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1、第三节第三节 核酸类药物核酸类药物一、核酸类药物概述核核酸酸类类药药物物可分为两两大大类类，一类为具有天天然然结结构构的的核核酸酸类物质，缺乏这类物质会使机机体体代代谢谢失失调调，发生病态，提供这类物质，有助于改善机体的物物质质代代谢谢和能量平衡和能量平衡。第第二二类类为为天天然然结结构构碱碱基基、核核苷苷、核核苷苷酸酸结结构构类类似似物物或或聚聚合合物物，这一类核酸类药物是当今人类治治疗疗病病毒毒、肿肿瘤瘤、艾艾滋滋病病等的重要手段，也是产生干干扰扰素素、免免疫疫抑抑制制的临床药物，已经在临床上应用的抗病毒核苷酸类药物有以下一些品种：随着分分子子生生物物学学和和遗遗传传工工程程的发展，基基因
2、因治治疗疗应运而生，得到广泛的肯定。其其中中包包括括反反义义核核酸酸技技术术，简简称称反反义义技技术术。利用这一技术研制的药物称为反反义义药药物物，根据核核酸酸杂杂交交原原理理，反反义义药药物物能能与与特特定定基基因因杂杂交交，在基基因因水水平平干干扰扰致致病病蛋蛋白白的产生过程，及干干扰扰遗遗传传信信息息从核酸向蛋白质的传递。反义核酸作为药物与常规药物相比有两个显著特两个显著特点：点：有关疾病的靶基因靶基因mRNA序列序列是已知的，因此，设计合理特异性的反义核酸特异性的反义核酸比较容易；反义寡核苷酸寡核苷酸与靶基因靶基因能通过碱基配对原理碱基配对原理发生特异和有效的结合特异和有效的结合从而调
3、节基因的表达调节基因的表达。它的缺点它的缺点是天然的寡核苷酸难以进入细胞内难以进入细胞内、而一旦进入又易被胞内核酸酶水解胞内核酸酶水解，很难直接用于治疗直接用于治疗。核酸疫苗核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白抗原蛋白的外源基因外源基因（DNA或RNA）直接导入动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统转录系统合成抗原蛋白质抗原蛋白质，诱导宿主产生对该抗原蛋白质的免疫应答免疫应答以达到防病治病的目的防病治病的目的。核酸疫苗又称基因疫苗或基因免疫核酸疫苗又称基因疫苗或基因免疫。DNA疫苗为目前尚无满意疗法无满意疗法的某些疾病（如慢性病毒性肝炎、疟疾、艾滋病）提供一种新的治疗途新的治疗途径。径。二、核酸类物质的
4、分离提取及其发酵生产二、核酸类物质的分离提取及其发酵生产（一）（一）RNA与与DNA的提取与制备的提取与制备1、RNA的提取与制备的提取与制备（l）工业用工业用RNA的提取的提取 RNA及及其其工工业业来来源源从微生物中提取RNA是工业上最实际和有效的方法。一些最常见的菌体含有丰富的核核酸酸资资源源，如酵酵母母、白白地地霉霉、多种抗菌素的菌菌丝丝体体。通通常常在在细细菌菌中中RNA占占525，在在酵酵母母中中占占2.715，在霉菌中占，在霉菌中占0.7%28。在菌体内RNA含含量量的变化受培培养养基基组组成成影响，其中关键是铵铵离离子子浓浓度度和和磷磷酸酸盐盐浓浓度度。培养酵酵母母菌菌体体收率
5、高，易于提取RNA。很显然在许多酵母中，早早期期细细胞胞中中的的RNA含含量量高高，其确切数值取决于碳、氮比例碳、氮比例和培养基组成等。高高RNA含含量量酵酵母母菌菌株株的的筛筛选选可以从自然界筛筛选选到RNA含含量量高高的的酵酵母母菌菌株株，也可用诱诱变变育育种种的方法提高酵母菌的RNA含量。工业废水培养高含量工业废水培养高含量RNARNA酵母酵母 RNA的提取的方法：的提取的方法：稀稀碱碱法法：是用氢氢氧氧化化钠钠溶溶液液（1%），使使细细胞胞壁壁变变性性，使核核酸酸从从细细胞胞内内释释放放出出来来。需用酸中和pH7。然后除除去去菌菌体体，将pH调至RNA的等等电电点点（pH2.5），使R
