晰成像激光共聚焦显微镜因使用共扼光路使非焦平面的光线被抑制，减少了成像的干扰，以及使用光色较纯的激光，所以成像分辨率可达普通光学显微镜的1.4倍。可以清晰的表现某些细微结构。第25页/共45页鼠成纤维细胞单克隆anti-tub
13、ulin标记 高清晰成像高清晰成像第26页/共45页涡虫纲扁虫肌动蛋白丝鬼笔环肽高清晰成像高清晰成像第27页/共45页培养的人肝癌细胞吖叮橙染色高清晰成像高清晰成像第28页/共45页 2 2、半定量荧光强度分析 荧光信号通过光电倍增管转化为电信号，经过电脑分析可对荧光信号进行相对定量测定。随机圈取细胞随机圈取细胞可得到所圈细胞的相对荧光强度值可得到所圈细胞的相对荧光强度值第29页/共45页利用荧光与透射光同时扫描，观测相等面积内不同组间荧光标记蛋白表达的差异。3 3、荧光标记表达量测定第30页/共45页 4 4、分层扫描（切片扫描）按共扼聚焦的原理，通过调节针孔的大小，可控制样品扫描层面的厚度
14、。即样品中相当薄的一层被探测到，而其他层面不影响成像。当观测较厚样品时，普通透射光不能透过样品，则可以通过切片扫描检测荧光的方法来观测。第31页/共45页 较厚层面 较薄层面 人血管内皮细胞PI标记观测损伤。标记细胞为损伤细胞。4 4、分层扫描（切片扫描）第32页/共45页连续分层扫描，可得到CT片类似的效果，对样品Z轴的结构进行分析。经计算机数据重组，可观测空间结构，空间定位，三维重组。4 4、分层扫描（切片扫描）第33页/共45页 5 5、多色荧光标记检测普通荧光显微镜每次只能观测一种荧光，要观测多种荧光标记的样品需要多次观测，对样品损伤大。激光共聚焦显微镜可以多激光多通道同时扫描，多通道
15、同时探测。绿色：SYBR 14染色，活精子红色：PI染色，死精子肺动脉内皮细胞蓝色：Hoechst 33342，染DNA红色：PI，染核仁RNA绿色：Alexa Fluor 488染肌丝蛋白第34页/共45页高速双转盘活细胞共聚焦成像系统高速双转盘活细胞共聚焦成像系统型号：UltraView VoX（PerkinElmer）放置地点：401-1310管理员：封琼收费：200元/小时 物镜：10X，20X，40X，60X(oil)，100X(oil)激光器：405nm，440nm，488nm，514nm，561nm，640nm载物台式活细胞培养装置：恒温、恒湿、5%CO2活细胞长时间观察：硬件防
16、漂系统图像分析平台：三维立体观测，三维定量分析第35页/共45页高速双转盘活细胞共聚焦成像系统高速双转盘活细胞共聚焦成像系统第36页/共45页速度更快速度更快灵敏度更高灵敏度更高光毒性更低光毒性更低实现活细胞实现活细胞3D6D（XYZTWP）实时成像）实时成像高速双转盘活细胞共聚焦成像系统高速双转盘活细胞共聚焦成像系统第37页/共45页l可实现多种荧光染料标记的活细胞和固定细胞/组织的共聚焦成像。l能够对活细胞或活体组织实施低光漂白、低光毒性的连续扫描，有助于长时间维持细胞的活性,适于观察细胞周期、细胞骨架动态等长时间或极度光敏感过程。l能够在高分辨率和高灵敏度的情形下，观察快速的生物过程，如
17、蛋白质的细胞膜输运和钙释放/钙闪过程。l能够完成三维、多荧光通道、多位点、长时程平行检测，适于复杂实验的多维图像采集【空间三维（xyz）、时间（t）、波长（w）、位置（p）】。高速双转盘活细胞共聚焦成像系统高速双转盘活细胞共聚焦成像系统第38页/共45页常用荧光探针介绍1.细胞活性探针2.细胞器探针3.细胞骨架探针4.核酸探针5.细胞内离子探针第39页/共45页细胞活性探针活细胞探针：吖叮橙（AO）是一种离子泵活性指示剂，弱碱性，在动物细胞溶酶体、植物液泡和含胰岛素的分泌小粒等酸性细胞器中浓集。死细胞探针：碘化丙锭（PI）膜不透性DNA探针，细胞膜破损后与DNA结合第40页/共45页细胞器探针
18、线粒体探针：罗丹明123（Rhodamine123），能渗入细胞，带阳离子的荧光探针，不染色内质网。溶酶体探针：中性红（Neutral Red）内质网探针：DiOC6属于短链碳酸花青苷染料。可标记活细胞内质网，也可用于甲醛固定的细胞内质网。第41页/共45页细胞骨架探针F-肌动蛋白荧光探针：鬼笔环肽：特异性地与F-肌动蛋白荧光探针结合，纳摩尔浓度下也可标记第42页/共45页核酸探针吖叮橙（AO）与DNA结合，发射波长525nm，显绿色与RNA结合，发射波长650nm，显红色Hoechst 与DNA结合，分辨率高DAPI 与双链DNA结合荧光增强20倍，与单链DNA结合无荧光增强。荧光强度比Hoechst低，光稳定性强于Hoechst。第43页/共45页谢谢 谢谢！第44页/共45页感谢您的观看！第45页/共45页