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1、精选学习资料 - - - - - - - - - 文件编号： SVP YF-0-01-00 验证文件* 微生物限度检查法验证方案* 有限责任公司名师归纳总结 - - - - - - -第 1 页,共 11 页精选学习资料 - - - - - - - - - 1/11验 证 文 件1适用范畴目录2 目的3 概述4 验证所需要的仪器设备及文件5 可接受的限度范畴标准6 测试方法7 反常情形处理8 测试结果9 结论10 再验证周期 11 附表名师归纳总结 - - - - - - -第 2 页,共 11 页精选学习资料 - - - - - - - - - 2/11验 证 文 件1 适用范畴本验证方案适
2、用于 * 2 目的微生物限度检查法的验证；建立该产品的微生物限度检查方法,并对其有效性进行评判, 确保试验方法的完整性,保证检验结果的牢靠性；3 概述3.1* 处方中含有盐酸氨基葡萄糖以及常用辅料等成分,文献报道盐酸氨基葡萄糖有抑菌活性；依据以上特点,按中国药典2022 年版附录 J 微生物限度检查法方法的“ 供试品的制备” 项下需用特别方法制备供试液中（6）制备供试液；“ 细菌,霉菌,酵母菌计数” 项下检查法2 薄膜过滤法进行细菌,霉菌及酵母菌的计数方法验证,掌握菌检查项下掌握菌的检查法验证；3.2 验证时间： * 批平行三次试验；4 验证所需要的仪器设备及文件4.1 验证需用仪器设备器具名
3、称规格型号检定日期检定单位有效期电热恒温培育箱HG101-3 多用生化培育箱SP-80 蒸汽灭菌器ZDX-35B 4.2 验证所需要的文件及存放地方资料名称 存放地点HG101-3电热恒温培育箱操作保护保养 SOPSP-80 型生化培育箱操作保护保养 SOPZDX-35B蒸汽灭菌器操作保护保养 SOP微生物限度检查法 SOP5 可接受的限度范畴标准名师归纳总结 5.1*微生物限度检查质量标准标准规定第 3 页,共 11 页项目细菌总数1000个/g 霉菌、酵母菌100 个/g - - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 3/11验 证 文 件大肠埃希菌 不得检出
4、5.2 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果判定在 3 次独立的平行试验中,稀释剂对比组的菌回收率应不低于 70%；如试验组的菌回收率均不低于 70%,照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌；如任一次试验中试验组的菌回收率低于 品的抑菌活性,并重新进行方法验证；5.3 掌握菌检查方法验证结果判定 如试验组检出试验菌（检出试验菌判定如下）70%,应采纳其他方法排除供试,按此供试液制备法和掌握菌检查法进行供试品的该掌握菌检查；如试验组未检出试验菌,应采纳其他方法排除供 试品的抑菌活性,并重新进行验证；5.4 大肠埃希菌检查结果判定 如 MUG阳性、靛基质阳性,判供试品检出大肠埃希菌
5、；如 MUG阴性、靛基质阴 性,判供试品未检出大肠埃希菌；如 MUG阳性、靛基质阴性,或 MUG阴性、靛基质 阳性,就应取胆盐乳糖培育基的培育物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯培育基 的平板上,培育 1824h；琼脂判供试品检出大肠埃希菌；如平板上无菌落生长、 或生长的菌落与下表所列的菌落形状特点不符,判定供 试品未检出大肠埃希菌；如平板上生长的菌落与下表所列的菌落形状特点相符或疑 似,应进行分别、纯化、染色镜检和相宜的生化试验,确认是否为大肠埃希菌；培育基 菌落形状紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明 曙红亚甲蓝琼脂 显暗色中心,圆形,稍凸起,边缘整齐,表面光滑,潮湿,常有
6、金 属光泽麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色,菌落中心呈深桃红色,圆形,扁平,边缘 整齐,表面光滑,潮湿6 测试方法 6.1 供试品*,批号 *；6.2 培育基及菌种 6.2.1 采纳符合中国药典规定的干燥培育基,中国药品生物制品检定所制；6.2.2 枯草芽孢杆菌 CMCCB 63501、金黄色葡萄球菌CMCCB 26003、大肠埃希菌名师归纳总结 - - - - - - -第 4 页,共 11 页精选学习资料 - - - - - - - - - 4/11验 证 文 件CMCC（B）44102、白色念珠菌 CMCC F 98001、 黑曲霉 CMCCF98003；6.3 菌液制备 6.3.1 细菌、霉
