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1、Western blot基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的 PBS 洗一遍，加入的 RIPA 裂解液（含 1mM PMSF(100)，每10ml 加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔 150-250l，60mm15mm 培养皿300-400l，），于冰上裂解约 5 分钟，裂解总液 12000rpm 离心 10 min。取上清，用 BCA 法测定蛋白浓度。用于 western blot 的蛋白样品取一定量加 4loading buffer，10reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将 EP 管于沸水中煮 5min，变性，之后再离心后准备
2、上样。二、BCA 法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成 5mg/ml 的蛋白标准溶液，10l 分装，-20冷冻保存。完全溶解蛋白标准品，取 10l 用 PBS 稀释至 100l，使终浓度为 ml。据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA 工作液室温 24 小时内稳定。将标准品按 0,1,2,4,8,12,16,20l 加到 96 孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到 20l。加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS到20l。各孔加入 100l BCA 工作液
3、，37放置 30 分钟。测定 580nm 条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。三、Western blot 基本操作步骤 1、溶液配制：Runnig Buffer(1)：SDS Runnig Buffer（20）50mL，加 MiliQ 水至 1L；Transfer Buffer(1):Transfer Buffer(10)100mL,甲醇 200mL（20%，v/v），加 MiliQ 水至 1L；TBST 缓冲液 1M TrisHCl（）：60.5g Tris-base，加入约 30ml 浓盐酸，调 PH 至，加 MiliQ 水至 500ml。TBS 缓冲液（10）：1M TrisHC
4、l 100ml+80g NaCl 加 MiliQ 水 1L TBST 缓冲液（1）：TBS 缓冲液（10）100ml+Tween-20（%，v/v），加 MiliQ 水至 1L。封闭液：5%BSA（5g/100ml，称取 1g BSA 至 20ml TBST，充分混匀溶解）2、样品准备与加样 用 4SDS loading buffer,10reducing 与蛋白质样品混合，并将此 EP 管放在水浴锅中沸水煮 5min，使蛋白质变性。将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满 Runnig Buffer(1)，内槽加入抗氧化剂，小心拔下梳子；向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量 20g 以
5、上）。向 marker 孔中加入 l marker（按照实验要求设定 marker 量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。3、电泳 将电泳装置与电源连接。调节电压为 100-200V，电泳 50min，直至溴酚兰接近分离胶的底部，然后关闭电源并撤去连接的导线。拆除电泳装置：先倒掉电泳缓冲液，连同槽一起将凝胶夹层取出，小心的撬起凝胶外层塑料板，使凝胶暴露出来，切去浓缩胶以及无蛋白样品的凝胶部分（将胶留在短的一面塑料板上）。4、转膜（湿转）将转膜液（1
6、Transfer Buffer）放于大饭盒内，泡 4 片海绵，剪 4 片滤纸、1 片 PVDF 膜，PVDF 膜于甲醇中活化 30s，取出置于转膜液中；按照 2 层海绵+2 层滤纸+胶+膜+2 层滤纸+5 层海绵（填满）的顺序组装转膜装置，注意组装此装置时一定要保证滤纸、膜、凝胶精确对齐并不留气泡；将组装好的装置放入电转槽，合上盖子，电转槽置于冰浴，接通电源，调节电压为 15V，时间为 1618h（或恒流 300mA,3h）。显示红灯亮后，按下 Start 后，开始转膜。转膜方向为蛋白从负极（黑色）转向正极（红色）。5、免疫印迹反应及化学发光检测 转膜完毕后，根据目的蛋白分子量将膜剪成不同的条带，用封闭液（5%BSA）室温封闭 2h。弃封闭液，加入用新的封闭液稀释的一抗（可回收），室温 2h 或 4过夜。用 TBST清洗 3 次，10min/次。二抗（可回收）室温孵育 1 小时，室温 1xTBST 洗涤 3 次，每次约 10 min。此步开始避光操作：将膜浸入化学发光底物工作液（A 液：B 液=1:1，终体积即可）中，显色 2 分钟，放入 BIO-RAD 凝胶成像系统中显影。内参分子量：-actin：42 kDa GAPDH：36 kDa Tubulin:51kDa