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1、微生物降解有机磷农药的研究进展摘要 大量研究表明利用微生物对环境中有机磷农药的净化处理是行之有效的。文章将从有机磷农药降解菌的分离、基因工程菌的构建以及降解机理等几个方面阐述微生物降解有机磷农药的研究进展，并概括了微生物降解有机磷农药的几个主要的研究方向。揭示了微生物降解有机磷农药的途径，该成果对控制和消除有机磷农药的污染，促进农业丰收将起到积极作用。关键词 有机磷农药 降解 微生物 基因工程菌1 引言有机磷农药（Organophosphates,简称OPS）一直是国内外广泛生产和使用的农药产品，其产品已达上百种。国内广泛使用的约有30 种，其中80% 以上是剧毒农药如甲胺磷、甲基对硫磷、对硫
2、磷、久效磷、敌敌畏等。有机磷农药的广泛使用无疑大大促进了农业生产，但同时该类农药的大量生产和使用，造成了严重的环境污染，已经危及到人们的生存以及可持续发展。而且导致农产品农药残留超标，引发食品安全问题而制约我国的农产品出口。因此迫切需要建立一种有效方法用于治理环境污染以及去除农产品的农药残留。大量研究表明微生物对环境中有机磷农药的降解起到重要作用，利用微生物及其产生的降解酶对环境中有机磷农药的净化处理是行之有效的，并显示出良好的应用前景。本文将从有机磷农药降解菌的分离、基因工程菌的构建以及降解机理等几个方面简述近年来国内外利用微生物降解有机磷农药的研究。,2 有机磷农药高效降解菌株的筛选获取有
3、机磷农药有效降解菌的主要途径是从受该有机磷农药污染的土壤、水体底泥或者生产车间的排水道、污水处理厂出口的污泥等受污染的环境介质中筛选、驯化、富集和分离鉴定。从土壤中采样一般取525cm 处的土样，以秋季采样最为理想。几十年来，优良菌株已经被不断地从受农药污染的土壤和水体中筛选出来，微生物对有机磷农药的降解作用早已受到人们关注。20世纪70 年代初就已经证明黄杆菌（Flavobacterium sp.）ATCC27551有降解乙基对硫磷的生物活性。王倩如等报道了蜡样芽孢杆菌和嗜中温假单胞菌对甲胺磷农药废水的降解。李淑彬等发现假单胞菌能高效降解有机磷农药甲胺磷。王永杰等分离到1株可广谱降解有机磷农
4、药的芽孢杆菌并研究了不动菌属对有机磷农药乐果的降解。在真菌对有机磷农药的降解方面研究相对较少。刘玉焕和李树彬分别报道了曲霉菌对乐果和甲胺磷的降解作用。其它还有木霉菌、链格孢菌等。2.1 降解有机磷农药的微生物种类目前筛选到的有机磷农药降解高效菌主要有细菌、真菌、藻类。常用农药与其所对应的降解菌种类如下：马拉硫磷：假单胞菌属、黄杆菌属、节细菌属、极瘤细菌属、木霉属、曲霉属甲胺磷：假单胞菌属、芽孢杆菌、曲霉属、青霉属、黑曲霉、酵母属甲拌磷：假单胞菌属、硫杆菌属、小球绿藻属对硫磷：芽孢杆菌属、黄单胞杆菌属、固氮极毛杆菌属、短杆菌属、假单胞菌属、黄杆菌属、极瘤细菌属、青霉属、木霉属、曲霉属、小球绿藻属
5、甲基对硫磷：短杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、黄杆菌属苯硫磷：芽孢杆菌属敌敌畏：假单胞菌属、木霉属甲胺磷：蜡样芽孢杆属、嗜中温假单胞菌地虫磷：根霉属、青霉属敌百虫：青霉属一般而言，解磷真菌在数量上远不及解磷细菌，从同一土壤上分离出来的解磷细菌可以是解磷真菌的几倍、几十倍、甚至上百倍。但解磷真菌的解磷能力要强于细菌，且许多解磷细菌遗传性状不稳定，在多次传代培养后容易失去解磷功能，而真菌解磷性状一般较稳定，不易失去解磷功能。2.2 环境中降解有机磷农药的微生物分布解磷菌分布表现出较强的根际效应（ 根际土壤数量比非根际高的多，但不是根际微生物的优势菌落）。林启美报道小麦和玉米根际土壤解磷菌数量要比非
