《核酸类药物.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《核酸类药物.ppt（93页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第五章第五章 核酸类药物核酸类药物n1868年瑞士青年生化学家米歇尔(Miescher)，在用胃蛋白酶分解细胞蛋白质的时候，发现酶不能分解细胞核。经过化学分析，细胞核主要是由含磷的物质构成的，它的性质又不同于蛋白质，起名叫核素，20年以后，人们发现这种物质是强酸，改称为核酸核酸。n德国生化学家科赛尔科赛尔(Kossel)第一个系统地研究了第一个系统地研究了核酸的分子结构核酸的分子结构，从核酸的水解物中，分离出一些含氮的化合物，命名为腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶，科赛尔因此获得了1910年的诺贝尔医学与生理学奖。核酸类药物n约经过半个世纪，生化学家托德(Todd)把3个“元件”比较简单的碎片
2、，相互连接组合起来，称核苷核苷酸酸，再小心地把各种核苷酸连结起来，而获得了获得了1957年的诺贝尔化学奖年的诺贝尔化学奖。n英国物理学家克里克(Crick)和美国生化学家沃森(Watson)则划时代地提出核酸分子模型，揭开了研究核酸的崭新序幕。核酸类药物n此外，21世纪人类基因组的创建，也将预示着核酸研究与应用的新的里程碑的到来。以此为契机，蛋白质组学，基因组学得到了迅速发展，基因芯片，质谱，2D电泳技术得到了广泛应用。n世界各国对核酸的研究和应用是非常活跃的，新的发现一个接一个的涌现出来，应用于临床的核酸及其衍生物类生化药物愈来愈多，并初步形成了核酸生产工业。对制药来说，可以利用合成核糖核酸
3、的方法来研究、设计、生产治疗多种严重疾病的新生化药物。核酸类药物核酸类药物n依据核酸类药物及其衍生物的依据核酸类药物及其衍生物的化学结构和组成化学结构和组成分四分四大类：大类：碱基及其衍生物碱基及其衍生物 核苷及其衍生物核苷及其衍生物 核苷酸及其衍生物核苷酸及其衍生物 多核苷酸多核苷酸 一、核酸碱基及其衍生物一、核酸碱基及其衍生物一、核酸碱基及其衍生物一、核酸碱基及其衍生物n多数是经过人工化学修饰的碱基衍生物。经过人工化学修饰的碱基衍生物。n主要有赤酮嘌呤(Eritadenine)、硫代鸟嘌呤(Thioguanine)、巯嘌呤(Mercap-topurine)、氯嘌呤(Choropurine)
4、、乳清酸、氟胞嘧啶(Flucytosine)、氟尿嘧啶等。二、核苷及其衍生物二、核苷及其衍生物二、核苷及其衍生物二、核苷及其衍生物依据形成核苷的碱基或核糖的不同分为：依据形成核苷的碱基或核糖的不同分为：腺苷类：腺苷类：有腺苷、肌浸膏、核脉通、腺苷甲硫氨酸(SAM)、辅酶型维生素B12(Co-B12)、腺苷二醛、巯苷、嘌呤霉素(Puromycin)尿苷类：尿苷类：有尿苷、氮杂尿苷(Azauridine)、碘苷、氟苷、溴苷胞苷类：胞苷类：有环胞苷(Cyclo-C)、氟环胞苷(AAFC)、氮杂胞苷(Azacyti-dine)肌苷类：肌苷类：有肌苷、肌苷二醛(IDA)、异丙肌苷(Inosiplex)脱
5、氧核苷类：脱氧核苷类：有氮杂脱氧胞苷(5-Aza-2-deoxycytidine)、脱氧硫鸟苷、三氟胸苷三、核苷酸及其衍生物三、核苷酸及其衍生物三、核苷酸及其衍生物三、核苷酸及其衍生物单核苷酸类：单核苷酸类：有腺苷酸(AMP)、尿苷酸(UMP)、肌苷酸(IMP)、环腺苷酸(cAMP)、双丁酰环腺苷酸(DBC)、辅酶A(CoA)等；核苷二磷酸类：核苷二磷酸类：有尿二磷葡萄糖(UDPG)、胞二磷胆碱(CDP-Choline)等；核苷三磷酸类：核苷三磷酸类：有腺三磷(ATP)、胞三磷(CTP)、尿三磷(UTP)、鸟三磷(GTP)等；核苷酸类混合物：核苷酸类混合物：有5-核苷酸、2，3-核苷酸、脱氧核