7、菌及酵母菌的检查的菌液制备 6.3.1.1 取新奇的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的培育物至养分肉汤培育基或养分琼脂培育基中,经 32.5 2.5 培育 1824h,用 0.9 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 50100cfu 的菌悬液,做活菌计数备用；6.3.1.2 取新奇的白色念珠菌的培育物至改良马丁培育基或改良马丁琼脂培育基中,经 25.5 2.5 培育 2448h,用 0.9 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 50100cfu 的菌悬液,做活菌计数备用；6.3.1.3取新奇的黑曲霉培育物接种至改良马丁琼脂斜面培育基,经 25.5 2.5 培育 57d,加入 35
8、ml 含 0.05%（ml/ml ）聚山梨酯 80 的 0.9 无菌氯化钠溶液,将霉菌孢子洗脱；然后吸出孢子悬液（用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管）至无菌试管内,用含0.05%（ml/ml ）聚山梨酯 80 的 0.9 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌数为 50100cfu 的菌悬液,做活菌计数备用；6.3.2 掌握菌的检查菌液的制备 取新奇的大肠埃希菌的培育物至养分肉汤培育基或养分琼脂培育基中,经 32.5 2.5 培育 1824h,用 0.9 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含细菌数约为 10100cfu 的菌悬液,做活菌计数备用；6.3.3 供试品制备 取供试品 10
9、g,加 pH7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液至 100ml,制成 1：10 的供 试液；6.4 验证试验方法 : 细菌、霉菌及酵母菌检验方法验证采纳上述供试品,进行 3 次平行试验,分别人工污染上述 供试品进行试验；5 种代表试验菌株；掌握菌检验方法验证采纳上述批6.4.1 细菌、霉菌及酵母菌的计数方法验证试验6.4.1.1 试验分组6.4.1.1.1 供试品对比组：取上述供试液 1ml,按菌落计数方法测定供试品本底细菌数；取上述供试液 1ml,按菌落计数方法测定供试品本底霉菌和酵母菌数；6.4.1.1.2 菌液组：分别取上述 5 种试验菌悬液 1ml,制备滤膜,按菌落计数方法测定所加的试
10、验名师归纳总结 - - - - - - -第 5 页,共 11 页精选学习资料 - - - - - - - - - 5/11验 证 文 件菌数；6.4.1.1.3 试验组：取 1：10 供试液 1ml,过滤,冲洗,分别在最终一次的冲洗液中加入大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌试验菌悬液各 其菌数；1ml,过滤,按薄膜过滤法测定取 1：10 供试液 1ml,过滤,冲洗,分别在最终一次的冲洗液中加入白色念珠菌和黑曲霉悬液各 1ml,过滤,按薄膜过滤法测定霉菌数；6.4.1.1.4 稀释剂对比组：取试验用的稀释液 1ml 代替供试品,加入试验菌,制备滤膜,按菌落计数方法测定所加的试验菌数；6.
11、4.1.2 验证试验操作6.4.1.2.1 取供试品 10g,加 pH7.0 无菌氯化钠 - 蛋白胨缓冲液至 100ml,制成 1：10 的供试液；取上述供试液 1ml,加至适量稀释剂中,混匀,过滤,用 pH7.0 的无菌氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗滤膜, 冲洗后取出滤膜,菌面朝上贴于养分琼脂培育基或玫瑰红钠琼脂培育基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培育基平板上培育；6.4.1.2.2 阴性对比试验取试验用的稀释液1ml,制备滤膜,滤膜菌面朝上贴于养分琼脂培育基或玫瑰红钠琼脂培育基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培育基平板上培育,每种培育基至少制 备一张滤膜,均不得有菌生长；6.4.1.2.3培育和计数细菌培育 3
12、 天,霉菌、酵母菌培育5 天,逐日观看菌落生长情形,点计菌落数,必要时,可适当延长培育时间至57 天进行菌落计数报告；菌落扩散生长成片的平板不宜计数；点计菌落数后,运算各稀释级供试液的平均菌 落数,按菌数报告规章报告菌数；如同稀释级别两个平板的菌落平均数不小于 15,就两个平板的菌落数不能相差 1 倍或以上；一般养分琼脂培育基用于细菌计数,玫瑰红钠培育基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培育基用于酵母菌计数；在特别情形下,如养分琼脂培育 基上长有霉菌和酵母菌,玫瑰红钠琼脂培育基上长有细菌,就应分别点计霉菌和酵 母菌,细菌菌落数；然后将养分琼脂上的霉菌和酵母菌或玫瑰红钠琼脂培育基上细