6、根际高12个数量级。但不同土壤，不同作物根际，解磷菌种群分布存在一定的差异。有人发现东北的黑钙土中芽胞杆菌和假单胞菌占优势，而黄棕壤和红壤中解磷菌种类繁多。夏玉米收获时期根际有机磷细菌主要是假单胞杆菌和黄杆菌属。杨小蓉等发现土壤中氧乐果降解菌占细菌总数百分比上，秋季降解菌株所占百分比最大，在降解菌株中芽孢杆菌属在每一季节所占的比例都是最大的。总体而言，芽孢杆菌属是耕地土壤的主要有机磷细菌，但林地和菜地土壤则主要是假单胞菌属，有机磷细菌数量比无机磷细菌多。菜地土壤解磷细菌的数量和种类最多，而农田土壤中解磷细菌最少，但农田土壤中解磷细菌占细菌总数的比例并不低，尤其是分解有机磷的细菌，占细菌总数达到
7、13%。林地土壤尽管有机质质量分数很高，但解磷细菌并不多。3 有机磷农药降解菌的基因工程研究微生物对污染物特别是难降解污染物的降解能力所限，构建高效的基因工程菌可以显著提高污染物的降解效率。环境微生物尤其是细菌中的污染物降解基因、降解途径等许多污染物降解机制的阐明为构建具有高效降解性能的污染物降解基因工程菌提供了可能。微生物育种手段主要包括诱变育种、原生质体融合和基因工程等。3.1 诱变育种诱变育种方法带有很大盲目性，基因变异的程度也有限，并且筛选工作量大，因而其成功率较低，所以在污染物高效降解工程菌的研制中应用很少。王永杰等对有机磷农药降解菌地衣芽孢杆菌（Bacilluslichenifor
8、mis）进行了紫外诱变的研究，突变株对甲胺磷的降解率比出发菌株提高了将近10%。现在的育种方法以原生质体融合技术和基因工程技术为主，它们定向较为准确，效率高。3.2 原生质体融合育种原生质体融合育种技术已成为基础分子生物学研究和微生物育种的一种有效方法。原生质体融合又称体细胞杂交，它具有遗传信息传递量大，不受亲缘关系的影响，可有目的地选择亲株以选育理想的融合株，便于操作等优点，在遗传育种中具有广阔的应用前景。穆国俊等将具有杀虫活性的苏云金芽孢杆菌(Bt-3701 与具有解磷活性的巨大芽孢杆菌Bm-107进行了原生质体融合，获地了既具有一定的杀虫活性又具有一定的解磷活性的融合子。王永杰等采用原生
9、质体转化的方法，进行了有机磷农药甲胺磷、敌敌畏、对硫磷降解菌（ 受体菌）地衣芽孢杆菌P12 原生质体的形成、再生及转化（ 有机磷农药乐果Dm降解菌DNA）条件的研究，并成功的获得一株多功能遗传工程菌株。3.3 基因工程育种研究表明，许多农药降解基因存在于微生物质粒上，同时它也是其它降解基因存在的地方。综合运用生物化学和微生物遗传育种的现代技术手段，利用降解性质粒的各种特性，完成多质粒新菌株的构建以及降解性质粒DNA 和染色体DNA 的体外重组，构建出来的工程菌降解效率高，底物范围广，表达稳定，比自然环境中的降解性微生物更具竞争力。Mark Shimazu 等以Moraxella sp.为载体，
10、导人opd基因获得可同时降解有机磷和降解p一硝基酚(PNP)的基因工程菌。用它为载体比使用大肠杆菌为载体细胞的活力约高出70%，在10h 内可快速降解底物。也有人将降解酶基因克隆到大肠杆菌中，有机磷降解性能得以高效表达。闫艳春等用抗性库蚊酯酶基因，引人原核表达载体质粒pRL439转化大肠杆菌HB101细胞并获得表达。经对重组菌进行细胞固定化后，降解有机磷农药对硫磷（1605）的反应时间短、降解效率高。黄菁等用反转录聚合酶链反应（RT-PCR）进行了解毒酶酯酶B1基因的克隆及在大肠杆菌中融合表达研究，得到的解毒酶具有较高降解有机磷酸酯类农药的能力，为利用真核生物的自然资源进行农药污染的生物治理等