6、苷酸、核酪等。四、多核苷酸四、多核苷酸四、多核苷酸四、多核苷酸二核苷酸类：二核苷酸类：有辅酶I(CO)、辅酶(CO)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)等；多核苷酸类：多核苷酸类：有聚肌胞苷酸(Poly I：C)、聚腺尿苷酸(PolyA：U)、转移因子(TF)、核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、核酸等。依据核酸类药物及其衍生物的依据核酸类药物及其衍生物的性质和功能性质和功能分两类：分两类：n一类为具有一类为具有天然结构天然结构的核酸类物质，缺乏这类物的核酸类物质，缺乏这类物质会使机体代谢失调，发生病态，提供这类物质，质会使机体代谢失调，发生病态，提供这类物质，有助于改善机体的物质代谢和能量
7、平衡，加速受有助于改善机体的物质代谢和能量平衡，加速受损组织的修复损组织的修复.n临床上已广泛应用于放射病、血小板减少症、白细胞减少症、慢性肝炎、心血管疾病等。n属于这一类的核酸药物有ATP、辅酶A、脱氧核苷酸、CTP、UTP、腺苷、混合核苷酸、辅酶I等。n第二类为天然碱基、核苷、核苷酸第二类为天然碱基、核苷、核苷酸结构类似物或聚结构类似物或聚合物，合物，这一类核酸类药物是当今人类治疗病毒、肿这一类核酸类药物是当今人类治疗病毒、肿瘤、艾滋病等的重要手段，也是产生干扰素、免疫瘤、艾滋病等的重要手段，也是产生干扰素、免疫抑制的临床药物。抑制的临床药物。n已经在临床上应用的抗病毒核苷酸类药物有以下一
8、些品种：氮杂鸟嘌呤、巯嘌呤、6一氯嘌呤、氟胞嘧啶、氟尿嘧啶、呋喃氟尿嘧啶、氟苷、阿糖胞苷、环胞苷、肌苷二醛、异丙基苷、脱氧巯鸟苷、环腺苷酸、聚肌胞等。反义核酸技术（简称反义技术）反义核酸技术（简称反义技术）n利用这一技术研制的药物称为反义药物，根据核酸杂交原理，反义药物能与特定基因杂交，在基因水平干扰致病蛋白的产生过程，及干扰遗传信息从核酸向蛋白质的传递。n传统药物主要是直接作用于致病蛋白本身，而反义药物则作用于产生蛋白的基因，因此可广泛应用于多种疾病的防治。反义核酸作为药物与常规药物相比有两个显著特点：反义核酸作为药物与常规药物相比有两个显著特点：n有关疾病的靶基因mRNA序列是已知的，因此
9、，设计合理特异性的反义核酸比较容易；n反义寡核苷酸与靶基因能通过碱基配对原理发生特异和有效的结合，从而调节基因的表达。它的缺点是天然的寡核苷酸难以进入细胞内，而一旦进入又易被胞内核酸酶水解，很难直接用于治疗。nFomivirsen是全球批准上市的第一个反义药物，1998年已被美国FDA批准上市，用于二线治疗AIDS所致的巨细胞病毒(CMV)视网膜炎。核酸疫苗（又称基因疫苗或基因免疫）核酸疫苗（又称基因疫苗或基因免疫）n是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导人动物细胞内，并通过宿主细胞的转录系统合成抗原蛋白质，诱导宿主产生对该抗原蛋白质的免疫应答以达到防病治病的目的。n核酸疫苗D
10、NA疫苗为目前尚无满意疗法的某些疾病(如慢性病毒性肝炎、疟疾、艾滋病)提供一种新的治疗途径。核酸类药物核酸类药物一、理化性质一、理化性质nRNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。nDNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。核酸类药物n相对分子质量在100万以上的DNA在水中为l0g/L以上时，呈黏性胶体溶液。n在酸性溶液中，DNA、RNA和核苷酸分子上的嘌呤易水解下来，分别成为具有游离糖醛基的无嘌呤核酸和磷酸酯。在中性或弱碱性溶液中较稳定。核
