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1、研究生实验技术系列讲座(一)细胞培养的相关问题Cell Culture（3）季明春2008-11-301、如何选择细胞培养基？有几点建议可供参考：(1）建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞首选的培养基。可以查阅参考文献，或在购买细胞株时咨询。(2)其它实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。(3)根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选 RPMI1640。(4)用多种培养基培养目的细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。1、如何选用细胞培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条
2、件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总的，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。2、培养基保存于4C 冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性。怎么办？怎么办？培养基保存于4 C 冰箱中，培养基内的CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中的酸碱指示剂(通常为phenol red)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱的结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的pH值（确
3、定松开瓶口以保证气体交换）。3、为什么培养基中可以省去加酚红？3、为什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中用作pH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。4、培养基中是否必须添加抗生素？4、培养基中是否必须添加抗生素？除于在特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，培养基中不应添加任何抗生素。5、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？5、培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养
4、中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。6、何谓FBS,FCS,CS,HS?6、何谓FBS,FCS,CS,HS?FBS(fetal bovine serum)和FCS(fetal calf serum)是相同的意思，两者都是指胎牛血清。CS(calf serum)则是指小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。7、培养基中添加了血清和抗生素后，、培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗？可长期保存吗？一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。8、保
5、存血清最好的方法?建议血清应保存在-4至-2O。若存放于4时，请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。9、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，9、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理?该如何处理?血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白的一)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的原因。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心400g稍微离心上清液即可。最好不使用过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能
6、会阻塞过滤膜。10、有必要做血清热灭活吗?实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量!11、如何避免血清沉淀物的产生?11、如何避免血清沉淀物的产生?建议在使用血清的时
7、候，注意下列的操作:(1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-20至4至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20至37)，非常容易产生沉淀物。(2)解冻血清时，请随时将的摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。(3)请勿将血清置于37太久。若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。(5)若必须做血清的热灭活，请遵守56，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。12、CO2培养箱的水盘如何保持清洁？12、CO2
8、培养箱的水盘如何保持清洁？1、定期(至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换。2、硫酸铜溶液。13、培养细胞时应使用5%或10%CO2？13、培养细胞时应使用5%或10%CO2？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为pH 的缓冲系统，而培养基中NaHCO3的含量将决定细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10%CO2；当培养基中NaHCO3为每公升1.5 g 时，则应使用5%CO2培养细胞。14、Hanks 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hanks 平衡盐溶液(HBS)和Earl
9、es平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的pH值。Eagles液在空气水平的CO2中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。15、如何用台盼兰计数活细胞？用无血清培养基把细胞悬液稀释到2002000个/毫升，在0.1毫升细胞悬液中加0.1毫升0.4的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细
10、胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色细胞是死细胞。16、何谓细胞“一代”？所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。17、细胞株（Cell strain）17、细胞株（Cell strain）和细胞系（Cell Line）和细胞系（Cell Line）的区别 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称的为有限细胞系（Fini
11、te Cell Line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。永生性无限细胞系 致瘤性恶性转化细胞系细胞系的命名无严格统一规定 对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解，举以下几种代表性的细胞名称供参考：HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3：美国国立卫生研究所（National Inst
12、itute of Health）建立；每3天传代，每次接种3105细胞毫升。18、欲将一般动物细胞离心下来，18、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞，其离心速率一般为300 xg(约1,000rpm)，5-10 分钟。过高的转速，将造成细胞死亡。19、冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，须立即放入37 C 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染。冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管的爆裂。20、细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除DMSO？20、细胞冷冻管解冻培养时，是否
13、应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻的后，应直接放入含有10-15ml新鲜培养基的培养瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。21、细胞冷冻培养基的成份如何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO(dimethyl sulfoxide)和90-95%原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合的。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。22、冷冻保存细胞的方法？冷冻保存方法一:冷冻管置于4 C 306
14、0 分钟(-20 C30 分钟*)-80 C 1618 小时(或隔夜)液氮槽vaporphase 长期储存。冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降1-3 C 至80 C 以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 C 不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80C 冰箱中，仅存活率稍微降低一些。23、细胞欲冷冻保存时，23、细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。2
15、4、应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染的血清和污染的细胞等。严格的无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好的细胞来源和培养基配制是减低污染的最好方法。25、如果细胞发生微生物污染时，25、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？应如何处理？原则上：直接灭菌后丢弃的。当重要的培养细胞污染时，研究者可能试图消除或控制污染。1、确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。2、消除培养污染的实验26、确定抗生素毒性水平、确定抗生素毒性水
16、平和消除培养污染的实验和消除培养污染的实验1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。2.分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。3.每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。4.确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度23倍浓度的抗生素的培养液培养细胞23代。5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。6.重复步骤4。7.在无抗生素的培养基中培养46代，确定污染是否以已被消除。27、支原体(mycoplasma)污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？27、支原体(mycoplasma)污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？不能。除极有经验的专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨的。28、支原体污染会对细胞培养有何影响？28、支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞的生长参数，代谢及研究的任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果的数据方有意义。29、细胞株有支原体污染时，29、细胞株有支原体污染时，该如何处理？该如何处理？直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。