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1、第四节第四节 梭菌（梭菌（Clostridium）检查法检查法 梭梭菌菌属属有有130个个种种，多多数数为为腐腐生生菌菌，约约有有25-30种种能能引引起起人人和和动动物物致致病病。这这些些致致病病菌菌能能分分泌泌外外毒毒素素和和侵侵袭袭性性酶酶类类。临临床床上上的的致致病病性性梭梭菌菌主主要要有有破破伤伤风风梭梭菌菌、肉肉毒毒梭梭菌、产气荚膜梭菌等。菌、产气荚膜梭菌等。一、梭菌概述一、梭菌概述梭状芽孢杆菌病梭状芽孢杆菌病疾病疾病病菌病菌主要型别主要型别外毒素外毒素破伤风破伤风破伤风梭菌破伤风梭菌破伤风痉挛毒素破伤风痉挛毒素肉毒中毒肉毒中毒婴儿肉毒中毒婴儿肉毒中毒肉毒梭菌肉毒梭菌ABE；FG少
2、见少见神经毒素（乙酰胆碱神经毒素（乙酰胆碱阻滞）阻滞）食物中毒食物中毒产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌A（变异性）（变异性）肠毒素肠毒素抗生素相关性结肠炎抗生素相关性结肠炎艰难梭菌艰难梭菌细胞毒素（细胞毒素（B）肠毒素（肠毒素（A）坏死性小肠炎坏死性小肠炎产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌C毒素毒素组织毒性感染：组织毒性感染：子宫、子宫、伤口感染（肌炎，肌伤口感染（肌炎，肌肉坏死，厌氧性蜂窝肉坏死，厌氧性蜂窝组织炎）组织炎）产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌诺维梭菌诺维梭菌败毒梭菌败毒梭菌溶组织梭菌溶组织梭菌谲诈梭菌谲诈梭菌双酶梭菌双酶梭菌A-EA-DA卵磷脂酶，蛋白酶，卵磷脂酶，蛋白酶，胶原酶，纤维蛋白溶胶原酶，纤维蛋
3、白溶酶，脱氧核糖核酸酶，酶，脱氧核糖核酸酶，杀白细胞素杀白细胞素局部化脓性感染局部化脓性感染多数菌种多数菌种可能不明显可能不明显（一）梭菌形态特征（一）梭菌形态特征Morphological properties 粗大芽孢杆菌，粗大芽孢杆菌，（0.4-0.4-1.21.2）m m (3-8)m(3-8)m，杆状或稍弯杆状或稍弯曲，单独存在或呈短链状排列。曲，单独存在或呈短链状排列。革兰氏阳性革兰氏阳性周生鞭毛周生鞭毛形成的芽孢比菌体宽，在菌体的形成的芽孢比菌体宽，在菌体的中央或近端，少数菌种的在菌体中央或近端，少数菌种的在菌体顶端，但多数在菌体中部膨大呈顶端，但多数在菌体中部膨大呈梭形。梭形。
4、（二）培养特性（二）培养特性 cultural properties大多数专性厌氧，但耐氧性变化很大大多数专性厌氧，但耐氧性变化很大pH6.5-7pH6.5-7，30-37 30-37 生长快生长快多数为化能有机型多数为化能有机型有的能固氮有的能固氮触酶试验多为阴性触酶试验多为阴性模式种为丁酸梭菌模式种为丁酸梭菌对磺胺药、青霉素、土霉素等较为敏感。对磺胺药、青霉素、土霉素等较为敏感。（三）检查方法（三）检查方法 Test method1 1.厌氧培养厌氧培养n冷触媒法：冷触媒法：取适宜容器取适宜容器3 3个个1 1个放入氢硼化钠或氢硼化钾个放入氢硼化钠或氢硼化钾0.220.22g g，产氢，产
5、氢1 1个放柠檬酸个放柠檬酸0.330.33g g，碳酸氢钠碳酸氢钠0.37g,0.37g,产产COCO2 2另一个放活化的钯粒另一个放活化的钯粒1 1g g，冷催化，冷催化临用前与培养管、厌氧指示管一同放入装置中。临用前与培养管、厌氧指示管一同放入装置中。取水各取水各5 5mLmL加入前两个试剂容器内，立即封闭装置加入前两个试剂容器内，立即封闭装置等厌氧指示管（美兰）达厌氧状态时，移入等厌氧指示管（美兰）达厌氧状态时，移入3737培培养箱培养。养箱培养。n焦性没食子酸法：取适宜容器一个，内焦性没食子酸法：取适宜容器一个，内装焦性没食子酸装焦性没食子酸10g，无水碳酸钠无水碳酸钠5g，与与已接