11、酸类药物nDNA、RNA在生物细胞内都与蛋白质结合成核蛋白。DNA蛋白在低浓度盐溶液中几乎不溶解，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至1mol/L氯化钠中的溶解度很大，比纯水高2倍。n相反，RNA蛋白在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在0.14mol/L氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时，常用此法分离这两种核蛋白。核酸类药物nDNA、RNA和核苷酸既有磷酸基又有碱性基，故为两性电解质，在一定的pH条件下，可以解离而带有电荷，因此，都有一定的等电点，能进行电泳电泳。n核酸由于酸性较强，能与Na+、K+、Mg2+等金属离子结合成盐，也易与碱性化合物结合成复合物，如能与甲苯胺蓝、派罗红、甲基绿等碱性
12、染料结合，其中甲基胺蓝能使RNA和DNA均染上蓝色，派罗红专染RNA成红色，甲基绿专染DNA成绿色。核酸类药物n应用较广的菲锭溴红菲锭溴红(或称溴乙锭)荧光染料，简称EB，可插入到核酸碱基对之间，与双链的DNA以及具有双链螺旋区的RNA有特异的结合能力，使EB核酸络合物的荧光强度比游离EB显著增加，达80100倍。n因此，在一定的条件下，一定浓度的EB溶液的荧光增量与核酸双链区的浓度成正比。根据这个原理，可测定双链核酸的浓度，灵敏度高达0.01g/ml。核酸类药物n核酸具有旋光性旋光性，旋光方向为右旋，由于核酸分子的高度不对称，故旋光性很强，这是核酸的一个重要特性，比组成它的核苷酸的比旋值要大
13、得多。n当核酸变性时，比旋值大大降低。二、核酸的变性二、核酸的变性n核酸和蛋白质一样有变性现象，在一定条件下受到某些物理或化学因素的作用，会发生变性，如二级结构改变，氢键断裂，碱基的规律堆积破坏，双螺旋松散成为二条缠绕的无定形多核苷酸链，从螺旋向无规则卷曲从螺旋向无规则卷曲(或称线团或称线团coil)转变转变。n核酸变性时，先局部双螺旋松散，解旋，然后整个双螺旋松散解旋，当变性条件继续时，则2条链脱解而分离成不规则卷曲的单链，但一级结构不一级结构不发生破坏。发生破坏。核酸类药物n引起变性的因素变性的因素有加热、氢离子浓度变化、变性试剂如尿素、胍和某些有机溶剂等。n变性后的核酸生物活性丧失，物化
14、性状改变，如黏度下降，沉降系数增加，比旋度值降低以及紫外光吸收能力显著增加(即增色效应)等。n热变性是核酸的重要性质。热变性是核酸的重要性质。当核酸稀溶液加热到某一狭窄温度范围时，会发生分子融解和螺旋向线团转变的现象，这时的温度称为融解温度或解链温度，用用Tm表示表示。n在Tm时，表现出260nm的光吸收值急剧上升的增色效应、比旋度值显著降低和黏度下降等现象。通常DNA的Tm是增色效应达4050时的温度，RNA的Tm为增色效应达3040时的温度。nTm大小与大小与DNA的碱基组成有关。的碱基组成有关。G-C之间的氢键联系要比A-T之间的氢键联系强得多，故G-C含量高的DNA其Tm值亦高。核酸类
15、药物nDNA双螺旋的2条链，经变性分离后，在一定条件下可以重新组合复原，这是以互补的碱基排列顺序为基础的，可以用来进行分子杂交分子杂交，即不同来源的多核苷酸链，变性后分离，经“退火”处理，若有互补的碱基排列顺序，就能形成杂合的双螺旋体，甚至可以在DNA和RNA之间形成杂合螺旋体。n当两种不同来源的DNA分子杂交时，形成双螺旋的倾向愈强，说明它们分子之间碱基顺序的互补性愈强。可以利用分子杂交方法来分离纯化分离纯化DNA基因，基因，研究基因转录和调控研究基因转录和调控等。三、核酸的颜色反应三、核酸的颜色反应nDNA和RNA经酸水解后，嘌呤易脱下形成无嘌呤的醛基化合物，或水解得到核糖和脱氧核糖，这些
