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1、Thermo Scientific DharmaconsiRNA 产品特性产品特性臧有霞Helen ZangBioscience DivisionThermo Fisher ScientificThermo Fisher Scientific 公司简介公司简介The world leader in serving science?150年历史?年销售额105亿美金?全球34,000员工?全球350,000客户?遍布150个国家?分析仪器设备?分析试剂耗材?软件?客户服务等领域的领导者Biosciences Division Cell Culture Hyclone Genomics Dharm
2、acon Abgene Open Biosystems Finnzymes Fermentas Proteomics Pierce ABR antibodies Cellomics ChemicalDharmacon RNAi TechnologyRNA合成的世界领先者合成的世界领先者高效干扰高效干扰siRNA的设计者的设计者siRNA干扰文库的倡导者干扰文库的倡导者RNAi基因组文库的发明者基因组文库的发明者与世界顶级研究机构的合作者与世界顶级研究机构的合作者通过特定化学修饰提高干扰效率的革新者通过特定化学修饰提高干扰效率的革新者最全面的生物信息学算法和最多干扰参数的拥有者最全面的生物信息学
3、算法和最多干扰参数的拥有者RNAi技术领域专利技术和知识产权最大的持有者技术领域专利技术和知识产权最大的持有者应用应用Dharmacon技术在世界顶级杂志发表高水平文章最多的参与者技术在世界顶级杂志发表高水平文章最多的参与者5内容 简介RNAi Thermo Scientific Dharmacon siRNA产品特性 Thermo Scientific Dharmacon siRNA产品简介6RNAi发展历史回顾Flies:RNAi1998Kennerdell et al.1998.Cell 95:1017Hammond et al.2000.Nature 404:293Zamore et
4、al.2000.Cell 101:25Mammals:RNAi2001Elbashir et al.(2001)Nature 411:494Fungi:quelling1992Romano(1992)Mol Micro 6:3343Plants:co-suppression1990Napoli et al.1990.Plant Cell 2:279Worms:RNAi1998Fire et al.(1998)Nature 391:8067Nature(1998)391:806Adapted from Zamore(2002)Science,296:1265-1269.RNAi 的发现Craig
5、 C.Mello(UMass)Andrew Z.Fire(StanfordU)The Nobel Prize in Physiology or Medicine 20068siRNA的结构Sense strandAnti-sense strandCore region of the siRNA(19 nucleotides long)Overhang(2 nucleotides long)9RNAi 机制mRNAmRNAmRNA10miRNAsiRNA?RNAi过程借用了天然的miRNA作用途径?miRNA 可以降解mRNA或抑制mRNA翻译成蛋白质RNAi 机制11内容 简介RNAi The
6、rmo Scientific Dharmacon siRNA产品特性 保证siRNA功能性的策略 保证siRNA特异性的策略 Thermo Scientific Dharmacon siRNA产品简介12Thermo Scientific Dharmacon保证siRNA功能性的三大策略 生物信息学：SMARTselection 设计技术设计技术 混合技术：SMARTpool技术技术 化学修饰：ON-TARGETplus 化学修饰技术化学修饰技术13随机设计传统设计理性设计理性设计随机选取不考虑位点信息脱靶效应严重GC含量含量避开起始100bpAA（N19）TT参数有限，大量筛选BLAST检索
7、检索.SMARTselectionTM大量序列热动力学参数生物信息分析独特的独特的具有最小脱靶脱靶效应效应的功能性功能性siRNA序列设计序列设计：SMARTselectionTM技术14only 20%of randomly selected siRNAs knock-down target with efficiency 90%and higher020406080100120随机设计Activity of Randomly Selected siRNAs15SMARTselectionTM技术 A bias towards low internal stability at the se
8、nse strand 3-terminus Lack of inverted repeats Overall G/C content of siRNA molecule Base preferences at specific positionsNature Biotechnology(2004)22:326-33001020304050607080901000123456789108 compound algorithm score Silencing efficiency8 parameter algorithm 与基因沉默效果相关的siRNA特性提出siRNA设计经典的8大参数！16Pu