6、NA沉淀沉淀出来。此此法法的的缺缺点点是制得的RNAMr较较低低,(磷磷酸酸单单脂脂酶酶、磷酸二脂酶降解磷酸二脂酶降解RNA，90 保持保持34h破坏酶破坏酶)。浓浓盐盐法法：是用高高浓浓度度盐盐溶溶液液（6%8%）处理，同时加加热热，以改改变变细细胞胞壁壁的的通通透透性性，使使核核酸酸从从细细胞胞内内释释放出来放出来。要避免分分子子降降解解，可采用苯苯酚酚法法制备RNA。用苯苯酚酚处处理理生物材料，使蛋蛋白白质质变变性性，然后离心，上层水溶液内含有全部全部RNA，可用乙醇沉淀乙醇沉淀出来。脱脱氧氧核核糖糖核核蛋蛋白白溶于浓浓盐盐溶溶液液1mol/L,不溶于0.14mol/L,而核糖核蛋白核糖
7、核蛋白溶于0.14mol/L盐溶液。RNA的的提提取取实实例例：啤酒酵母是提取RNA的很好的资源。取100g压榨啤酒酵母（含水份70%），加入230ml含NaOH 3g的水，20以下缓慢搅拌30分钟。用6molLHCl调调至至pH7，搅拌15分钟，离离心心得清液255m1。冷冷至至10以以下下，6molLHCl调pH2.5，置冷过夜，离心得RNAl.8g（纯度80）。2、DNA的提取与制备的提取与制备 （1）工业用）工业用DNA的提取的提取取新鲜冷冻鱼鱼精精20kg，用绞肉机粉碎2次成浆状，加入等体积水，搅拌均匀，倾入反应锅内，缓慢搅拌，升温至100，保保温温15分分钟钟，迅迅速速冷冷却却至至
8、2025，离心除去鱼鱼精精蛋蛋白白等沉淀物，获得35L含含热热变变性性DNA的溶液，经精确测定DNA含量后直接可用于酶酶法法降降解解生产脱氧核苷酸。如要制成固固体体状状DNA，在热变性DNA溶液中逐渐加入等体积95乙乙醇醇，离心可获得纤维状DNA，沉沉淀淀用用乙乙醇醇、丙丙酮酮洗洗涤涤，减压低温干燥得DNA粗粗品品，产品含热变性含热变性DNA 5060。2、具有生物活性、具有生物活性DNA的制备的制备动物内脏（肝、脾、胸腺）加4倍倍重重量量生生理理盐盐水水经组组织织捣捣碎碎机机捣碎1分钟，匀浆于2500rpm离心30分钟。将沉淀悬浮于20倍重量的冷生理盐水中，加加入入2倍倍量量5的的（用用45
9、%乙乙醇醇作作溶溶剂剂）十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠，并搅拌23小时，在02500rpm离心，在上层液中加入等体积的冷冷95乙乙醇醇，离心即可得到纤维状DNA，再用冷乙醇和丙酮洗涤冷乙醇和丙酮洗涤，减压低温干燥低温干燥得粗品DNA。粗品DNA溶于适量蒸馏水，加入5十十二二烷烷基基磺磺酸酸钠钠达110体积，搅搅拌拌1小小时时，经5000rpm离心1小时，清液中加加入入NaCl达达1molL，再缓慢加入冷冷95%乙乙醇醇，DNA析出，经乙醇、丙酮洗涤，真空干燥得具有生生物物活性的活性的DNA。（二）用酶解法、发酵法和半合成法（二）用酶解法、发酵法和半合成法制备核苷酸制备核苷酸 1、酶解法及碱水解法
10、制备核苷酸、酶解法及碱水解法制备核苷酸（1）酶解法制备）酶解法制备脱氧核苷酸脱氧核苷酸 桔青霉桔青霉产生5-磷酸二脂酶磷酸二脂酶红酵母红酵母产生3-磷酸二脂酶磷酸二脂酶（2）酶解法制备酶解法制备戊糖核苷酸戊糖核苷酸我国从60年代开始使用核核酸酸酶酶P1降解核糖核酸生产单单核核苷苷酸酸，日本年产呈呈味味核核苷苷酸酸（肌肌苷苷酸酸和和鸟鸟苷苷酸酸）3000吨，其中60%是使用酶解法使用酶解法生产的。酶解法生产酶解法生产5单核苷酸工艺流程单核苷酸工艺流程（3）双酶法生产）双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸肌苷酸和鸟苷酸（IG）呈味核苷酸呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠肌苷酸钠和鸟苷酸钠，商品名简称为（