16、物质与某些酚类、苯胺类化合物结合成有色物质，可用来作定性分析或根据颜色的深浅作定量测定。n孚尔根染色法孚尔根染色法是一种对DNA的专一染色法，基本原理是DNA的部分水解产物能使已被亚硫酸钠退色的无色品红碱(Schiff试剂)重新恢复颜色。用显微分光光度法可定量测定颜色强度。核酸类药物n核酸中糖的颜色反应是利用苔黑酚苔黑酚(3，5-二羟甲苯)法，将含有核糖的RNA与浓盐酸及3，5-二羟甲苯一起于沸水浴中加热2040min左右，产生绿色化合物。这是由于RNA脱嘌呤后的核糖与酸作用生成糠醛，再与3，5-二羟甲苯作用而显蓝绿色。n脱氧核糖用二苯胺法脱氧核糖用二苯胺法测定。DNA在酸性条件下与二苯胺一起
17、水浴加热5min，产生蓝色，这是脱氧核糖遇酸生成-羟基-酮基戊醛，再与二苯胺作用而显现的蓝色反应。核酸类药物四、核苷酸的解离性质四、核苷酸的解离性质n核苷酸由磷酸、碱基和核糖组成，为两性电解质，在一定pH条件下可解离而带有电荷，这是电泳和离子交换法分离各种核苷酸的重要依据。各种核苷酸分子上可解离的基团有氨基、烯醇基和第氨基、烯醇基和第1、第第2磷酸基磷酸基。n由于烯醇基的pK值常在9.5以上，一般不适用于核苷酸分离，但氨基和第1、2磷酸基是很重要的。第1磷酸基解离的pK值在0.71之间，第2磷酸基团的pK值在6左右。磷酸基的解离主要可以使核苷酸带负电荷，但不能用来作为分离的依据。核酸类药物n氨
18、基解离则能不同，在pH 2.55范围内，所带净电荷差异较大，在电泳和离子交换法分离核苷酸电泳和离子交换法分离核苷酸时起着决定性的作用。n例如在pH 3.5时，各核苷酸上氨基的正电荷离子化程度分别为CMP 0.84，AMP 0.54，GMP 0.05，UMP为零。各核苷酸的第1磷酸基完全解离，各带一个负电荷，结果UMP、GMP、AMP、CMP所带净负电荷依次为1、0.95、0.46和0.16。因此，在pH 3.5条件下进行电泳可将这4种核苷酸分开，电泳速度的大小顺序为UMPGMPAMPCMP。五、核苷酸的紫外吸收性质五、核苷酸的紫外吸收性质n由于核酸、核苷酸类物质都含有嘌呤、嘧啶碱，都具有共轭双
19、键，故对紫外光有强烈的吸收。在一定的pH条件下，各种核苷酸都有特定的紫外吸收的吸光度值。n当定性测定某一未知碱基或核苷酸样品时，可在250、260、280、290nm波长处先测得吸光度值，再计算出相应的比值(A250nm/A260 nm、A280nm/A260nm、A290 nm/A260 nm)，与已知核苷酸的标准比值比较，判断出属于哪一种碱基或核苷酸。n核酸是由数10个到数10万个核苷酸连接而成的高分子化合物。它是生物遗传的物质基础，与生物的生长、发育、繁殖、遗传和变异有密切关系，又是蛋白质合成不可缺少的物质。n核酸的改变可引起一系列性状和功能的变化，核酸的改变可引起一系列性状和功能的变化
20、，如恶性肿瘤、遗传性疾病等都与核酸生物功能改变有关。从20世纪50年代开始，大量的研究表明，核酸及其核酸及其降解物、衍生物具有良好的治疗作用，降解物、衍生物具有良好的治疗作用，因而迅速发展起来成为一大类生化药物。核酸类药物核酸类药物n核酸组成中的碱基嘌呤化合物和嘧啶化合物都有较好的抗肿瘤作用，阻断蛋白质、核酸的生物合成，抑制癌细胞的增殖。n由于干扰或作用于核酸的代谢过程，故被称为核故被称为核酸抗代谢药物酸抗代谢药物。临床试用已达30种以上。核酸类药物n巯嘌呤(6-巯基嘌呤、乐疾宁)是嘌呤抗代谢物、次黄嘌呤类似物，在体内转变成6-巯基嘌呤核苷酸，阻止肌苷酸转变为腺苷酸、黄嘌呤核苷酸，抑制CoI的
21、生物合成；也能竞争性地抑制次黄嘌呤转变为肌苷酸，阻止鸟嘌呤转变为鸟苷酸，从而抑制了RNA和DNA合成，杀伤各期增殖细胞。临床用于急性白血病，效果儿童优于成人。n核苷及其衍生物治疗病毒病核苷及其衍生物治疗病毒病呈现令人鼓舞的希望。n阿糖胞苷在体内转变为阿糖胞苷酸，抑制DNA聚合酶，阻止胞二磷(CDP)转变为脱氧胞二磷(dCDP)，干扰DNA病毒繁殖，降低疱疹哆炎患者死亡率和神经损伤，是目前治疗威胁人类生命的病毒病的首创药物，也用于治疗急性粒细胞白血病等。n碘苷(碘去氧尿苷，疱疹净)为胸苷酸的抗代谢物，阻断胸腺嘧啶进入DNA，从而抑制肿瘤细胞DNA的合成，抑制腺病毒、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等DN