6、种的培养管、厌氧指示管一同放入已接种的培养管、厌氧指示管一同放入装置中。立即封闭装置，等厌氧指示管装置中。立即封闭装置，等厌氧指示管达厌氧状态时，移入达厌氧状态时，移入37培养箱培养。培养箱培养。n凡凡士士林林-石石蜡蜡封封盖盖法法：在在已已接接种种的的培培养养管管内内注注入入已已经经灭灭菌菌并并液液化化的的1 1：1 1的的凡凡士士林林-石石蜡蜡混混合合物物1 1cmcm高高度度，试试验验管管经经75-8075-80水水浴浴保保温温时时，凡凡士士林林-石石蜡蜡混混合合物物自自动动熔熔化化并并封封住住液液面面，冷冷却却后后置置3737培培养养。在在培养过程中可随时取出培养物作检查。培养过程中可
7、随时取出培养物作检查。n降低培养基的氧化还原电势降低培养基的氧化还原电势添加还原剂：盐酸半胱氨酸、硫乙醇酸钠，甲醛化次添加还原剂：盐酸半胱氨酸、硫乙醇酸钠，甲醛化次硫酸钠，葡萄糖，硫酸钠，葡萄糖，VC，硫化钠，金属铁，组织等吸收，硫化钠，金属铁，组织等吸收培养基中的氧。培养基中的氧。培养基煮沸培养基煮沸添加琼脂：减少对流，防止空气进入添加琼脂：减少对流，防止空气进入2.消除杂菌干扰消除杂菌干扰n在在做做梭梭菌菌检检查查时时，常常将将接接种种后后的的液液体体培培养养基基在在75-8075-80保保温温20-3020-30minmin，以以杀杀灭灭可可能存在的细菌繁殖体。能存在的细菌繁殖体。n加入
8、新霉素、卡那霉素、多粘菌素加入新霉素、卡那霉素、多粘菌素3.形态学检查形态学检查n在在早早期期培培养养时时，革革兰兰氏氏阳阳性性，但但2424h h以以上上的的培培养养物物易易染染成成阴阴性性，因因此此要要注意培养时间注意培养时间n对对梭梭菌菌属属细细菌菌要要观观察察芽芽孢孢的的存存在在、位位置置、形形态态，革革兰兰染染色色时时，菌菌体体着着色，芽孢不着色。色，芽孢不着色。n凡凡经经厌厌氧氧培培养养的的芽芽孢孢杆杆菌菌，都都是是梭梭菌菌属属，但但产产气气荚荚膜膜梭梭菌菌、多多枝枝梭梭菌菌等难以形成芽孢。等难以形成芽孢。n染色未检出芽孢时，进行耐热试验。染色未检出芽孢时，进行耐热试验。二、产气荚
9、膜梭菌（二、产气荚膜梭菌（C.perfringens）n普遍存在于土壤、水、食品、调料、普遍存在于土壤、水、食品、调料、肠道中肠道中n在食物中生长到每克在食物中生长到每克106个以上才有致个以上才有致病性病性，至少摄取，至少摄取108个以上才可能致个以上才可能致病病n在肠道中产生芽孢在肠道中产生芽孢n肠毒素是一种芽孢特异性蛋白，在出肠毒素是一种芽孢特异性蛋白，在出芽过程中产生。芽过程中产生。（一）生物学特性（一）生物学特性1.1.形态特征形态特征n粗大芽孢杆菌，（粗大芽孢杆菌，（0.8-1.00.8-1.0）m m (4-8)m(4-8)m，杆状或稍弯曲，单独存在或呈短链状排列。杆状或稍弯曲，
10、单独存在或呈短链状排列。n革兰氏阳性革兰氏阳性n无鞭毛不运动无鞭毛不运动n芽孢卵圆形，不膨出菌体，位于菌体中央或芽孢卵圆形，不膨出菌体，位于菌体中央或次极端次极端n有明显的荚膜有明显的荚膜2.培养特性培养特性n厌氧，但要求不严格厌氧，但要求不严格n在血平板上，产生双圈溶血环，内环（在血平板上，产生双圈溶血环，内环（）完全溶）完全溶血，外环（血，外环（）不完全溶血，菌落本身略灰黄或灰）不完全溶血，菌落本身略灰黄或灰褐色，与空气接触褐色，与空气接触30min后，可能变为灰绿色或鲜后，可能变为灰绿色或鲜绿色。绿色。n一般不形成芽孢，碱性环境易产生芽孢一般不形成芽孢，碱性环境易产生芽孢n培养基中有可发
11、酵产酸的糖类时，不形成芽孢培养基中有可发酵产酸的糖类时，不形成芽孢n繁殖快，在适宜条件下繁殖快，在适宜条件下8min一代一代3.生化反应生化反应n发酵糖类产酸产气发酵糖类产酸产气n液化明胶液化明胶n还原硝酸盐还原硝酸盐n产生硫化氢产生硫化氢n不产生吲哚不产生吲哚n代谢产物为酸或醇代谢产物为酸或醇nStormy-fermentation4.致病性致病性n产产生生1212种种外外毒毒素素，其其中中四四种种为为致致死死毒毒素素。有有些些毒毒素素本质是酶类。本质是酶类。n根根据据外外毒毒素素的的种种类类不不同同，可可将将本本菌菌分分为为A A、B B、C C、D D、E 5E 5个型。对人致病的主要是
12、个型。对人致病的主要是A A和和C C，A A常见。常见。nA A型型菌菌产产生生的的肠肠毒毒素素可可引引起起食食物物中中毒毒，作作用用类类似似霍霍乱乱肠毒素。肠毒素。nA A型菌侵入伤口引起急性坏疽，致死率型菌侵入伤口引起急性坏疽，致死率40-100%40-100%nC C型产生的型产生的毒素可引起急性坏死性肠炎。毒素可引起急性坏死性肠炎。(二)产气荚膜梭菌产气荚膜梭菌半定量测定半定量测定n以以最最大大可可能能数数（MPNMPN）法法测测定定菌数菌数n利利用用乳乳糖糖亚亚硫硫酸酸盐盐培培养养基基和和倒倒管管，加加入入梯梯度度稀稀释释的的样样品品液液，混混匀匀后后45-4645-46厌厌氧氧培
