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1、.实验内容 实验 1 MDA（丙二醛）含量测定所需试剂：10三氯乙酸（TCA（纯）0.25%硫代巴妥酸（纯）实验 2：可溶性蛋白含量测定所需试剂：考马斯亮蓝 G-250 95%乙醇 85%磷酸 实验 3:SOD 超氧化物歧化酶）酶活性测定所需试剂：dl-甲硫氨酸（Met）NBT EDTA-Na2 核黄素 实验 4:CAT（过氧化氢酶）活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：PBS（PH=7.0）30%H2O2 实验五：Apx（抗坏血酸过氧化物酶）活性（即 ASA POD 活性）测定所需试剂：ASA（分子量 167.12）（乙=胺四乙酸=钠）EDTA Na2 PBS（pH7.0）30%H2O 实验 6:
2、ASA（维生素 C）含量测定 偏磷酸 95%乙醇 磷酸 4%2,2-二联吡啶 FeCI3（或 FeCI3 6H2O 实验 7:GSH 谷胱甘肽，媚力肽 GSH GSH 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物）含量测 定所需试剂：NaH2PO4 2H2O DTNB（二硫代硝基苯甲酸）PBS（PH6.8）实验 8：脯氨酸测定所需试剂：磺基水杨酸 甲苯 茚三酮 冰乙酸 85%磷酸 试验 9：叶绿素含量测定。80%丙酮 试验 9:GR 活性测定 试验 10：过氧化氢含量测定。三氯乙酸 试验 11：超氧阴离子含量测定 二酶液和母液提取 1.酶液提取所需试剂：50mmol/L 磷酸缓冲液（PH=
3、7.8）（内含 1%（m/v）聚乙烯吡哆烷酮 PVF）,0.1mmol/L EDTANa或 EDTA，也可为（内含 2%（m/v）PVP）,0.2mmoI/L EDTA Na 2 或 EDTA）（先配制后用缓 冲液定容）2.ASA.GSH 母液提取所需试剂：5%偏磷酸 1抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT：1g（根据样品的量，少的可以适当减少）叶片加入预冷 5ml.50mmoI/L 磷酸缓冲液（PH=7.8）4C冷冻 15000g 离心 20 分钟 上清液即为酶液（5C下保存一两天内备用，中短期用-20 C保存）2.ASA.GSH 母液提取：0.1g 叶片加入 3ml 预冷 5%偏磷酸溶
4、液 4C冷冻 14000g 离心 10 分钟 上清液即为母液（5C下保存备用）（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护 ASA）酶液提取所需试剂：PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：1%（1g 溶于 100ml 水），1000ml 需称取 10g，此处用 PBS EDTA-NQ:0.1mmol/L（37.2mg EDTA-Na 2溶于 1000ml 蒸馏水），此处用 PBS PBS（缓冲液）配制方法：Na2HPO4 12H2O NafP04 2H2O 取71.64g，蒸馏水定容至 1L,取31.21g 定容至 1L,放置 4C冰箱备用 PH=7.8 取 91.5ml+8.5ml=100ml（浓度 0.2mol/L
5、）需要 0.05mol/L T将上述溶液烯释至 400ml（0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）母液提取所需试剂：5%偏磷酸：称 5g 纯偏磷酸，定容至 100 ml 蒸馏水（需加热溶解，温度在 50-60 C）偏磷酸有剧毒（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）（现所用为 38%HPO 所以需称 65.7895g，定容至 500ml）三.实验步骤 实验 1:MDA 含量测定 1.1 所需试剂：10%三氯乙酸（TCA）（纯）称 10g 定容至 100ml 0.25%硫代巴妥酸（纯）称 0.25g 用 10%TCA 定容至 100ml（配制时，可一次
6、完成，先配 TCA 不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌 器上微热）1.2 步骤：取 0.3g 叶片，加 4ml 磷酸缓冲液研磨，加入 4ml 0.25%的硫代巴比妥酸（溶于 10%的三氯乙酸）溶液 J摇匀 95 C加热 15 分钟 J快速冷却 3000g 离心 15 分钟 取上清测定 OD532,OD600,OD）值 按公式求 MDA 浓度=6.45 X（ODB2-OC6OO）-0.56OD 450（卩 mol/L）可溶性糖浓度=11.71 x OD50（mmol/L）3 最后计算 MDA 含量（卩 mol/g FW）=4 x（MDA 浓度 x）x 10-/0.1