22、A病毒的复制。n腺苷、肌苷、尿苷、核苷酸、脱氧核苷酸、双丁酰环腺苷酸、胞二磷胆碱、核苷三磷酸(ATP、CTP、UTP、GTP)等核酸的有关组分及衍生物，是天然的代谢激活剂，有助于改善机体的物质代是天然的代谢激活剂，有助于改善机体的物质代谢和能量代谢，谢和能量代谢，加速受损组织的修复，促使病态细胞、缺氧组织恢复正常生理功能。n临床广泛用于放射病、血小板减少、急慢性肝炎、白细胞减少、心血管疾病等。n核苷酸(腺苷酸、尿苷酸)都是构成细胞核酸的主要成分之一。n腺苷酸是体内能量传递物质，比腺三磷稳定，又具有显著的扩张末梢血管和降压作用，适用于肝病、瘙痒、静脉曲张性溃疡并发症。尿苷酸参与肝解毒物质葡萄糖醛
23、酸苷的生物合成，用于治疗肝炎，改善冠心病、风湿性关节炎、白细胞减少症患者的自觉症状。n辅酶A是体内乙酰化反应的辅酶，是调节糖、脂肪及蛋白质代谢的重要因子，特别是对促进乙酰胆碱的合成，降低血中的胆固醇，增加肝糖原的积存有着重要作用。n用于治疗动脉硬化、脂肪肝、各种肝炎等，与腺三磷、辅酶I、细胞色素C合用，临床效果更好。核酸类药物n腺三磷、鸟三磷、胞三磷都参与机体的能量代谢，腺三磷、鸟三磷、胞三磷都参与机体的能量代谢，是是“能源库能源库”。n腺三磷应用最广泛，对于生物体的组织生长、修补、再生、能源供给等起着密切作用，可改善各种器官的功能状态，提高细胞的活动能力，增强机体抗病能力，临床主要用于心脏疾
24、病、肌肉萎缩性疾病、脑出血后遗症等。核酸类药物n多核苷酸类药物多核苷酸类药物的治疗效果正引起人们的重视。实验证实，肿瘤细胞摄取完整的正常细胞大分子RNA后，可使肿瘤细胞的功能形态向正常细胞分化转化。n免疫核糖核酸免疫核糖核酸(iRNA)、转移因子转移因子都能转移细胞免疫反应，提高机体对病毒和肿瘤的免疫能力，临床治疗肿瘤、病毒感染等疾病均取得较好疗效。核酸类药物iRNAn免疫核糖核酸的作用是推动正常的RNA分子，在基因水平上通过对癌细胞DNA分子进行诱导或通过反转录酶系统促使癌细胞发生逆分化，相对分子质量为135 000，比转移因子大，既可传递细胞免疫性又可传递体液免疫性，也称传递免疫信息的RN
25、A。没有明显的抗原性和种属特异性，可将动物iRNA用于人。n初步发现猪肝对改善肝癌患者主观症状和肝功能、保护血相有一定的作用，对可疑早期肝癌、肝硬化效果显著。核酸类药物niRNA制剂来自三个方面：从正常人白细胞中分离；肿瘤邻近局部淋巴结中分离；异种肿瘤中分离。n我国、美国等正在扩大临床。iRNA在体内易被其酶分解而失效，解决的办法是用病人的白细胞，在体外与iRNA共同孵化再输回体内，或与核糖核酸酶抑制剂合用。n免疫核糖核酸(iRNA)是用人的肿瘤细胞(自身或他人具有相同组织类型的肿瘤细胞)作为抗原，免疫动物，然后取其脾、淋巴结及肝脏等分离出致敏的淋巴细胞，提取其中的核糖核酸。niRNA能在体内
26、或体外诱导正常、非免疫的淋巴细胞产生特异性抗体或细胞免疫反应。n这种从致敏动物淋巴细胞或组织提取的具有传递特这种从致敏动物淋巴细胞或组织提取的具有传递特异免疫性的核糖核酸，称为免疫核糖核酸异免疫性的核糖核酸，称为免疫核糖核酸(iRNA)。iRNA特点特点n(1)能传递特异性的体液与细胞免疫。n(2)对核糖核酸酶(RNase)敏感，对脱氧核糖核酸酶(DNase)有抵抗。对热不稳定。n(3)多数学者认为iRNA无抗原性。n(4)其化学组成为核糖核酸(RNA)。n(5)产生iRNA的细胞是巨噬细胞和淋巴细胞。n(6)制备iRNA的动物有羊、猴及人等。n(7)iRNA可在异种动物间传递，无种属特异性。