13、培养养24-24-4848h h。n试试管管内内有有黑黑色色的的硫硫化化铁铁形形成成同同时时倒倒管管中中有有大大量量气气体体时时，表表明明有产气荚膜梭菌存在。有产气荚膜梭菌存在。n查表可知其最大可能数。查表可知其最大可能数。45-46 厌氧厌氧24-4824-48h h（三）特征性生化试验（三）特征性生化试验1.1.动力动力-硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验：穿穿刺刺接接种种两两管管培培养养基基，3737厌厌氧氧培培养养2424h h，观观察察有有无无动动力力。检检查查一一管管的的亚亚硝硝酸酸盐盐反反应应，滴滴加加a-a-萘萘胺胺试试液液及及对对氨氨基基苯苯磺磺酸酸试试液液各各0.50.5mLmL
14、，红红色色或或桔桔红红色色表表示示硝硝酸酸盐盐被被还还原原成成亚亚硝硝酸酸盐盐。梭菌为梭菌为阳性阳性反应反应45-46 厌氧厌氧2424h ha-a-萘胺萘胺,对氨对氨基苯磺酸各基苯磺酸各0.50.5mLmL注意注意：加试剂后，立即判断结果加试剂后，立即判断结果 未接种前应检查有无硝酸盐存在未接种前应检查有无硝酸盐存在 反应在厌氧条件下进行，分装培养反应在厌氧条件下进行，分装培养基时，液层应有一定的高度。基时，液层应有一定的高度。2.石蕊牛乳试验石蕊牛乳试验 Litmus Milk Reactions n产气荚膜梭菌在牛乳产气荚膜梭菌在牛乳培养基中能迅速分解培养基中能迅速分解乳糖，产酸，将酪蛋
15、乳糖，产酸，将酪蛋白凝固，产生大量的白凝固，产生大量的气体，冲散凝固的酪气体，冲散凝固的酪蛋白，出现蛋白，出现“汹涌发汹涌发酵现象酵现象”。n5h之内不发酵为阴性之内不发酵为阴性反应反应3.3.乳糖分解乳糖分解-明胶液化试验明胶液化试验n将将待待检检菌菌穿穿刺刺接接种种乳乳糖糖-明明胶胶培培养养基基，35-35-3737培培养养24-4824-48h h，取取出出置置冰冰箱箱5-105-10minmin和和阴阴性管对照，观察乳糖明胶的分解情况。性管对照，观察乳糖明胶的分解情况。该该菌菌能能发发酵酵乳乳糖糖，有有气气泡泡产产生生且且培培养养基基的颜色由红变黄，并在的颜色由红变黄，并在4848h
16、h内液化明胶。内液化明胶。4.卵磷脂酶试验与奈格尔（卵磷脂酶试验与奈格尔（Nagler）试验）试验n原原理理：产产气气荚荚膜膜梭梭菌菌产产生生的的A A型型毒毒素素是是一一种种卵卵磷磷脂脂酶酶，能能使使卵卵黄黄培培养养基基中中可可溶溶性性的的磷磷脂脂酰酰胆胆碱碱分分解解为为磷磷酸酸胆胆碱碱和和不不溶溶性性的的二二脂脂酰酰甘甘油油酯酯，后后者者在在菌菌落落周周围围形形成成不不透透明明区区，此此即即卵卵磷磷脂脂酶酶试验阳性。试验阳性。n此此反反应应可可被被相相应应抗抗血血清清抑抑制制，如如果果在在接接种种前前先先于于平平板板上上涂涂布布抗抗卵卵磷磷脂脂酶酶抗抗体体血血清清，则则菌菌落落周周围形成透
17、明区，称为奈格尔试验阳性。围形成透明区，称为奈格尔试验阳性。n方方法法：将将卵卵黄黄平平板板分分成成两两半半，其其中中一一半半涂涂上上产产气气荚荚膜膜梭梭菌菌抗抗血血清清，3737待待干干后后，将将待待检检菌菌轻轻轻轻在在平平板板上上划划线线，由由不不涂涂抗抗血血清清的的一一半半划划向向涂涂过过抗抗血血清清的的一一半半，在在厌厌氧氧条条件件下下3737培培养养24-24-4848h h，观察结果。观察结果。n结果：结果：在在接接种种待待检检菌菌未未涂涂抗抗血血清清的的一一侧侧，菌菌落落周周围围有有不不透明区，表示卵磷脂酶试验阳性。透明区，表示卵磷脂酶试验阳性。涂涂抗抗血血清清的的一一侧侧，菌菌