9、blished Algorithm 8 Criteria important for Functionality Demonstration of Rational Design Concept01020304050607080901000123456789108 compound algorithm score Silencing efficiency8 parameter algorithm 0102030405060708090100020406080100SMART scoreSilencing efficiency(median of 10)8+parameter algorithm
10、 Advanced SMARTselection design Additional parameters Target sequences avoidedknown SNPshighly redundant sequenceshighly homologous sequencesSMARTselectionTM技术我们应用更多的参数为您设计高功能性的我们应用更多的参数为您设计高功能性的siRNA！17SMARTpool 技术SMARTpoolTechnology针对同一mRNA的不同区域设计4条不同的siRNA18SMARTpool 技术:保证siRNA的高功能性Target mRNAAAA
11、AA19SMARTselectionTMSMARTpoolON-TARGETplusTM高功能的siRNA保证siRNA功能性20siRNA 功能性 vs.特异性功能性和特异性是两个不同的方面:功能性指的是一种siRNA沉默其靶基因的能力如：1号siRNA将基因X的表达敲低了80%特异性指的是一种siRNA能够沉默多少种基因（非靶基因）的表达如：1号siRNA沉默了基因X的表达，但是也同时将其它非靶基因（ABCD)的表达沉默了Strictly Company Confidential21RNAi实验相关的特异性和非特异性效应siRNARNAi-related(off-targeting)Lip
12、id/siRNAUnrelated to RNAiLipidBackgroundRNATrue gene knockdown signature22Adapted from Jackson et al.,(2003)Nature Biotechnology,21:635-638.功能性检测脱靶能力检测功能性 特异性功能性 特异性0.20.80.60.401.0Fraction MAPK14 remainingproteinRNA高功能性的siRNA并非都是特异的23 分析了分析了 300 随机设计的随机设计的siRNA 其靶基因均对细胞生存无影响其靶基因均对细胞生存无影响分析条件均为已达到最优
13、化结果：分析条件均为已达到最优化结果：25%显示出对细胞生存的显示出对细胞生存的“毒性毒性”功能功能02040608010012011121314151617181910204060801001201112131415161718191101111121131141151161171181191201211221231241251261271281291大约大约25%siRNA产生了 错误的表型推断产生了 错误的表型推断(导致细胞死亡功能表型导致细胞死亡功能表型)Adapted from Fedorov et al.,(2006)RNA,12:1188脱靶效应导致实验中的错误表型24脱靶效应:
14、潜在的毒性 不一致的表型(假阳性)所有的siRNA均能够有效的敲低同一基因表达（80%）脱靶效应导致实验中的错误表型表型？25必须增强siRNA特异性针对脱靶效应产生的原因，采用有效的技术手段，增强siRNA的特异性，消除脱靶效应，在siRNA的应用中是至关重要的。脱靶效应导致可以检测到的生物学效应，产生假阳性，干扰实 验结果。严重的阻碍了siRNA在研究和治疗中的应用。脱靶效应的危害性阻碍siRNA应用的瓶颈降低脱靶效应siRNA应用的重中之重26增强特异性的策略 生物信息学生物信息学:SMARTselection 设计技术设计技术 链偏好性链偏好性 Seed region区 过滤区 过滤
15、Seed 频率性分析频率性分析 化学修饰化学修饰:ON-TARGETplus 化学修饰技术化学修饰技术 混合技术：混合技术：SMARTpool 技术技术27链偏好性（Strand bias）siRNA 是对称的，RISC 对双链处理程序相同。如果反义链与 RISC结合:因为反义链与靶mRNA是互补的，所以会找到正确的靶基因进行敲低。如果正义链与 RISC结合:因为正义链同样有可能能够结合某些mRNA（非靶mRNA），所以正义链结合后引起的基因沉默导致了脱靶效应。28链偏好性:定向的siRNA结合过程Strand bias:使 RISC只结合siRNA的反义链。如何做到?如果RNA双链的末端GC