27、n(8)iRNA免疫信息的传递，具有器官特异性。如肺未分化癌的iRNA，只能对另一机体的肺未分化癌起传递免疫信息的作用。iRNA作用机制作用机制n特异性抗原被巨噬细胞吞噬后，激活了巨噬细胞中的DNA片断，并在这些DNA的指导下(模板)转录出相应的RNA，这种RNA可以在淋巴细胞之间传递有关这种抗原的信息。核酸类药物n这种iRNA进入未致敏的淋巴细胞，使这些细胞致敏产生相应的免疫能力，使B淋巴细胞活化，产生各种免疫球蛋白。nT淋巴细胞活化，形成直接杀伤靶细胞的效应T细胞，一旦遇到相应抗原则释放淋巴因子如淋巴毒素类、巨噬细胞趋化因子、巨噬细胞移动抑制因子、促分裂因子、转移因子，IL-2等。nT、B
28、细胞相互依存又相互制约，T细胞产生的淋巴因子对肿瘤细胞有杀伤作用，体液免疫中的去封闭因子有利于T细胞对肿瘤的杀伤。细胞毒抗体在补体参与下可以杀伤相应的瘤细胞。核酸类药物核酸类药物n1974年Pilch等试用iRNA治疗肿瘤患者，观察了恶性黑色素瘤15例，2例DNCB(二硝基氯苯)皮试反应增强，5例淋巴细胞毒作用增强；20例肾癌患者，对已转移者的存活时间有所延长。n对10例黑色素瘤术后10周患者用iRNA治疗，以每周4毫克的剂量治疗，随访18个月未见复发并且细胞免疫指标增强。核酸类药物转移因子转移因子n是自致敏T细胞中提取的一种不耐热、可透性物质，含有双螺旋RNA或多核苷酸、多肽复合物，相对分子
29、质量小于10 000，也称免疫反应可溶性因子。对多种抗原的细胞免疫，是从一个机体传递给另一机体，为一种继承性免疫。n它只传递细胞免疫，无体液免疫作用，不致促进肿瘤的生长，治疗恶性肿瘤比较安全。核酸类药物聚肌胞苷酸聚肌胞苷酸n为双链多聚肌苷酸、多聚胞苷酸的简称，是一种迄今最有效的、人工合成的高效干扰素诱导剂、广谱抗病毒生化药物。可调整机体的免疫能力，具有抗病毒、抗肿瘤、增强淋巴细胞免疫功能、抑制核酸代谢等作用。n注入人体后诱导产生干扰素，使正常细胞产生抗病毒蛋白(AVF)，干扰病毒繁殖，保护未受感染细胞免受感染。临床试用于肿瘤、血液病、病毒性肝炎等多种病毒感染性疾病。核酸类药物核酸类药物n 在一
30、些生物材料中，除含有核酸外，还有许多如磷蛋白、糖类、磷酯、核苷酸类辅酶和游离核苷酸等杂质。要避免干扰，必须去掉杂质才能准确测定核酸含量。n因此，样品必须预处理。核酸类药物n一般先要将生物组织细胞在低温下磨碎成匀浆，然后用冰冷的稀三氯乙酸或10g/L(1)的高氯酸在低温下抽提几次，离心，去上清液，即去掉了酸溶性小分子物质，如含磷化合物、糖、氨基酸、核苷酸、辅酶等。n沉淀为蛋白质、核酸、脂类、多糖等，再用有机溶剂(乙醇、乙醚、氯仿等)抽提去掉脂溶性的磷脂等物质，残余物为不溶于酸的非脂化合物，主要成分是DNA、RNA、蛋白质和少量磷化物。n再进一步用酸和碱分别处理，测定DNA和RNA。核酸类药物核酸
31、类药物一、酸处理法一、酸处理法n经预处理后的核酸样品，用50g/L(5)三氯乙酸或60g/L(6)高氯酸在90下提取15min，DNA和RNA都成为酸溶性物提取出来，用定糖法分别测定DNA和RNA含量。该法简便快速，但没有把DNA和RNA分开，干扰因素多，不十分准确。核酸类药物二、碱处理法二、碱处理法n经预处理的核酸样品，用温热(37)的稀碱液(10.3mol/L氢氧化钾或氢氧化钠)保温18h，使RNA降解为酸溶性的单核苷酸，而DNA则不发生降解。然后用酸中和，再用三氯乙酸或高氯酸：进行酸化，使来自RNA的核苷酸存于上清液中，DNA却随大量蛋白质一起沉淀下来，离心，分离测定DNA和RNA含量。
32、核酸类药物n如上清液中存在有无机磷和其他磷化物，可将无机磷酸盐加以沉淀后测定或测定酸溶性上清液的总磷量和无机磷量，以总磷量减去无机磷量即为RNA的磷量。n此法的优点是能把RNA和DNA分开，分别测定磷、糖，再用紫外法测定RNA和DNA的含量。核酸类药物n根据元素分析知道，纯RNA及其核苷酸一般含磷量为9%，DNA及其核苷酸含磷量为9.2，即每100g核酸中含有99.2g的磷，也就是说核酸质量为磷量的11倍左右，当定量测定核酸时，每测得1g磷相当于11g的核酸。n此法准确性强，灵敏度高，最低可测到5g/ml的核酸，可作为紫外法和定糖法的基准方法。核酸类药物n常用的测定无机磷法测定无机磷法是先用浓
