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1、一、实验目的与要求了解电泳技术的一般原理学习醋酸纤维素薄膜电泳操作技术测定人血清中各种蛋白质的相对百分含量第1页/共16页二、实验原理1.1.电泳电泳 是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现是指带电粒子在电场中向本身所带电荷相反的电极移动的现象。象。在一定在一定pHpH条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带条件下，不同的蛋白质由于具有不同的等电点而带不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速不同性质的电荷，因而在一定的电场中它们的移动方向和移动速度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离度也不同，即它们的电泳迁移率不同，因此，可使它们分离2.2.影响
2、电泳迁移率的因素：影响电泳迁移率的因素：内在因素：内在因素：蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状蛋白所带净电荷的量、蛋白的大小和形状 外界因素：外界因素：电场强度、溶液的电场强度、溶液的pHpH值、溶液的离子强度和电渗现象值、溶液的离子强度和电渗现象3.3.醋酸纤维素溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯醋酸纤维素溶于有机溶剂（如：丙酮、氯仿、氯乙烯、乙酸乙酯等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均等）后，涂抹成均匀的薄膜则成为醋酸纤维素薄膜。该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为一的泡沫状的结构，厚度约为120 120 mm，有很强的通透性，对分子，有很强的通透性，对分
3、子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附现象等优点对样品无拖尾和吸附现象等优点第2页/共16页4.4.经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5 5条区条区带，从正极端依次为清蛋白、带，从正极端依次为清蛋白、11球蛋白、球蛋白、22球蛋白、球蛋白、球球蛋白及蛋白及球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。第3页/共16页三、实验器材1.DYY-6C型双稳定时电泳仪和DYY-型电泳槽，均为北京市六一仪器厂生产2.
4、醋酸纤维薄膜（2cm8cm）3.培养皿：一排桌子公用5套，包括平衡、染色各用一套，漂洗用3套。4.点样器5.滤纸6.载玻片7.镊子8.玻棒第4页/共16页四、实验试剂l巴比妥巴比妥-巴比妥纳缓冲液，离子强度巴比妥纳缓冲液，离子强度0.06)0.06)l 称取巴比妥称取巴比妥(AR)(AR)和巴比妥纳和巴比妥纳(AR)(AR)，置于三角烧瓶中，置于三角烧瓶中，加蒸馏水约加蒸馏水约600ml600ml，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至，稍加热溶解，冷却后用蒸馏水定容至1000ml1000ml，置，置44保存，备用。保存，备用。2.2.血清蛋白染色血清蛋白染色(1)(1)染色液氨基黑染色液氨基黑10
5、B)10B)：称取氨基黑：称取氨基黑10B10B，加蒸馏水，加蒸馏水40ml40ml，甲，甲醇醇(AR)50ml(AR)50ml，冰乙酸，冰乙酸(AR)10ml(AR)10ml，混匀溶解后置具塞试剂瓶内，混匀溶解后置具塞试剂瓶内贮存。贮存。(2)(2)漂洗液：取漂洗液：取9595乙醇乙醇(AR)45ml(AR)45ml，冰乙酸，冰乙酸(AR)5ml(AR)5ml，和蒸馏，和蒸馏水水50ml50ml，混匀置具塞试剂瓶中贮存。，混匀置具塞试剂瓶中贮存。第5页/共16页五、测试材料五、测试材料未溶血的人或动物血清第6页/共16页电泳仪由电泳槽和稳压电源两部分组成，两者之间有专门电泳仪由电泳槽和稳压电
6、源两部分组成，两者之间有专门的连线连接。稳压电源用于调节电压和通电时间。当电泳槽的连线连接。稳压电源用于调节电压和通电时间。当电泳槽和稳压电源连接好后，将点好样的醋酸纤维薄膜搭在滤纸桥和稳压电源连接好后，将点好样的醋酸纤维薄膜搭在滤纸桥上，盖上盖子，通电，调整好电压，进行电泳。注意电泳槽上，盖上盖子，通电，调整好电压，进行电泳。注意电泳槽的电极方向，负极应与醋酸纤维薄膜上的点样原点在同一侧。的电极方向，负极应与醋酸纤维薄膜上的点样原点在同一侧。目前，该电泳仪已改进为数显式的目前，该电泳仪已改进为数显式的DYY-6CDYY-6C型。型。浸泡：将浸泡：将28 cm28 cm醋酸纤维薄膜迎着光辨别光
7、泽面和无光泽面。醋酸纤维薄膜迎着光辨别光泽面和无光泽面。在无光泽面距短边一端在无光泽面距短边一端1.5 cm1.5 cm处用铅笔轻轻画一条点样线，处用铅笔轻轻画一条点样线，将之置于盛有缓冲液的平皿中，浸泡将之置于盛有缓冲液的平皿中，浸泡30 min30 min方可用于点样。方可用于点样。点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余点样：用镊子取出浸透的薄膜，夹在两层粗滤纸内吸干多余的缓冲液，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。在另一的缓冲液，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。在另一 载玻片上滴一滴血清，点样器（用盖玻片的一边）在血清上载玻片上滴一滴血清，点样器（用盖玻片的一边）在血清