7、 同时，可测得可溶性糖含量（m mol/g FW）=4 x（可溶性糖浓度x）x 10-/0.1（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）注意：以 0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零 MDA 含量测定的改进 1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定 MDA 含量，用量可以定为 1.0、1.5 或 2.0（较好）ml。2.硫代巴妥酸溶液改为 0.5%的硫代巴比妥酸（溶于 20%的三氯乙酸）溶液。实验 2:可溶性蛋白含量（参照 Bradford 方法测定），以 BSA 作为标准蛋白（牛血清蛋白）2.1 所需试剂及配制：牛血清蛋白（BSA,考马斯亮蓝 G-25
8、0,95%乙醇，85%磷酸 考马斯亮蓝 G-250 蛋白染色剂的配制：称取 100mg 考马斯亮蓝 G-250,溶于 50ml 95%乙醇，加入 100ml 85%的磷酸，最后蒸馏水定容到 1L,混匀，放置过夜，过滤后贮放在棕色瓶中，常温下可放置一个月。标准曲线制作：标准溶液配制：称取 10mg 牛血清蛋白标准液，溶于蒸馏水，定容至 100ml，制成 100 卩 g/ml 的标准液,4C下保存备用。（必须是牛血清蛋白向水中溶解，不能颠倒）取 6 支具塞试管（10ml）,按下表配制含 0-100 卩 g/ml 的牛血清蛋白液各 1ml（调零管）1 2 3 4 5 6 蛋白标准液（ml）0 0.2
9、 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水（ml）1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白含量（卩 g）0 20 40 60 80 100 甲硫氨酸（Met）5ml,然后依次加入核黄素和酶液,dl-甲硫氨酸（Met）39mmol/L 1.1638g/200ml NBT 0.225mmol/L（0.01840 克”100ml 0.0368g/200ml EDTA-Na 0.6mmol/L 0.0223g/100ml 核黄素 0.012mmol/L 0.0045g/L 或 0.0045g/100ml 用时稀释 50mmol/L PBS 配置 10 倍 PH=7.8 各试剂溶液均在用前配置，配
10、置好后均应避光保存，尤其是核黄素，必须随用随配，避光保存。各试管加入 5ml G-250 染色剂，翻转混合，放置 2 分钟，595nm 比色，绘制过原点标准曲线（方 程式）。（相关系数要两个 9 以上）2.2 步骤：标准曲线（参考邹琦）（595nm 比色）注意：制作通过原点的标准曲线，以含 0 卩 g 蛋白质液调零 取 0.1g 样品，加 5ml 蒸馏水提取，5000g 离心 10 分钟，取上清 1ml 测定 1ml 样液+5ml G-250 液盖塞翻转混合数次，最后 595nm 比色，直接从标准曲线读含量。（此方法反应十分迅速，2 分钟即达到平衡，其结合物在室温下 1 小时内保持稳定）实验
11、3:SOD 酶活性 3.1 步骤:1.取 50 卩 l 酶液 加入 2ml 39m mol/L 2ml 0.225m mol/L NBT,（氮蓝四唑）1ml 0.6m mol/L EDTA-Na 2（可以配制在一个试剂瓶里）1ml 0.012m mol/L 核黄素，摇匀。（现配现用）2.（人工培养箱内）4000L x日光灯下放置 30 分钟后，温度控制在 30C，于暗处终止反应。（用大烧杯套着小烧杯，将试管放在同心圆内，每隔 5min 转过 90 度，转四次。对照（不加酶液）每次至 少对称地放 3 支，调零的不照光和不加酶液）3.560nm 处测吸光值，酶活性以抑制 NBT 光反应 50%为一
12、个酶活单位表示。（实验中可将除酶液和核黄素外其它试剂按比例混合好后，一次加入 以不加酶液的照光管为对照。）3.2 所需试剂:试验进行时一次性加 5ml 的反应混合液配置方法:Met+NBT+EDTA-Na 2 200mll+200ml+100ml SOD 酶测定时，酶液量 50 卩 l 偏少，改为 100 卩 l 为佳，另外反应时间 30 分钟过长，改为 20 分钟适合。SOD 活性（酶单位 u/gFW）=（A0-A1）*V/A0*0.5*FW*a A0-对照照光管光吸收值；A1-样品管光吸收值。V-样液总体积（ml）5ml FW-鲜重（g）1g a-测定用样品的量（ml）0.1ml 实验 4
13、:CAT 活性（过氧化氢酶）4.1 所需试剂：PBS（PH=7.0）50mmol/L（61 份 50mmol/l Na 2HPO 39 份 50mmol/l NaH 2PO）15mmol/L H 2Q（以 30%HQ 配）（取 85.2 卩 L 30%H2Q，以 50mmol/L PBS（PH 7.0）定容至 100ml）4.2 步骤：1.3ml 50mmol/L PBS（PH7.0）加入 50 卩 l 酶液（加比色杯的盖子摇 2-3 下，让酶液与缓冲液充分分散）再加入 5 卩 l 15 mmol/L H 2Q 摇匀（加比色杯的盖子摇 2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）。2.240nm 处作时