33、硫酸将核酸、核苷酸中的有机磷氧化成无机磷，然后与钼酸铵定磷试剂作用，产生蓝色的钼蓝，在一定的范围内，其颜色深浅与磷酸含量成正比关系。在660nm处比色测定吸光度，从磷的标准曲线得到样品中含磷量，便可求出核酸含量。第五节第五节 核酸类物质的制备核酸类物质的制备n核酸及其衍生物类药物，属天然、大分子、结构复杂的，多采用生物材料为原料的提取法提取法制造。n衍生物，小分子、结构简单的，多采用化学合化学合成法成法制造。一、一、RNA的提取与制备的提取与制备 n一般是先把组织捣碎，制成组织匀浆，用0.14mol/L氯化钠溶液提取，把细胞质中的核糖核蛋白提取出来，留下含有DNA的细胞核物质，调节pH4.5，
34、沉淀核糖核蛋白，再将RNA与蛋白质分开。1乙醇沉淀法乙醇沉淀法n将核糖核蛋白溶于碳酸氢钠溶液中，用含少量辛醇的氯仿长时间连续地振荡多次，除去蛋白质，RNA留在水溶液中，加入乙醇使RNA以钠盐的形式沉淀下来。n或用乙醇变性核糖核蛋白，以100g/L氯化钠溶液提取RNA，再用2倍量的乙醇沉淀RNA。2盐酸胍和去污剂分离法盐酸胍和去污剂分离法n在2mol/L盐酸胍溶液中38时，大部分蛋白质溶解，再冷至0左右，RNA便从溶液中沉淀出来，将RNA与蛋白质分离，但是，蛋白质常除不净，要用氯仿法进一步提纯。n用去污剂，如十二烷基硫酸钠除蛋白质是一种最好的方法。3酚法酚法n利用含水的酚溶液沉淀蛋白质和DNA，
35、经离心得到含有RNA和多糖的水相，再将水相加入乙醇，沉淀出RNA和多糖，沉淀溶于磷酸缓冲液中，然后用2-甲氧基乙醇提取RNA，透析，再用乙醇沉淀RNA。这是制取未降解RNA的最常用而且效果最好的方法。n后来改进的酚法，加入皂土吸附蛋白质、核酸酶等杂质，即皂土酚法皂土酚法，此法所制备的RNA活力比酚法高，稳定性也增加了。核酸类药物n工业生产上，主要采用啤酒酵母、面包酵母、酒精酵母、白地霉和青霉菌等为原料制备RNA。由于酵母和白地霉含丰富的RNA，含DNA则很少，不须特地去分离，RNA又容易提取，故是制备RNA的好材料。n从酵母和白地霉中制备RNA的方法有稀碱法、浓稀碱法、浓盐法和自溶法盐法和自溶
36、法，即先使RNA从细胞中释放出来，再进行提取、沉淀和纯化。n例如，以酵母为原料，先用10g/L氢氧化钠在25左右处理坚韧的胞壁，使之变性，RNA从胞内释放出来，然后用6mol/L盐酸中和到pH7，RNA溶于水中，再加热到90100，破坏分解核酸的酶，迅速冷却到10以下，除去蛋白质和菌体残渣沉淀，RNA留在清液中。利用核酸在等电点时的溶解度最小的性质，调节pH22.5，低温放置，使RNA从溶液中沉淀下来，离心收集即得RNA。提取时间短，成本低，收率约45(以干酵母质量计算)。n采用浓盐液的方法是由于高浓度的盐溶液既能改变采用浓盐液的方法是由于高浓度的盐溶液既能改变酵母胞壁的通透性，又能有效地解离
37、核蛋白成核酸酵母胞壁的通透性，又能有效地解离核蛋白成核酸和蛋白质，使和蛋白质，使RNA释放出来。释放出来。n在含100g/L(10)干酵母的水溶液中，加入氯化钠，使其质量浓度达到80120g/L(812)，加热90提取34h，离心去菌渣，上清液冷却到6以下，调节pH22.5，静止34h充分沉淀RNA，再用乙醇洗涤，去掉脂溶性杂质和色素，即得白色RNA，收率3以上。此法所得为变性RNA及部分降解的RNA。n所用碱或盐的浓度，随菌的种类和综合利用的要求而不同。n提取时，应避免在3070停留较长时间，防止磷酸单酯酶和磷酸二酯酶降解大分子RNA，变成小分子片段而无法沉淀，影响收率；n加热到90保持34
