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1、实验五、细菌的革兰氏染色实验五、细菌的革兰氏染色与细菌的芽孢染色与细菌的芽孢染色一、实验目的及内容目的：1、复习革兰氏染色法的原理 2、初步掌握细菌的涂片方法及革兰氏染色法的步骤 3、了解细菌的芽孢染色的原理，掌握芽孢染色方法 内容：1、制作细菌的染色装片（复习简单染色的方法）2、通过革兰氏染色，确定苏云金芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌、大肠杆菌为革兰氏阴性还是阳性细菌 3、细菌的芽孢染色二、实验原理1 1、革兰氏染色原理：、革兰氏染色原理：革兰氏染色法是将所有的细菌区分为革兰氏阳性（革兰氏染色法是将所有的细菌区分为革兰氏阳性（G G）和革兰氏阴性（）和革兰氏阴性（G G）两大类，是细菌学上最常用的鉴
2、别染色法。两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物；乙醇能使它溶解，所以，染色的前二步结果是一样的，但在溶性复合物；乙醇能使它溶解，所以，染色的前二步结果是一样的，但在G G+细胞中，由于细胞壁厚、肽聚糖网层次多和交联致密，故遇脱色剂乙醇时，细胞中，由于细胞壁厚、肽聚糖网层次多和交联致密，故遇脱色剂乙醇时，因失水而网孔缩小，再
3、加上它不含类脂，故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此因失水而网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇的处理不会溶出缝隙，因此能把结晶紫和碘的复合物能把结晶紫和碘的复合物(分子太大分子太大)牢牢留在壁内，使其保持紫色。反之，牢牢留在壁内，使其保持紫色。反之，在在G G-细菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖网层薄和交联度差，遇细菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖网层薄和交联度差，遇脱色剂乙醇后，以类脂为主的外膜迅速溶解，乙醇处理不但破坏了胞壁外膜，脱色剂乙醇后，以类脂为主的外膜迅速溶解，乙醇处理不但破坏了胞壁外膜，还可能损伤肽聚糖层和细胞质膜，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫还可能损伤肽聚糖层
4、和细胞质膜，这时薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫和碘的复合物的溶出，因此细胞退成无色。当再用衬托的染色液复染时，显和碘的复合物的溶出，因此细胞退成无色。当再用衬托的染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+G+细胞，但被紫色盖没，红细胞，但被紫色盖没，红色显示不出来。色显示不出来。2、芽孢染色原理 芽孢染色法是根据细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同的染料进行染色，使芽孢和菌体呈不同颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，当用弱碱性染料孔雀绿在加热的情况下进行染色时，此染料可以进入菌体及芽孢使其着色，而进入芽孢
5、的染料则难以透出。若再复染（蕃红液），则菌体呈红色而芽孢呈绿色。四、操作步骤【一一】革兰氏染色的步骤操作革兰氏染色的步骤操作（一）制片（一）制片1 1、涂片：在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作的方法从菌种斜面挑取少量菌体、涂片：在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作的方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂片的面积大约与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂片的面积大约1 11.5cm21.5cm22 2、干燥：将涂片于室温中自然干燥、干燥：将涂片于室温中自然干燥3 3、固定：菌面朝上，通过火焰、固定：菌面朝上，通过火焰2323次固定（温度以不烫手为宜）次固定（温度以
6、不烫手为宜）（二）染色（二）染色1 1、初染：在制片上滴加结晶紫染液，染色、初染：在制片上滴加结晶紫染液，染色1 1分钟分钟2 2、水洗：倾去染色液，用水小心的冲洗、水洗：倾去染色液，用水小心的冲洗3 3、媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染、媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1 1分钟分钟4 4、脱色：将玻片倾斜，连续点滴、脱色：将玻片倾斜，连续点滴9595乙醇通过涂面，脱色乙醇通过涂面，脱色20302030秒，至流出的液体无色，立即水秒，至流出的液体无色，立即水洗洗5 5、复染：滴加番红复染、复染：滴加番红复染3535分钟分钟6 6、水洗：用水洗去涂片上的番红染色液、水洗：用水洗去涂片上的番红染色液7 7、
7、晾干：将染好的涂片放在空气中晾干或者用吸水纸吸干、晾干：将染好的涂片放在空气中晾干或者用吸水纸吸干（三）镜检（三）镜检先用低倍，再用高倍，最后用油镜进行观察先用低倍，再用高倍，最后用油镜进行观察【二二】芽孢染色的操作步骤（改良的芽孢染色的操作步骤（改良的SchaefferSchaeffer和和FultonFulton氏染色法）氏染色法）1 1、制备菌液：加、制备菌液：加1212滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑滴无菌水于小试管中，用接种环从斜面上挑取取2323环菌体于试管中，并充分混匀，制成粘稠的菌液环菌体于试管中，并充分混匀，制成粘稠的菌液2 2、加染色液：加、加染色液：加5%5%的孔雀
8、绿饱和水溶液的孔雀绿饱和水溶液2323滴于小试管中，用接滴于小试管中，用接种环搅拌使燃料与菌液充分混匀种环搅拌使燃料与菌液充分混匀3 3、加热：将此试管浸入沸水浴中加热、加热：将此试管浸入沸水浴中加热15201520分钟分钟4 4、涂片：用接种环从试管底部挑取数环菌液于洁净的载玻片上，、涂片：用接种环从试管底部挑取数环菌液于洁净的载玻片上，做成涂面，晾干做成涂面，晾干5 5、固定：将涂片通过酒精灯火焰、固定：将涂片通过酒精灯火焰3 3次次6 6、脱色：用水洗，直至流出的水中无孔雀绿的颜色为止、脱色：用水洗，直至流出的水中无孔雀绿的颜色为止7 7、复染：加番红水溶液染色、复染：加番红水溶液染色5
9、 5分钟，倾去染色液，不用水洗，直接分钟，倾去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干用吸水纸吸干8 8、镜检：先用低倍镜，再用高倍镜，最后用油镜观察、镜检：先用低倍镜，再用高倍镜，最后用油镜观察五、注意事项五、注意事项1 1、涂片均匀，切忌过厚、涂片均匀，切忌过厚2 2、在染色过程中，不可使染液干涸；沸水加热时，更要注意不、在染色过程中，不可使染液干涸；沸水加热时，更要注意不能使染料干涸能使染料干涸3 3、脱色时间十分重要，不可过长也不可过短、脱色时间十分重要，不可过长也不可过短4 4、菌种注意菌龄（菌体既有大量芽孢而未完全脱落）、菌种注意菌龄（菌体既有大量芽孢而未完全脱落）5 5、要得到满意的涂面，首先要制备浓稠的菌液，其次在从小试、要得到满意的涂面，首先要制备浓稠的菌液，其次在从小试管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取管中取染色的菌液时，应先用接种环充分搅拌，然后再挑取菌液，否则菌体沉于管底，涂片的菌体太少菌液，否则菌体沉于管底，涂片的菌体太少6 6、先用擦镜纸将油镜上的油擦去；再用擦镜纸沾少许的二甲苯、先用擦镜纸将油镜上的油擦去；再用擦镜纸沾少许的二甲苯将镜头擦将镜头擦2323次；最后用干净的擦镜纸将镜头擦次；最后用干净的擦镜纸将镜头擦2323次，擦次，擦拭的方向要一致拭的方向要一致