14、间扫描（每 0.5 分钟测 1 次，共测 3 分钟）3.CAT 活性以每分钟消耗 1 卩 mol 的 HQ 为一个酶活单位。活性计算改动：（以每分钟 OD 值减少 0.01 为一个酶活单位 u）（2005 和 2006 年均是按 OD 值减少 0.01 算 的）（以每分钟 OD 值减少 0.1 为一个酶活单位 u）注意：以 PBS 作空白调零 50mmol/L 实验 5:APX 活性（抗坏血酸过氧化物酶）（即 ASA-POD 舌性）5.1 所需试剂：ASA（分子量 167.12）0.3m mol=0.052836（g）（乙=胺四乙酸=钠）EDTA-Nst（以 PBS 配成 0.1m mol/L
15、=0.0372（g）/L）50m mol/L PBS（pH7.0）9m mol/L H 2Q（以 30%HQ 配制）（51 卩 l 30%H2Q 定容至 100ml）计算为：K1=2.8,K2=3,K3=-1,K4=100 可得到总取样（5ml 酶液或 1g 样）的最终活性。酶活性单位为卩 mol/g（鲜重）min 以后 APX 活性测定可参考沈文飚：抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨 3 ml 反应液中含 50 mmol/L PBS,pH7.0,0.1 mmol/L EDTA（或 EDTA-Na2）,0.1 mmol/L H2Q2 0.5（或 0.3）mmol/L AsA，最后加入适量酶液（2
16、0、50、100ul 均可）启动反应，连续记录测定室温下 290 nm 吸 收值的变化。以不加 H2Q2 作为对照，H2Q2 本身对 AsA 的氧化作用在测定时间内由于吸收值变化太小可忽 略不计。室温下每分钟氧化 1 umolAsA 的酶量作为一个酶活性单位（U）（吸光系数为 2.8 mmol/L cm）5.2 步骤：1.配反应液（50m mol/L PBS（pH7.0），内含 0.1m mol/L EDTA Na2,含 0.3m mol/L ASA）2.样品池加入 3ml 反应液，加入 50 卩 l 酶液，最后加入 5 卩 l 9mmol/L H2Q2（盖上比色杯的盖子摇匀，23 次）在 2
17、90nm 处作时间扫描，每 10 秒测一次，共测 30 秒。（注意：在测定中消光值应该是不断减小的）3.根据 QG9。值变化，计算单位时间内 AsA 消耗量，（ASA 氧化消耗量按消光系数 2.8mmol/L cm。），酶活 性以单位时间每消耗 1mol 的 ASA 为一个酶活单位，最后计算样品的 APX 活性（单位为：U/g（鲜重）-min）。（活性计算改动）根据 QD290 值变化，计算单位时间内 AsA 减少量（ASA 氧化量按消光系 2.8mmol/L cm）,并计算样品 APX 终活性。酶活性单位为1 mol/g（鲜重）min 实验 6 ASA 含量测定 6.1 步骤：1.取样品母液
18、 0.2ml,1.4ml,75mmol/l NaH2PQ4 溶液（pH 值 7.4）（2.34g NaH2PQ4 2H2Q 定容至 200ml,用 NaQH将 pH 调至 7.4）混合；（75mmol/l NaH2PQ4 溶液亦可用 150mmol/l NaH2PQ4 溶液稀释 1 倍得到）2.依次加入（1）10%偏磷酸（26.3158g 38%偏磷酸定容至 100ml）0.4ml;（2）44%磷酸（26ml 85%磷酸+41ml 蒸馏水）0.4ml;（3）4%2,2-二联吡啶（称取 4.0 g 2,2-二联吡啶用 70%酒精定容至 100ml）0.4ml;70%酒精配制（95%乙醇 70 份
19、重量+蒸馏水 25 份重量）3%FeCI3 0.2ml（称取 5.0g FeCI3 6H2Q 定容至 100ml），摇匀，于 37C保温 1.0h（5）测 525nm 波长下 的光吸收值 4.以标准曲线方程计算 ASA 含量 6.2 标准曲线的制作：（1）称取 10mg ASA 分析纯，以 5%偏磷酸定容至100ml,成 100 微克/毫升的标准液；（2）按下表取 8 支试管，按照表中的程序加液 试管编号 1 1 2 3 4 5 6 7 8 标准液（ml）0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12 0.14 5%偏磷 酸（ml）0.20 0.18 0.16 0.14 0.1