18、落落周周围围无无不不透透明明区区，表表示示卵卵磷磷脂酶活性已为其特异的抗血清中和，为奈格尔试验阳性。脂酶活性已为其特异的抗血清中和，为奈格尔试验阳性。如两侧菌落均无不透明区，为卵磷脂酶试验阴性。如两侧菌落均无不透明区，为卵磷脂酶试验阴性。问题：问题：抗血清不易获得抗血清不易获得检样检样25g+营养肉汤营养肉汤均质、离心、稀释均质、离心、稀释菌落菌落10个个倾注平板倾注平板3724h厌氧厌氧确证试验确证试验镜检镜检动力动力硝酸盐还原硝酸盐还原左卵磷脂分解左卵磷脂分解肠毒素检测肠毒素检测热抵抗热抵抗血清分型血清分型报告报告3724h厌氧厌氧牛乳发酵牛乳发酵破伤风梭菌是人类破伤风的病原菌。破伤风梭菌
19、是人类破伤风的病原菌。大量存在于人和动物的肠道，由粪便污染土大量存在于人和动物的肠道，由粪便污染土壤。壤。侵入伤口生长繁殖，释放外毒素，引起痉挛侵入伤口生长繁殖，释放外毒素，引起痉挛性抽搐，导致窒息或呼吸衰竭死亡。性抽搐，导致窒息或呼吸衰竭死亡。发展中国家，新生儿破伤风死亡率发展中国家，新生儿破伤风死亡率90%。用于深部组织、创伤、溃疡的制剂不得检出用于深部组织、创伤、溃疡的制剂不得检出三、破伤风梭菌（三、破伤风梭菌（Clostridium tetani）1 1.形态与染色形态与染色 Morphology and stainu菌体细长，菌体细长，0.0.5 5 m m (2-(2-5)m5)m
20、，直杆菌，无荚膜，周直杆菌，无荚膜，周生鞭毛；芽孢球形、端生成生鞭毛；芽孢球形、端生成鼓槌状，是显微鉴别的重要鼓槌状，是显微鉴别的重要特征。特征。uG+G+，但在芽孢形成后，易转，但在芽孢形成后，易转变成阴性变成阴性（一）生物学特性（一）生物学特性 Biological properties 2 2.培养特性培养特性 Culture characteristicsn专性厌氧；生长最适温度专性厌氧；生长最适温度3737，4545不生长；最适不生长；最适n在在血血琼琼脂脂平平板板上上，呈呈扩扩散散生生长长，不不易易获获得得单单个个表表面面菌菌落落；3737培培养养48h48h，菌菌落落直直径径2-
21、4mm2-4mm，扁扁平平、半半透透明明、灰灰白白色色，边缘不齐，周边疏松呈羽毛状，有狭窄的边缘不齐，周边疏松呈羽毛状，有狭窄的溶血环溶血环n在庖肉培养基中，肉汤轻度混浊，碎肉消化，发黑恶臭在庖肉培养基中，肉汤轻度混浊，碎肉消化，发黑恶臭n厌氧小瓶和注射器厌氧小瓶和注射器n非营养型运送培养基非营养型运送培养基n阻止氧气扩散阻止氧气扩散n维持生存维持生存72hn含指示剂系统，有氧含指示剂系统，有氧时变为淡紫色时变为淡紫色3 3.生化反应生化反应 biochemical reaction n一般不发酵糖类，偶尔分解葡萄糖一般不发酵糖类，偶尔分解葡萄糖n液化明胶液化明胶n产硫化氢产硫化氢n多数菌株吲
22、哚试验阳性多数菌株吲哚试验阳性n不还原硝酸盐不还原硝酸盐n对蛋白质有微弱的消化作用对蛋白质有微弱的消化作用4.4.抵抗力抵抗力 Resistancen芽孢抵抗力强，在干燥的土壤和尘埃中芽孢抵抗力强，在干燥的土壤和尘埃中数十年不死，可耐煮沸数十年不死，可耐煮沸1 1h h，干热干热150150度度1 1h h。n对青霉素、磺胺类敏感对青霉素、磺胺类敏感n耐氨基糖甙类抗生素耐氨基糖甙类抗生素5.5.抗原构造抗原构造 antigenic structure n各型间各型间O O抗原相同，抗原相同，H H抗原具有型特异性，可分抗原具有型特异性，可分为为1010个血清型。个血清型。n各型菌所产生的毒素生
23、物活性及免疫活性均相各型菌所产生的毒素生物活性及免疫活性均相同，可被任何型抗毒素中和。同，可被任何型抗毒素中和。（二）致病性与免疫性（二）致病性与免疫性 Pathogenic and immunity 1.1.致病物质致病物质-外毒素外毒素n破伤风痉挛毒素破伤风痉挛毒素tetanospasmin（神经毒素（神经毒素neurotoxins）：）：成分为蛋白质，引起横纹肌痉挛。现已制成结晶成分为蛋白质，引起横纹肌痉挛。现已制成结晶毒素，对小白鼠的最小致死剂量为毒素，对小白鼠的最小致死剂量为0.1mg/kg，可致痉可致痉挛窒息死亡。抗原性强，甲醛处理可制成类毒素，注挛窒息死亡。抗原性强，甲醛处理可制