11、IG），用核酸酶核酸酶Pl降解RNA可获得GMP和和AMP，其中AMP经脱氨生成经脱氨生成IMP。双酶法生产（I十G）工艺。（4）菌体自溶法生产核苷酸）菌体自溶法生产核苷酸磷磷酸酸二二酯酯酶酶在合适的条件下下降降解解细细胞胞内内的的RNA可产生5-核核苷苷酸酸。在国内用谷氨酸产生菌菌体体自自溶溶法法生产5-核苷酸核苷酸。（1）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：）菌体自溶法生产核苷酸工艺流程：（5）碱水解法生产）碱水解法生产2，3-混合核苷酸混合核苷酸 RNA结结构构中中的的磷磷酸酸二二酯酯键键对对于于碱碱性性条条件件不不稳稳定定，很很容容易易生生成成2，3-环环状状磷磷酸酸酯酯，此此环环状状磷磷酸
12、酸酯酯对对碱碱更更不稳定不稳定，很易，很易加水分解加水分解生成生成2，3-混合核苷酸混合核苷酸。从RNA水水解解成成2，3-核核苷苷酸酸的的降降解解率率达达95以以上上，将2，3-混合核苷酸混合核苷酸制成每片含制成每片含50100mg的片剂的片剂。经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白白血血球球减减少少症症、癌肿的化疗和放疗后的升升白白血血球球均有较好疗效。2、发酵法生产核苷酸、发酵法生产核苷酸（1）发酵法生产）发酵法生产肌苷酸（肌苷酸（IMP）（2）发酵生产发酵生产黄苷酸（黄苷酸（XMP）及酶法转化成及酶法转化成鸟苷酸鸟苷酸3、半合成法制备核苷酸、半合成法制备核苷酸由于发酵法生产核苷发酵法
13、生产核苷的产率很高，核苷悬浮于核苷悬浮于磷酸磷酸三甲酯或磷酸三乙酯三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下加入中，在冷却条件下加入氯化氧磷，氯化氧磷，进行磷酸化进行磷酸化，从，从核苷核苷生成生成5-核苷酸核苷酸收率可达收率可达90%。例例一一：肌肌苷苷2mmolL悬悬浮浮于于5ml磷磷酸酸三三乙乙酯酯中中，温温度度控控制制0，添添加加氯氯化化氧氧磷磷6mmolL，水水2mmolL，反应反应2h，5-IMP摩尔摩尔产率达产率达91。例例二二：鸟鸟苷苷2mmolL悬悬浮浮于于5ml磷磷酸酸三三甲甲酯酯中中，温温度度控控制制0，添添加加氯氯化化氧氧磷磷6mmolL，水水2mmo/L，反应反应6h，5-GM
14、P摩尔摩尔产率达产率达90%。（三）核苷的制备（三）核苷的制备本节叙述核苷核苷的化学法化学法和发酵法发酵法生产。1、RNA化学水解法制备核苷化学水解法制备核苷（1）核苷生产工艺流程）核苷生产工艺流程RNA经经甲酰胺化学水解甲酰胺化学水解制备核苷制备核苷2、发酵法生产核苷、发酵法生产核苷发发酵酵法法生生产产核核苷苷是近代发酵工程领域中的杰出成果，产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种核苷的菌株有着许多共同特点共同特点：它们都使用磷磷酸酸单单酯酯酶酶活力很强的枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌或短小芽孢杆菌为诱变出发菌株出发菌株；它们都是通过使用物物理理或或化化学学诱诱变变方法选育出在遗传性状遗
15、传性状上具有特定标记的诱变菌特定标记的诱变菌；它们在发酵培养时必须提供限限量量的的生生长长因因素素，并且好氧好氧，在某一特定的范围内累积大量核苷。（1）发酵法生产）发酵法生产肌苷肌苷 (枯草杆菌枯草杆菌)（2）发酵法生产）发酵法生产鸟苷和黄苷鸟苷和黄苷 (肌苷产生菌肌苷产生菌)（3）发酵法生产）发酵法生产腺苷腺苷 (产氨短杆菌产氨短杆菌)三、重要核酸类药物的制备三、重要核酸类药物的制备一、叠氮胸苷（一、叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT）（一）结构与性质一）结构与性质 AZT是1987美国美国FDA批准批准的治疗艾滋病艾滋病的新药。AZT的药理作用是人体内经磷酸化磷酸化后生成了3-