11、提供了新途径。基因工程菌用于污染物处理的研究成果令人鼓舞，具很大的发展潜力，但它的应用研究尚停留在实验室水平，真正投入污染物处理的还很少，而且基因工程菌在实际应用中存在一些问题，比如育种技术问题、应用的安全性和有效性问题等。虽然这些技术的应用还不完美，但随着生物工程技术的发展，基因工程菌在生物降解中的应用会进一步完善，为人类造福。4 微生物降解有机磷农药的机理测定微生物是否具有解磷能力的方法较多，这里列出 种较常用的方法：平板法、液体培养法、土壤培养法。平板法是一种简单而方便的定性检测磷细菌的方法，采用这种方法将解磷菌在含有有机磷的固体培养基上培养，测定菌落周围产生溶磷圈的大小。而液体培养法测
12、定培养液中可溶性磷的含量，土壤培养法测定土壤中有效磷含量。目前微生物降解有机磷农药的途径已经研究得比较清楚，有机磷农药通常含有P-O键和P-S键，有些有机磷农药（ 如甲胺磷）还含有P-N 键。细菌对有机磷农药的降解一般是通过水解酶类和转移酶类的作用进行的，主要作用于农药分子的P-O- 烷基，P-O- 芳基，O=P-NH2，=C-NH2，使有机磷农药被降解。Angelica MB等也证实氯代过氧物酶可以切断有机磷农药中的P-S键。阮少江等推测甲胺磷的微生物降解是甲胺脱氢酶打断P-N键开始的。微生物对有机磷农药的降解机理目前仅发现与培养介质的酸度提高和有机酸的产生有关，并且还有不少矛盾的数据。林启
13、美等发现不同的微生物分泌有机酸的数量和种类差别很大，真菌分泌的有机酸种类比细菌要多。但是，培养液中有机酸总量与解磷量之间并不存在显著的相关性。赵小蓉等的研究表明，微生物的解磷量与培养液中pH 存在一定的相关性，但同时也发现培养介质pH 值的下降，并不是解磷的必要条件，还有待于进一步研究。5 结论现代生物技术和基因工程技术的发展极大地促进了微生物降解有机磷农药的研究，已经成为当今环境生物技术的研究热点。有关研究在不断深入，微生物对有机磷农药降解的研究在进一步深化，因此有机磷农药的生产和使用所造成的环境污染等问题将会得到更好的解决办法。展望未来，微生物降解有机磷农药的研究主要有如下几个研究方向：其
14、一，开发和利用有机磷农药高效降解菌，建立高效降解菌的种子库。其二，在识别降解酶基因的基础上，对降解酶基因进行克隆与表达，构建工程菌、提高降解能力，制备降解酶；其三，研究有机磷农药微生物降解机理、代谢途径。参考文献1Sethunathan N.Yoshida T.A Flavobacterium sp. That degrades diazinon and paeathion.Can J Microbiol,1973.19.873-8752 王倩如等. 甲胺磷农药废水生化处理高效菌选育的研究J.化工环保，1995.15（4）。202-2103李淑彬等.降解甲胺磷农药高效菌株的筛选J. 湘潭师范学
15、院学报，1998.19(3).60-64;4王永杰等.有机磷农药广谱活性降解菌的分离及其生理特性研究J.南京大学学报，1998.22(2).42-45 5刘玉焕等. 曲霉L8对有机磷农药乐果的降解作用J.上海环境科学，1998.17(8).20-216林启美等. 小麦根际与非根际解磷细菌的分布J. 华北农学报，2001.16(1).111-1157杨小蓉. 农田生态系统有机磷农药氧乐果降解菌的生态学研究D. 四川师范大学，20028王永杰等. 有机磷农药降解菌的紫外诱变育种J. 应用与环境生物学报，1999.5(6).635-637学 院：化工学院班 级：07级制药工程二班姓 名：肖 义学 号：2007650526