8、上蘸一下（可来回移动一次），再将点样器轻印在加样线上，蘸一下（可来回移动一次），再将点样器轻印在加样线上，使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线。使血清渗透到薄膜内，形成均匀的直线。操作指南：操作指南：第7页/共16页六、操作步骤六、操作步骤 1.1.醋酸纤维素薄膜的润湿与选择醋酸纤维素薄膜的润湿与选择 将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中约将醋酸纤维素薄膜完全浸泡于缓冲液中约30min30min后，每组取醋酸纤维素薄膜后，每组取醋酸纤维素薄膜1 1张，取张，取时用镊子夹住薄膜一端，放在折叠的滤纸中，并用它吸干表面液体。时用镊子夹住薄膜一端，放在折叠的滤纸中，并用它吸干表面液体。2.2.电泳槽的准备
9、电泳槽的准备 电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸或纱布的一头搭在横杆上，另一头浸为负极。每个槽上都有一根可移动的横杆，滤纸或纱布的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了滤纸桥。两杆之间的距离调节到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点入缓冲液中，形成了滤纸桥。两杆之间的距离调节到略小于醋酸纤维薄膜的长度，点好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。好样的醋酸纤维薄膜就搭在滤纸桥上。第8页/共16页第9页/共16页3.3.点样：点样：点样时，先将毛细血管插入血
10、清中，封住上端，在载玻片的一点样时，先将毛细血管插入血清中，封住上端，在载玻片的一端均匀涂过，使样品连续、均匀、适量，把载玻片在薄膜毛面上端均匀涂过，使样品连续、均匀、适量，把载玻片在薄膜毛面上轻而温和地印一下。点样区距阴极端处（见图）。此步是实验的轻而温和地印一下。点样区距阴极端处（见图）。此步是实验的关键。关键。醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）醋酸纤维素薄膜规格及点样位置示意图（虚线处为点样位置）第10页/共16页4.4.电电 泳泳 将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上
11、朝下），另一端平贴在阳极端支架上(见下图见下图)。要求薄膜紧贴滤。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂。纸桥并绷直，中间不能下垂。连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强连接好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，调节电流强度膜宽度（度膜宽度（2424片薄膜则为）。通电片薄膜则为）。通电5min5min后，调节电流强度膜宽度后，调节电流强度膜宽度（2424片薄膜则为片薄膜则为24mA24mA），电泳时间，电泳时间50min50min。电泳后，调节旋钮使。电泳后，调节旋钮使电流为零，关闭电泳仪切断电源。电流为零，关闭电泳仪切断电源。第11页/共16页5.5.染色：染色：电泳完毕后将薄
12、膜取下电泳完毕后将薄膜取下,放在含氨基黑放在含氨基黑10B10B染色液的培染色液的培养皿中浸泡养皿中浸泡5 min5 min6.6.漂洗：漂洗：将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直将薄膜从染色液中取出后移置漂洗液中漂洗数次，直至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电至背景蓝色脱尽，条带清晰为止，可得到色带清晰的电泳图谱泳图谱 。第12页/共16页7.7.记录和分析实验结果记录和分析实验结果漂洗完毕后将薄膜取出,放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在预习本上，并判断分析其结果。8.8.整理好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作整理
13、好桌面上的仪器和试剂，并注意清洁自己的操作台，请老师验收，实验报告当场交给老师。台，请老师验收，实验报告当场交给老师。第13页/共16页七、注意事项1 1、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。、薄膜的浸润与选膜是电泳成败的关键之一。2 2、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不、点样时，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，吸水量以不干不湿为宜。干不湿为宜。3 3、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。凹陷影响电泳区带分离效果。4 4、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多
14、或过少。、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。5 5、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。6 6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。第14页/共16页八、思考题1.1.根据人血清中血清蛋白各组分等电点，如何估计它们根据人血清中血清蛋白各组分等电点，如何估计它们在的巴比妥在的巴比妥-巴比妥纳电极缓冲液中移动的相对位置巴比妥纳电极缓冲液中移动的相对位置?2.2.简述醋酸纤维素薄膜电泳原理及优点。简述醋酸纤维素薄膜电泳原理及优点。3.3.电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？电泳图谱清晰的关键是什么？如何正确操作？第15页/共16页感谢您的观看！第16页/共16页