16、含量较高，则不利于RISC解链。设计标准:反义链的5 端多利用A/U,3 端多利用G/C29链偏好性：利用链偏好性进行设计 防止正义链进入RISC，导致脱靶效应的方法是:好的设计否:采用 ON-TARGET修饰Functional siRNAs and miRNAs Exhibit Strand BiasKhvorova A,et al.Cell(2003)115:209-216SMARTselectionTM设计包括链偏好性参数:在保证功能性的前提下，是否能在反义链的5 端多利用A/U,3 端多利用G/C？30AAAAAAAAtarget mRNA53355-UTR3-UTRAUGUAAse
17、ed regionORFNature(2005)433:769miRNA 能够下调多个靶基因的表达miRNA生物信息学Seed region miRNA 通过Seed region与 mRNA 3UTR 相互作用 在反义链的 2-7 或 2-8 区 也称为六聚体或七聚体区 miRNA不需要与靶mRNA完全互补Lim LP et al.(2005)Nature 433:76931Birmingham A et al.(2006)Nature Methods 3:199-204解释siRNA引起脱靶效应的第一个模型Seed Region 会导致脱靶效应！生物信息学32生物信息学:seed 频率与频
18、率与siRNA 特异性的关系Experimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificityAnderson E,et al.RNA 2008 14:853-861Thermo Fisher Scientific是第一个在实验中证明是第一个在实验中证明 seed 区的频率与脱靶效应相关区的频率与脱靶效应相关在设计中考虑到在设计中考虑到seed区对区对siRNA特异性的影响。特异性的影响。33生物信息学:Seed region 过滤及频率分析Birmingham A et al.
19、(2006)Nature Methods 3:199-204.We eliminate siRNA designs with seeds that are 100%conserved in human,mouse,and rat miRNAsExperimental validation of the importance of seed complement frequency to siRNA specificityAnderson E et al.(2008)RNA 14:853-861We give preference to siRNA designs with low-freque
20、ncy seeds减少脱靶效应最全面的生物信息学设计策略减少脱靶效应最全面的生物信息学设计策略3UTR seed matches,but not overall identity,are associated with RNAi off-targets34增强特异性的策略 生物信息学：生物信息学：SMARTselection 设计技术设计技术 链偏好性 Seed region区 过滤 Seed 频率性分析 化学修饰化学修饰:ON-TARGETplus 化学修饰技术化学修饰技术 混合技术：混合技术：SMARTpool 技术技术35Inactivation of sense(passenger)s
21、trandPreferential loading of antisense(guide)strandON-TARGETplus 化学修饰1.1.失活正义链siRNA pathway On-target silencingmiRNA-like pathway Off-target silencing via seed-region activity使正义链不发挥作用（化学修饰）36 单独失活正义链并没有达到理想效果单独失活正义链是一种不完美的策略#Off-Target GenesON-TARGETplus 化学修饰1.失活正义链没有解决 反义链 seed region引起的相互作用促使反义链与
22、 RISC 结合，增加反义链引起的脱靶现象37ON-TARGETplus 化学修饰2.反义链修饰(seed-region 修饰)miRNA-like pathway Off-target silencingsiRNA pathwayOn-target silencingSeed-region 修饰增强反义链的特异性反义链的Seed-region 修饰针对双链作用机制采取双链解决方案针对双链作用机制采取双链解决方案失活正义链38ON-TARGETplus 化学修饰技术：双链修饰策略！ON-TARGETplus 化学修饰使功能性和特异性融为一体！正义链的失活结合反义链的化学修饰是最好的策略！减少了
23、miRNA-like seed region 相互作用 增强针对靶基因的特异性#Off-Target Genes39增强特异性的策略 生物信息学：生物信息学：SMARTselection 设计技术设计技术 链偏好性 Seed region区 过滤 Seed 频率性分析 化学修饰化学修饰:ON-TARGETplus 修饰修饰 混合技术：混合技术：SMARTpool技术技术40SMARTpool 技术脱靶效应:浓度依赖型 降低siRNA的浓度会减少脱靶效应，但是也会降低靶基因的敲低效果。如何降低如何降低siRNA的浓度但同时还保持其敲低基因的能力呢的浓度但同时还保持其敲低基因的能力呢?41coll