16、叠氮叠氮-2-脱氧胸腺嘧啶核苷酸脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后者取代取代了正常的了正常的胸腺嘧胸腺嘧啶核苷酸啶核苷酸参与参与病毒病毒DNA的合成的合成，含有，含有AZT成份的成份的DNA不能继续复制不能继续复制，从而达到，从而达到阻止病毒增殖的目的阻止病毒增殖的目的。（二）生产工艺（二）生产工艺此合成路线的起始原料起始原料是是胸苷胸苷。（二）阿糖腺苷（二）阿糖腺苷Adenine arabinoside1、结构与性质结构与性质 阿阿糖糖腺腺苷苷的化学名称为9-D-阿拉伯呋喃糖腺嘌呤，或称腺嘌呤阿拉伯糖苷腺嘌呤阿拉伯糖苷。早在1960年年就在实验室合合成成了了阿阿糖糖腺腺苷苷，1969年年美国用Strep
17、tomycesantibioticusNRRL3238菌株，1972年年日本用Streptomyceshebacecus4334菌株发发酵酵法法分分别别制备了阿糖腺苷制备了阿糖腺苷。1979年年用从EColi中分离得到的尿尿嘧嘧啶啶磷磷酸酸化化酶酶和嘌嘌呤呤核核苷苷磷磷酸酸化化酶酶，以固固相相酶酶的方法将将阿阿糖糖脲脲苷苷转转化为阿糖腺苷化为阿糖腺苷。2、生产工艺、生产工艺（1）酶）酶-化学合成法化学合成法最新的阿阿糖糖腺腺苷苷的合成法是酶酶-化化学学合合成成法法：用用尿尿苷苷为原料生成氧氧桥桥化化合合物物，水解成阿阿糖糖尿尿苷苷，经酶酶法法转化成阿糖腺苷阿糖腺苷。经选育的优秀菌株是产气肠杆菌
18、产气肠杆菌，能产生尿苷磷酸尿苷磷酸化酶化酶（Upase）和嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶（Pynpase），从阿糖尿苷阿糖尿苷和腺嘌呤腺嘌呤能高效地合成阿糖腺苷阿糖腺苷，菌体也可制成固定化细胞固定化细胞进行连续生产。（2）以）以5-AMP为原料的化学合成为原料的化学合成3、作用与用途、作用与用途 阿糖腺苷阿糖腺苷是近年来引人注目的广谱广谱DNA病毒抑制病毒抑制剂剂，对单纯疱疹疱疹、型，带状疱疹，巨细，牛痘等型，带状疱疹，巨细，牛痘等DNA病毒，在体内外都有明显抑制作用病毒，在体内外都有明显抑制作用。而且阿糖腺三磷阿糖腺三磷对于病毒病毒DNA聚合酶聚合酶的亲和性亲和性比比宿主细胞的同一个酶的亲
19、和性高亲和性高。因此这个药物对于抑制病毒具有较高选择性较高选择性。（三）三氮唑核苷（三）三氮唑核苷1、结构与性质、结构与性质三三氮氮唑唑核核苷苷商品名病病毒毒唑唑，对DNA病毒，RNA病毒都有广泛作用。这个化合物在在体体内内被被磷磷酸酸化化成成三三氮氮唑唑核核苷苷酸酸，抑制病毒病毒DNA合成合成。2 生产工艺生产工艺酶酶合合成成法法 使用产产气气肠肠杆杆菌菌，以（尿尿苷苷）肌肌苷苷和和TCA（三三叠叠氮氮羧羧基基酰酰胺胺）为底物可以用酶法简易地合成三氮唑核苷三氮唑核苷采用前段与后段由两个不同的酶催化，即前段使用嘧啶核苷磷酸化酶嘧啶核苷磷酸化酶，后段使用嘌呤核苷磷酸化酶嘌呤核苷磷酸化酶。四、阿糖
20、胞苷四、阿糖胞苷（一）结构与性质一）结构与性质阿糖胞苷阿糖胞苷又称胞嘧啶阿拉伯糖苷胞嘧啶阿拉伯糖苷，糖的组成部分是阿拉伯糖阿拉伯糖。阿糖胞苷进入体内转变为阿糖胞苷酸阿糖胞苷酸，抑制抑制DNA聚聚合酶，抑制合酶，抑制DNA的合成的合成，干扰干扰DNA病毒繁殖繁殖和肿瘤细胞增殖增殖。（二）生产工艺（二）生产工艺 1以以5CMP为原料的合成法为原料的合成法（1）工艺路线：）工艺路线：2、以葡萄糖酸钙为原料的合成路线、以葡萄糖酸钙为原料的合成路线（五）聚肌胞苷酸（聚肌胞）（五）聚肌胞苷酸（聚肌胞）1、结构与性质结构与性质1967年年美国人Field发现聚聚肌肌胞胞是干干扰扰素素诱诱导导物物，而且具有广