20、2 0.10 0.08 0.06 ASA 含量（微克）0 2 4 6 8 10 12 14 按前面步骤 1、2 所述依次加入各反应液，最后测 525nm 波长下的光吸收值，作过原点标准曲线，求线性 方程。实验 7:GSH 含量测定 7.1 步骤：1.取样品母液 0.2ml，加入 150 mmol/L NaH2PO4 溶液（pH7.7）（11.70g NaH2PO4 2H2O 定容至 500ml 用 氢氧化钠调 pH 至 7.7）2.6ml 2.混匀再加入 0.2ml DTNB 溶液（=硫代硝基苯甲酸 DTNB75.3mg 溶于 30ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液 pH6.8）摇匀。实际配置
21、时，称 75.3 X 2=150.6mg，即 0.1506g DTNB 溶于 60ml PBS 中 3.在 30C保温 5 分钟，测定 412nm 波长下的光吸收值。【有些文献（如龚吉蕊、於丙军）方法同样用 DTNE 显色，都是在常温下显色 30 分钟 因此可将反应时间 适当延长至 10 分钟】7.2 根据标准曲线（GSH 方程，计算 GSH 含量。标准曲线制作：1.称取 100mg GSH 分析纯，以 5%偏磷酸定容至 100ml，成 1mg/ml 即 1000ug/ml 的标准液。2.参照实验 6 标液方法。试管编号 1 2 3 4 5 6 7 8 标准液（ml）0 0.02 0.04 0
22、.06 0.08 0.10 0.12 0.14 5%偏磷 酸（ml）0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08 0.06 GSH（微 克）X 0 2 4 6 8 10 12 14 正确 GSH 含量（微 克）0 20 40 60 80 100 120 140 3.以 GSH 含量为 0 的溶液调零，制作过原点标准曲线（及方程）所需试剂：NaH2PO4（150m mol/L 称 23.41g NaH2PO4 2H2O 定容至 1L（或称 5.85 定容至 250ml）DTNB（二硫代硝基苯甲酸）0.1mol/L PBS（PH6.8）（参照邹琦的书 实验&脯氨酸测定 8.
23、1 步骤：1.取 0.5g 叶片，用 5ml 3%磺基水扬酸溶液提取，匀浆液在沸水浴浸提 10 分钟，冷却后，以 3000g 离心 10 分钟，上清液待测。2.取 2ml 待测液，加入 2ml 蒸馏水，再加入 2ml 冰乙酸和 4ml 2.5%茚三酮溶液，置沸水溶显色 60min，冷 却后，加入 4ml 甲苯充分振荡提取红色物后，静置后，取甲苯相（将移液枪的量程调至 3.0ml 吸取甲苯相，注意不要将枪伸到水相中。）测定 520nm 波长处的吸收值，依据标准曲线计算含量。8.2 标准曲线制作：1.标准液配制；准确称取 25mg 脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至 250ml，其浓度为 100 卩 g
24、/ml，再取 10 ml 此液，蒸馏水定容至 100ml，即为 10 卩 g ml-1 的脯氨酸标准液。（脯氨酸标准液最好现用现配，放在冰箱 也易变性）2.取 7 支 20ml 具塞试管按下表加入各试剂 1 2 3 4 5 6 7 标准脯氨酸（ml 0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0 H2O(ml)2 1.8 1.6 1.2 0.8 0.4 0 冰乙酸（ml）2 2 2 2 2 2 2 显色液（ml）4 4 4 4 4 4 4 0 的试 2004 脯含量（ug）0 2 4 8 12 16 20 3%磺基水杨酸(ml 2 2 2 2 2 2 2 3.置沸水浴中显色 60min。冷
25、却后（以后步骤同前）依据测定值绘制造原点标准曲线（以脯含量为 管作空白调零）为方程。8.3 所需试剂：3%磺基水杨酸水溶液（称 3g 磺基水杨酸，蒸馏水定容至 100ml）甲苯 85%磷酸 冰乙酸 2.5%酸性茚三酮显色液 称取 2.5g 茚三酮，加入 60ml 冰乙酸和 40ml 6.0mol/L 磷酸。贮于棕色瓶，4C 下 23 日有效。实际配置时，需称 10g，配制 400ml（其中冰乙酸 240ml，磷酸 160ml 6mol/L 磷酸液（40.8ml 85%磷酸定 容至 100ml）实际配制时 81.6ml 定容至 200ml（68ml 85%磷酸定容至 1 升，为 1mol/L 的
26、磷酸液）实验 9 过氧化氢（HbQ）含量测定方法：参考以下文献：张 峰,杨颖丽,何文亮等：盐胁迫过程中抗坏血酸对植物的保护功能。西北植物学报 龚吉蕊等：干旱胁迫下几种荒漠植物植物抗氧化能力的比较研究。西北植物学报 2004 9.1 步骤：取 0.5g 叶片，加入预冷 3%的三氯乙酸（TCA）研磨,12000g 离心 20min,取 1mL 上清加入等体积 10mmol/l 磷酸缓冲液，pH7.0,和 2mL1mol/L 的 KI,摇匀,390nm 测吸光值.结果以 ng g-1;Fw G 表示 L 用溶 3%的三氯乙酸的 H2O2,50200 ng/mL,作标准曲线 实验 10 超氧阴离子测定方法：