24、成类毒素，注射机体可产生抗毒素。射机体可产生抗毒素。n溶血毒素：溶解红细胞溶血毒素：溶解红细胞2.2.所致疾病所致疾病Disease caused by C.tetani n破伤风破伤风 tetani n细菌不侵入血液，仅在局部繁殖。产生的痉挛细菌不侵入血液，仅在局部繁殖。产生的痉挛毒素进入血液引起毒血症。毒素进入血液引起毒血症。n毒素与毒素与对人及某些动物的中枢神经有特殊的亲对人及某些动物的中枢神经有特殊的亲和力，与神经节苷脂结合，导致骨骼肌痉挛性和力，与神经节苷脂结合，导致骨骼肌痉挛性收缩收缩n牙关紧闭，苦笑面容，颈部、躯干及四肢肌肉牙关紧闭，苦笑面容，颈部、躯干及四肢肌肉持续强直性痉挛导
25、致角弓反张，呼吸困难，窒持续强直性痉挛导致角弓反张，呼吸困难，窒息死亡息死亡3.3.免疫性免疫性 immunity n病后免疫力不强，再感染时仍可发病。病后免疫力不强，再感染时仍可发病。n患病早期使用抗毒素治疗同时，注射类患病早期使用抗毒素治疗同时，注射类毒素。毒素。（三）检验方法（三）检验方法 Test method1 1.增菌产毒培养增菌产毒培养：n取取供供试试品品0.50.5g g或或2 2mLmL，分分别别加加至至0.1%0.1%葡葡萄萄糖糖庖庖肉肉培培养基中（内有倒管）。养基中（内有倒管）。n同时做阳性对照和阴性对照。同时做阳性对照和阴性对照。n以以上上各各管管培培养养基基均均经经7
26、5-8075-80水水浴浴保保温温2020-30min-30min，以以杀杀死死其其他他细细菌菌营营养养体体，并并刺刺激激破破伤伤风风梭梭菌菌形形成成芽芽孢。孢。n移入厌氧装置移入厌氧装置3737培养培养72-9672-96h h。结果：结果：阳性对照管的培养液混浊，产气，碎肉阳性对照管的培养液混浊，产气，碎肉被消化变黑色并伴有恶臭；被消化变黑色并伴有恶臭；样品管可有可无此现象；样品管可有可无此现象；阴性对照管无菌生长。阴性对照管无菌生长。2 2.革兰染色镜检革兰染色镜检 Gram stain and microscopy 革兰染色时为阳性，革兰染色时为阳性，24-4824-48h h即可形成
27、即可形成芽孢，芽孢初生时卵圆形，形似火柴或芽孢，芽孢初生时卵圆形，形似火柴或网球拍状。继而膨大成球状。网球拍状。继而膨大成球状。7272h h后菌体后菌体自溶仅存芽孢体。自溶仅存芽孢体。3 3.毒力试验毒力试验 virulence test 选选用用体体重重相相同同的的同同性性健健康康小小白白鼠鼠18-3018-30只只，分分成成3 3群群，每每群群分分成成2 2组组。每每组组3-53-5只只，分分别别作作毒毒力力试试验验及及破伤风抗毒素破伤风抗毒素tetanus antitoxin保护试验。保护试验。毒力试验组毒力试验组:在在小小白白鼠鼠后后腿腿内内侧侧肌肌肉肉或或背背侧侧颈颈部部皮皮下下注
28、注射射增增菌菌产产毒培养液毒培养液0 0.3-0.5mL.3-0.5mL注注射射6 6h h后后观观察察发发病病情情况况至至4848h h，由由破破伤伤风风外外毒毒素素引引起起的的中中毒毒症症状状为为强强直直性性痉痉挛挛，抽抽搐搐，尾尾巴巴僵僵直直竖竖立立等等症状，死亡。症状，死亡。抗毒素保护试验组抗毒素保护试验组:在注射培养液前先注射在注射培养液前先注射120120u/mLu/mLmLmL半小时后注射增菌产毒培养液。或等量混半小时后注射增菌产毒培养液。或等量混合后注射。合后注射。6 6h h后与试验组同时观察发病情况。后与试验组同时观察发病情况。结果结果：任何一次试验组毒力试验呈上述病状，任
29、何一次试验组毒力试验呈上述病状，保护试验组无上述症状而存活的，说明保护试验组无上述症状而存活的，说明有破伤风梭菌存在，毒力试验阳性。有破伤风梭菌存在，毒力试验阳性。试验组与保护试验组均无症状的，则毒试验组与保护试验组均无症状的，则毒力试验为阴性。力试验为阴性。4 4.分离培养分离培养 isolate and culture 在在培培养养液液中中镜镜检检发发现现疑疑似似破破伤伤风风梭梭菌菌，而而毒毒力力试试验验阴阴性性时时，应应将将培培养养液液划划线线接接种种于于新新霉霉素素葡葡萄萄糖糖血血琼琼脂脂平平板板，3737厌厌氧氧培培养养3-43-4天天，挑挑取取典典型型菌菌落落，再再连连续续转转种种