24、aboration with Agilent TechnologiestargetOFF-targetssiRNA1siRNA2siRNA3siRNA4poolduplicates at 100 nM eachTarget mRNAAAAAASMARTpool:增强特异性且保持功能性SMARTpool技术:既降低单条siRNA的浓度又保持强大的基因敲低能力的唯一解决方案！SMARTpool技术:既降低单条siRNA的浓度又保持强大的基因敲低能力的唯一解决方案！42SMARTpool siRNAs:最小化脱靶效应 敲低效果保持的很好，同时脱靶基因数目没有增加！Pooling 减少了脱靶效应，将每
25、一种siRNA的实际浓度降至约单独使用的1/4。43SMARTpool 技术SMARTpoolTechnology减少每种 siRNA 的有效浓度以减少脱靶效应。针对同一mRNA的更多区域以提高沉默效率。44将OTP化学修饰与 SMARTpool结合：最高的特异性 化学修饰:ON-TARGET plus 修饰技术针对单条siRNA的双链进行操作，减少脱靶性，保持敲低活性。Pooling:SMARTpool 技术针对siRNA的实际应用方式进行操作，减少脱靶性，保持敲低活性。45 Functional siRNAs and miRNAs Exhibit Strand Bias Rational
26、siRNA design for RNA Interference 3UTR seed matches,but not overall identity,are associated with RNAi off-targets Position-specific chemical modification of siRNAreduces“off-target”transcript silencing Off-target effects by siRNA can induce toxic phenotype Different delivery methodsdifferent express
27、ion profiles A protocol for designing siRNAs with highfunctionality and specificity Induction of the interferon response by siRNA iscell type-and duplex length-dependant The contributions of dsRNA structure to Dicerspecificity and efficiencyFunctionalityNon-specific effectsSpecificityThermo Scientif
28、ic Dharmacon:对 RNAi 研究领域的革新与贡献46目前使用Dharmacon siRNA产品在世界顶级杂志上发表的文章 Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs.Soutschek J.,et al.Nature,2004 Synthetic lethal screen identification of chemosensitizer loci in cancer cells.Whitehurst A.,et al.Nature,2007 O
29、rchestration of the DNA-Damage Response by the RNF8 UbiquitinLigase.Kolas N.,et al.Science,2007 Identification of Host Proteins Required for HIV Infection Through a Functional Genomic Screen.Brass A.,et al.Science,2008 RNA interference screen for human genes associated with West Nile virus infection
30、.Krishnan M.,et al.Nature,2008 Opposing microRNA families regulate selfrenewalin mouse embryonic stem cells.Melton C.,et al.Nature,2010 47Thermo Scientific Dharmacon siRNA产品简介 siRNA产品siRNA 产品类型 siGENOME siRNA ON-TARGETplus siRNA Accell siRNAsiRNA 产品形式：Set of 4,SMARTpool,Set of 4 upgrade,individual 转
31、染试剂 DharmaFECT1，2，3，4 DharmaFECT Duo：用于siRNA和质粒共转染48细胞培养 RNAi QPCR 表型分析选择高效siRNA转 染选择高效siRNA转 染基因沉默检测沉默后表型分析基因沉默检测沉默后表型分析siGENOMESMARTpoolOn Target Plus SMARTpoolDharmaFECT转染试剂转染试剂Accell SMARTpoolsiRNAsQPCR产品产品Pierce Western BlotCellomics Hit KitsBioapplicationsArrayScanBioimage RedistributionAssayssiRNA表型Thermo Scientific提供全套产品Thank you!