13、菌数与玫瑰红钠琼脂培育基上的霉菌和酵母菌或养分琼脂培育基上的细菌数进行 比较,以菌落数高的培育基中的菌落数为计数结果；名师归纳总结 6.4.1.3菌数报告规章第 6 页,共 11 页- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 6/11验 证 文 件以相当于 1g 供试品的菌落数报告菌数； 如滤膜上无菌落生长, 以1 报告菌数,或1 乘以稀释倍数的值报告菌落数；6.4.1.4 运算公式试 验组的菌回 收率 % 试验组平均菌落数供试品对比组平均菌落数 菌液组的平均菌落数 100% 6.4.2 掌握菌的检查验证试验6.4.2.1 试验分组6.2.2.1.1 试验组取
14、1：10 供试液 10ml,过滤,冲洗,在最终一次的冲洗液中加入大肠埃希菌试验菌悬液 1ml,过滤,滤膜接种至 6.2.2.1.2 供试品组100ml 的胆盐乳糖培育基中；取 1：10 供试液 10ml,制备滤膜,滤膜接种至 100ml 的胆盐乳糖培育基中；6.4.2.2 阳性对比试验取大肠埃希菌悬液 大肠埃希菌；6.4.2.3 阴性对比试验1ml,同供试品的掌握菌检查法检查；阳性对比试验应检出取稀释液 10ml,照相应掌握菌检查法检查, 作为阴性对比；阴性对比料无菌生长；6.4.2.4 大肠埃希菌的试验取供试液 10 ml（相当于供试品 1g）,制备滤膜,滤膜接种至适量（不少于 100ml）
15、的胆盐乳酸培育基中, 3035培育 1824 小时,必要时可延长至 48h；取上述培育物 0.2ml ,接种至含 5mlMUG培育基的试管中,培育,于 5h、24h 在366nm紫外线下观看,同时用未接种的 现荧光,为 MUG阳性；不出现荧光,为MUG培育基作为本底对比；如管内培育物呈 MUG阴性；观看后,沿培育管的管壁加入数滴靛基质试液,液面呈玫瑰红色,为靛基质阳性；呈试剂本色,为靛基质阴性；本 底对比料为 MUG阴性和靛基质阴性；7 反常情形处理严格依据微生物限度检查法SOP操作,如在检测中显现不符合要求的情形出现,分析问题缘由后, 打算是否需对本方案中设定的*的微生物限度检查方法进行修改
16、,并重新进行验证；8 测试结果名师归纳总结 - - - - - - -第 7 页,共 11 页精选学习资料 - - - - - - - - - 7/11验 证 文 件8.1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果见附表 1；8.2 掌握菌的检查方法验证结果见附表 2；8.3 按确定的验证方法检验三批产品微生物限度检查结果见附表 3；9 结论9.1 依据 * 检验操作规程,我们设定了该产品的微生物限度检验方法,对* 批* 进行了微生物方法学验证,结果各项指标 标准规定,证明该标准操作规程 检验需要, GMP 要求,使用；9.2 通过 * 的检验,各项指标的回收率均大于 70%,说明 * 用薄膜过滤法
17、检验无抑菌性,故适用于 * 的微生物的检验；确定 * 微生物限度检查法如下：质量负责人：审核人：检验人10 再验证周期10.1*的处方发生变动或其它因素变更导致*的物料性质转变时,需要对本方案进行调整后作方法学再验证；10.2 国家相关微生物限度检查标准修改后需要对本方法重新进行再验证；11 附表名师归纳总结 - - - - - - -第 8 页,共 11 页精选学习资料 - - - - - - - - - 8/11验 证 文 件附表 1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证结果试验试验大肠埃希菌金黄色枯草芽孢白色念珠菌黑曲霉菌分类次数葡萄球菌杆菌1 试验组 2 3 1 菌液组 2 3 1 稀释剂对
18、比组 2 3 供试品 对比组供试品 对比组供试品 对比组阴性对比组阴性对比组 阴性对比组稀释剂对比 组菌回收率试验组的 菌回收率1 2 3 1 2 3 2 2 3 1 2 3 结果判定备注：* 验证一批平行三次,批号：* 结论：依据 * 微生物限度检查法验证方案检验,结果试验日期：报告日期：检 验 人：复 核 人：质量部 QA: 统计日期：附表 2：掌握菌检查方法的验证结果名师归纳总结 - - - - - - -第 9 页,共 11 页精选学习资料 - - - - - - - - - 9/11验 证 文 件品名：批号：试验次数项目BL 增菌液MUG 靛基质检查结果结果判定供试品第一次试验组 阳性对比阴性对比供试品其次次试验组 阳性对比阴性对比供试品第三次试验组 阳性对比阴性对比名师归纳总结 检 验 人：复 核 人：第 10 页,共 11 页质量部 QA: 统计日期：- - - - - - -精选学习资料 - - - - - - - - - 10/11验 证 文 件附表 3：按确定的验证方法检验三批产品微生物限度检查结果品名：名师归纳总结 项目细菌数霉菌和酵母菌数大肠埃希菌第 11 页,共 11 页批号检 验 人：cfu/g cfu/g cfu/g cfu/g cfu/g cfu/g 复 核 人：质量部 QA: 统计日期：- - - - - - -