30、于于增增菌菌产产毒毒培培养养基基中中两两次次，以以增加毒力，再取该培养液作毒力试验。增加毒力，再取该培养液作毒力试验。5 5.结果判定结果判定 result and analysis毒力试验阳性，无论镜检是否检到破伤毒力试验阳性，无论镜检是否检到破伤风梭菌，均按检出论。风梭菌，均按检出论。毒力试验阴性则按未检出论。毒力试验阴性则按未检出论。（四）注意事项（四）注意事项 noten进行破伤风菌检验的人员应事先注射破进行破伤风菌检验的人员应事先注射破伤风毒素进行免疫，操作时勿损伤皮肤伤风毒素进行免疫，操作时勿损伤皮肤n凡带有活菌与毒素的器具应彻底灭菌后凡带有活菌与毒素的器具应彻底灭菌后洗涤洗涤n庖
31、肉培养基的配制最好使用庖肉培养基的配制最好使用1 1：3 3的新鲜的新鲜牛肉汤牛肉汤n控制庖肉培养基的控制庖肉培养基的pHpH值不低于值不低于7.37.3供试品供试品 75-8020min0.1%葡萄糖庖肉培养基葡萄糖庖肉培养基3672-96h产气、臭气、消化碎肉、阳性产气、臭气、消化碎肉、阳性非左非左报告报告毒力试验毒力试验阳性阳性阴性阴性0.1%葡萄糖庖肉培养基葡萄糖庖肉培养基3672-96h毒力试验毒力试验阳性阳性阴性阴性0.1%葡萄糖庖肉培养基葡萄糖庖肉培养基毒力试验毒力试验分离培养分离培养3672-96h0.1%葡萄糖庖肉培养基葡萄糖庖肉培养基3672-96h毒力试验毒力试验阳性阳性
32、阴性阴性其它方法其它方法n用荧光染料标记的破伤风抗用荧光染料标记的破伤风抗O免疫诊断血清染色镜检免疫诊断血清染色镜检n接种至血琼脂斜面底部，接种至血琼脂斜面底部，37厌氧直立培养厌氧直立培养24-48h,从上从上部挑纯菌部挑纯菌n半抗毒素鉴别法半抗毒素鉴别法n抗毒素鉴别法抗毒素鉴别法四、四、肉毒梭菌（肉毒梭菌（C.botulinum）l肉肉毒毒梭梭菌菌为为腐腐生生菌菌，常常见见于于土土壤壤、水水环环境境的的沉沉积积物物中中，很很少引起感染。少引起感染。l罐罐头头、火火腿腿、腊腊肠肠、鱼鱼及及鱼鱼制制品品、发发酵酵豆豆制制品品和和面面制制品品中中若若污污染染肉肉毒毒梭梭菌菌并并产产生生毒毒素素，
33、引发毒素型食物中毒。引发毒素型食物中毒。n添馅茄子、油浸大蒜、烤土豆、抄洋葱、添馅茄子、油浸大蒜、烤土豆、抄洋葱、蜂蜜制品蜂蜜制品n美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制品较多，我国多与发酵食品有关品较多，我国多与发酵食品有关n重症患者多在重症患者多在2-4天死亡。天死亡。n4 1 m4 1 m的大杆菌的大杆菌n4-84-8根周生鞭毛，运动迟根周生鞭毛，运动迟缓缓n无荚膜无荚膜n适宜温度适宜温度25-3525-35n适宜适宜pHpH为为n菌落菌落3mm3mm，半透明，表面，半透明，表面颗粒状，边缘不整齐，颗粒状，边缘不整齐，界限不明显，向外扩散，界限不明显，向外扩
34、散，呈绒毛网状呈绒毛网状n在血平板上出现溶血环在血平板上出现溶血环n在乳糖卵黄牛乳平板上，在乳糖卵黄牛乳平板上，菌落为乳浊，表面及周菌落为乳浊，表面及周围形成虹彩薄层围形成虹彩薄层n不分解乳糖，发酵葡萄不分解乳糖，发酵葡萄糖糖n分解蛋白的菌株，菌落分解蛋白的菌株，菌落周围有透明环周围有透明环n菌株间生化性状不规律菌株间生化性状不规律（一）生物学特性（一）生物学特性 Biological properties（二）致病性（二）致病性 pathogenic1.1.致病物质致病物质n肉毒毒素肉毒毒素botulin是已知最剧烈的毒素，毒性比氰是已知最剧烈的毒素，毒性比氰化钾强化钾强1 1万倍，比响尾蛇
35、毒素约高万倍，比响尾蛇毒素约高1010万倍。万倍。n纯纯化化结结晶晶的的肉肉毒毒毒毒素素1 1mgmg可可杀杀死死2 2 亿亿只只小小鼠鼠，人人注注射射0.0003mg0.0003mg，经口经口0.30.3mgmg。n根根据据毒毒素素的的抗抗原原性性不不同同，可可分分为为A A、B B、C1C1、C2C2、D D、E E、F F、G G 8 8个个毒毒素素型型，A A、B B、E E、F F 对对人人类类致致病病，A A、B B 最常见。我国大多为最常见。我国大多为A A型。型。n不耐热，煮沸不耐热，煮沸1min1min可破坏。可破坏。n肉毒毒素是一种神经毒素，阻止向胞外分泌肉毒毒素是一种神经