21、广谱谱抗抗病病毒毒作作用用。本品是人人工工合合成成的的干干扰扰素素诱诱导导剂剂，系由多多聚聚肌肌苷苷酸酸和和多多聚聚胞胞苷苷酸酸组成的双股多聚核苷酸。本品可溶于溶于0.85氯化钠氯化钠溶液。2、生产工艺、生产工艺聚肌胞生产工艺如下：1）底物）底物5-核苷二磷酸吡啶盐核苷二磷酸吡啶盐的制备的制备2）固定化）固定化多核苷酸磷酸化酶多核苷酸磷酸化酶（3）固固定定化化多多核核苷苷酸酸磷磷酸酸化化酶酶，将分离纯化的酶液滴加入冰浴中的载体，得到共共价价结结合合的的固固定定化化多多核核苷苷酸磷酸化酶酸磷酸化酶。3、PolyI：C制备（1）底底物物预预处处理理：CDP吡吡啶啶盐盐转转成成锂锂盐盐，IDP吡吡啶
22、啶盐盐转成钠盐。转成钠盐。（2）酶酶促促反反应应：（每毫升反应液含molL数）IDP或或CDP15；Tris150；MgC126；EDTA1；聚合酶5单位，pH9.0，37，34小时。用盐盐酸酸调调pH1.52.0，使使PolyI（或或Poly C）沉沉淀淀，立即离心。此后在磷酸液冲液中溶解，等等摩摩尔尔Poly I与与Poly C混合，生成产品混合，生成产品。（三）作用与用途（三）作用与用途 本本品品具具有有抗抗病病毒毒，抗抗肿肿瘤瘤，增增强强淋淋巴巴细细胞胞免免疫疫功功能能和和抑抑制制核核酸酸代代谢谢等等作作用用。本品注入人体诱诱导导产产生生干干扰扰素。素。六、胞二磷胆碱（六、胞二磷胆碱（
23、CDP-胆碱）胆碱）（一）结构与性质一）结构与性质胞胞二二磷磷胆胆碱碱其化学名称为胞胞嘧嘧啶啶核核苷苷-5-二二磷磷酸酸胆胆碱碱钠钠盐盐本品为白色无定形粉末，易易吸吸湿湿，易易溶溶于于水水，几不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂几不溶于乙醇、氯仿、丙酮等多数有机溶剂。（二）生产工艺（二）生产工艺1、酶合成法、酶合成法 胞胞二二磷磷胆胆碱碱由微生物菌体所提供的酶系催化胞胞苷苷酸酸和磷磷酸酸胆胆碱碱而合成，国内使用啤酒生产中废废弃弃的的酵酵母母，反应体系为：磷酸二氢钾氢氧化钠缓冲液（pH8.0）200molml，CMP 20molml，磷酰胆碱磷酰胆碱30molml，葡萄糖1000molml，Mg
24、SO4.7H2O20molml，酵母泥酵母泥550mgm1。上述反应体系于28保保温温20小小时时，胞二磷胆碱对胞胞苷酸苷酸的收率为收率为80。2粘性红酵母发酵法粘性红酵母发酵法国外发现一株粘性红酵母红酵母可可高产胞二磷胆碱高产胞二磷胆碱。菌体培养基（gL）：葡萄糖50；多胨5；酵母膏2；KH2PO4 2；（NH4）2HPO4 2；MgSO4.7H2O 1；pH6.0，经28，22h培养，收收集集菌菌体体，菌体经0.2molL磷酸缓冲液pH7.0洗涤，备用备用。产生胞二磷胆碱的反应体系（gL）：葡萄糖140；MgSO4.7H2O6；5CMPNa220；磷磷酸酸胆胆碱碱20；析析干干菌菌体体50
25、；反应体系中保持磷酸缓冲缓pH7.0、0.2molL，30，28小时产胞二磷胆碱9.8gL，对5-CMP收率收率92.5。提取工艺提取工艺：反应液离心除去菌体除去菌体，用0.5molLKOH调pH8.5，上dowex12（酸型）树脂，水洗后用甲酸甲酸梯度洗脱梯度洗脱，在0.04molL甲酸洗脱液中收集产品，含胞二磷胆碱溶液上活性炭柱活性炭柱，丙酮-氨水溶液洗脱，减压浓缩，乙醇中结晶乙醇中结晶。（三）作用与用途（三）作用与用途胞二磷胆碱是卵卵磷磷脂脂生物合成的前前体体。当脑功能下降时，脑组织内卵磷脂含量显著减少。本本品品能能促促进进卵卵磷磷脂脂生生物物合合成成，从而改改善善脑脑循循环环和和脑脑代代谢谢，大大大大提提高患者的意识水平高患者的意识水平。临床用于减轻严重脑外伤和脑手术伴随的意识障碍，治疗帕金森氏症，抑郁症等精神疾患治疗帕金森氏症，抑郁症等精神疾患。