36、毒素，阻止向胞外分泌和释放乙酰胆碱。导致无法应答运动神经元和释放乙酰胆碱。导致无法应答运动神经元的冲动，肌肉不能收缩，松弛麻痹。的冲动，肌肉不能收缩，松弛麻痹。肉毒毒素作为治疗药剂肉毒毒素作为治疗药剂从自然界毒性最强的蛋白质获益从自然界毒性最强的蛋白质获益l自自19891989年年FADFAD批准批准A A型肉毒毒素用于治疗型肉毒毒素用于治疗3 3种障碍性疾种障碍性疾病：斜视、眼睑痉挛、半侧面部痉挛病：斜视、眼睑痉挛、半侧面部痉挛l其它方面的震颤、美容、偏头痛、紧张性头痛等其它方面的震颤、美容、偏头痛、紧张性头痛等l正在进行的研究有：梭菌毒素或毒性结构域用于药正在进行的研究有：梭菌毒素或毒性结
37、构域用于药物配送、预防食物中毒、治疗癌症和其它疾病物配送、预防食物中毒、治疗癌症和其它疾病2.2.所致疾病所致疾病 Disease caused by C.botulinum n肉毒中毒肉毒中毒botulism：常常发发生生于于毒毒素素摄摄入入后后18-2418-24h h，出出现现乏乏力力、头头痛痛，复复视视、斜斜视视、视视力力模模糊糊、眼眼睑睑下下垂垂、渐渐进进性性吞吞咽咽和和说说话话困困难难、声声音音嘶嘶哑哑、肌肌肉肉无无力力、也也许许会会出出现现腹腹涨涨和和便便秘秘。最最终终引引起起膈膈肌肌麻麻痹痹，死死于于呼呼吸吸障障碍碍或或心心脏脏衰竭。衰竭。治疗依赖于辅助性护理和多价抗毒素的使用
38、。治疗依赖于辅助性护理和多价抗毒素的使用。n婴儿肉毒病婴儿肉毒病 感染性食物中毒。一岁以内特别是半岁以内的感染性食物中毒。一岁以内特别是半岁以内的婴儿，肉毒梭菌在肠道内繁殖并产生毒素，毒素经婴儿，肉毒梭菌在肠道内繁殖并产生毒素，毒素经肠道吸收而致病。肠道吸收而致病。大多在大多在1-31-3个月内自然恢复，病死率不高。个月内自然恢复，病死率不高。美国每年有约美国每年有约100100例婴儿肉毒中毒，蜂蜜和灰例婴儿肉毒中毒，蜂蜜和灰尘。尘。表现为便秘、无精打采的、大多虚弱、仅是很表现为便秘、无精打采的、大多虚弱、仅是很少。常常死于呼吸衰竭。少。常常死于呼吸衰竭。三种梭菌的比较三种梭菌的比较产气荚膜梭
39、菌产气荚膜梭菌破伤风梭菌破伤风梭菌肉毒梭菌肉毒梭菌分布分布广泛分布于自然界、广泛分布于自然界、人和动物的肠道人和动物的肠道大量存在于人和动物大量存在于人和动物的肠道，由粪便污染的肠道，由粪便污染土壤土壤主要存在于土壤，偶主要存在于土壤，偶尔存在于动物粪便中尔存在于动物粪便中大小大小（1-1.5）m(3-5)m0.5m(2-5)m（1-1.2）m(4-6)m鞭毛鞭毛/荚膜荚膜无无/有有周生周生/无无周生周生/无无发酵糖类发酵糖类发酵葡萄糖、乳糖、发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖麦芽糖、蔗糖不发酵糖类，偶尔分不发酵糖类，偶尔分解葡萄糖解葡萄糖各型均发酵葡萄糖和各型均发酵葡萄糖和麦芽糖，不发酵乳糖麦芽
40、糖，不发酵乳糖吲哚试验吲哚试验-多数多数+-致病物质致病物质外毒素和侵袭性酶外毒素和侵袭性酶类类破伤风毒素破伤风毒素肉毒毒素肉毒毒素所致疾病所致疾病食物中毒、气性坏食物中毒、气性坏疽、坏死性肠炎疽、坏死性肠炎破伤风破伤风肉毒中毒、婴儿肉毒肉毒中毒、婴儿肉毒症症（二）肉毒梭菌检验（二）肉毒梭菌检验n增菌培养增菌培养 取庖肉培养基取庖肉培养基3支，煮沸支，煮沸10-15min l第一支，急速冷却第一支，急速冷却,接种检样均质液接种检样均质液1-2mLl第二支，冷却至第二支，冷却至60，接种检样，接种检样，60保温保温10min10min，急速冷却急速冷却l第三支，第三支，接种检样，继续接种检样，继
41、续煮沸煮沸10-15min,急速冷却急速冷却l30 培养培养5 5天天1010天天l若有生长，上清液进行毒素检验若有生长，上清液进行毒素检验n分离培养分离培养l增菌产毒培养物接种卵黄琼脂平板，增菌产毒培养物接种卵黄琼脂平板，3535厌氧培养厌氧培养48h48hl典型菌落隆起或扁平，光滑或粗糙，菌落表面有虹典型菌落隆起或扁平，光滑或粗糙，菌落表面有虹晕色（晕色（iridescenceiridescence）,此光区称为此光区称为“珍珠层珍珠层”lC C、D D、E E型菌落表面通常有型菌落表面通常有2-4mm2-4mm黄色沉淀区围绕，黄色沉淀区围绕，A A、B B型菌落沉淀区较小型菌落沉淀区较小
42、l挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，30 培养培养5 5天天l进行毒素检验和培养特性检查进行毒素检验和培养特性检查l接种卵黄琼脂平板，分成接种卵黄琼脂平板，分成2 2份，分别在份，分别在3535的的需氧和厌氧条件下培养需氧和厌氧条件下培养48h48hl肉毒梭菌只有在厌氧条件下才能在卵黄琼脂平肉毒梭菌只有在厌氧条件下才能在卵黄琼脂平板上生长病形成特征菌落，在需氧条件下不生板上生长病形成特征菌落，在需氧条件下不生长长n培养特性检查培养特性检查检样检样增菌、产毒培养增菌、产毒培养305天天观察并镜检观察并镜检报告报告毒素检测毒素检测镜检镜检分离培养分离培养报告报告毒素检测毒
43、素检测毒素检测毒素检测增菌、产毒培养增菌、产毒培养305d观察并镜检观察并镜检（三三）肉肉毒毒素素检检验验程程序序及及方方法法检样制备检样制备n液体检样直接离心，固体或半流动检样液体检样直接离心，固体或半流动检样需加适量的明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、需加适量的明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，离心，取上清研碎，离心，取上清n取上清液，调取上清液，调pH6.2,pH6.2,每每9 9份加份加1010胰酶水胰酶水溶液溶液1 1份，混匀，份，混匀，3760min3760min，检测。，检测。毒素检出毒素检出n取上清液及胰酶激活处理液分别注射小白鼠取上清液及胰酶激活处理液分别注射小白鼠2 2只，每只只，每只0
44、.5mL0.5mL，观察，观察4 4天天n注射后注射后24h24h内发病，死亡内发病，死亡n症状为竖毛，四肢瘫软，呼吸困难，呼吸呈风症状为竖毛，四肢瘫软，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，呼吸麻痹箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，呼吸麻痹确证试验确证试验n取毒素三份取毒素三份n1 1份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清，混匀，份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清，混匀，3730min3730minn1 1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min10minn1 1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀n分别注射小白鼠各分别注射小白鼠各2
45、2只，每只只，每只0.5mL0.5mL，观察，观察4 4天。天。毒力测定毒力测定n却确定含有肉毒毒素的检样离心上清液却确定含有肉毒毒素的检样离心上清液n用明胶用明胶磷酸盐缓冲液稀释磷酸盐缓冲液稀释5 5倍、倍、5050倍、倍、500500倍、倍、50005000倍，分别注射小白鼠各倍，分别注射小白鼠各2 2只，每只只，每只0.5mL0.5mL，观察观察4 4天。天。n根据动物死亡情况，计算检样中的大体毒力根据动物死亡情况，计算检样中的大体毒力（MLD/mLMLD/mL）定型试验定型试验n按毒力测定结果，用明胶按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大
46、体在上清液稀释至所含毒素的毒力大体在10-1000 10-1000 MLD/mLMLD/mL的范围的范围n分别与各单型肉毒抗血清等量混匀，分别与各单型肉毒抗血清等量混匀，3737作用作用30min30minn分别注射小白鼠各分别注射小白鼠各2 2只，每只只，每只0.5mL0.5mL，观察，观察4 4天天n以以明胶明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清磷酸盐缓冲液代替诊断血清,与稀释毒素与稀释毒素液等量混合作为对照液等量混合作为对照n能保护动物免于发病、死亡的诊断血清即为检样能保护动物免于发病、死亡的诊断血清即为检样所含肉毒素的型别所含肉毒素的型别（四）注意事项（四）注意事项n典型的肉毒中毒，小白鼠会在4-6h内死亡，98-99的会在12h内死亡n24h后的死亡可疑n如注射更高稀释度的样品后未死亡，可疑n肉毒中毒必须以检出食物中的肉毒毒素为准