38、h，除了可使核蛋白中蛋白质解离外，同时也能把酶破坏，有助于大分子RNA的提取。二、二、DNA的提取与制备的提取与制备 n通常在组织捣碎后用0.14mol/L氯化钠液，反复洗涤除去RNA，再进行DNA蛋白质的提取。也可采用0.1mol/L氯化钠和0.05mol/L枸橼酸钠混合液代替0.14mol/L氯化钠液，这样的盐液浓度不变，而枸橼酸根离子可以抑制DNase对DNA的降解破坏作用。nDNA蛋白质在0.14mol/L的氯化钠溶液中溶解度最低，RNA蛋白质溶解度较大，可从沉淀物中洗去RNA蛋白质等杂质，DNA蛋白质仍留在沉淀物中。核酸类药物n将沉淀物溶于生理盐水，加入去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)
39、溶液，其溶液由稀变黏稠，DNA与蛋白质解离开来，蛋白质变性，冷藏过夜。再加入氯化钠使溶液浓度达到lmol/L，溶液黏稠度下降，这时DNA溶解，蛋白质等杂质沉淀，离心除去，得乳白状清液，过滤后加入等体积95冷乙醇，有白色纤维状DNA析出，即DNA粗制品。再用去污剂精制，进一步去掉蛋白质等杂质，以95乙醇沉淀DNA，如此反复数次，可得较纯的DNA。n当DNA中含有少量的RNA时，可用核糖核酸酶、异丙醇等处理，用活性炭柱层析以及利用在电场内DNA与RNA不同的流动速度等进行分离。三、核苷酸的制备三、核苷酸的制备1水解核酸法水解核酸法n核酸经酶、酸、碱水解生成核苷酸，然后分离提取制备各种核苷酸的方法通
40、称水解核酸法水解核酸法。n由于所用催化剂的不同，分为酶水解、酸水解和酶水解、酸水解和碱水解碱水解等。（1）酶解法）酶解法n常用的酶有桔青霉产生5-磷酸二脂酶磷酸二脂酶或红酵母产生3-磷酸二脂酶磷酸二脂酶。n由于酶的产生菌不只产生单一的酶，使用时要严格控制条件。如桔青霉A.S，3.2788，水解RNA或DNA变成5-核苷酸。没有碱基专一性，作用于磷酸二酯键C-3位置上，即从链的3-羟基端开始逐个切下5-核苷酸，当链的5-端带有磷酸单酯，3-端为羟基时作用最快。n还有用牛胰核糖核酸酶(RNaseA)、蛇毒磷酸二酯酶(VPDase)、脾磷酸二酯酶(SPDase)等。核酸类药物n应用5-磷酸二酯酶水解
41、核酸可制备各种核苷酸，再用核苷酸进一步生产ATP、CoA、UTP和胞二磷胆碱等许多种生化药物。n菌体细胞内的磷酸二酯酶，可专一地作用于菌体自身的核酸，使之水解产生单核苷酸，再从胞内渗透出来。n如可自溶的酵母，在酸性条件下自溶生成3-核苷酸，在碱性条件下生成5-核苷酸。谷氨酸产生菌含RNA量较高，一般达710，用2湿菌体在pHl0和60-65条件下处理20min，即发生菌体自溶，故称自溶法自溶法。(2)碱水解碱水解n在稀碱条件下，RNA容易水解得到2-核苷酸和3-核苷酸。RNA分子中核苷酸之间是以3-5酯键连接的，水解后似乎不应产生2-核苷酸。实际上这是由于稀碱水解过程中，先形成一个中间环状物2
42、，3-环状核苷酸，它很不稳定，进一步水解生成2和3核苷酸。n稀碱水解的浓度随温度和作用时间的不同而异。用lmol/L氢氧化钾或氢氧化钠在80下作用lh能使RNA水解成单核苷酸；用0.3mol/L氢氧化钾或氢氧化钠在37下作用，要16h；用0.1mol/L氢氧化钾或氢氧化钠在100下作用，20min就可以使RNA水解成单核苷酸。n在同样的稀碱条件下，DNA虽变性，但不会被水解成单核苷酸，这是因为DNA的脱氧核糖2位上无羟基，没有形成环状物的可能。生产上用RNA制备2及3-核苷酸。(3)酸水解酸水解n在酸性条件下，DNA、RNA都不稳定，嘌呤碱易水解下来。用lmol/L盐酸在100下加热1h，能把
43、RNA水解成嘌呤碱和嘧啶核苷酸的混合物。2发酵法发酵法n可利用微生物发酵法微生物发酵法直接获得核苷酸。n例如将谷氨酸棒状杆菌和产氨短杆菌人工诱变后，分别选育出产肌苷酸的265和926菌种，为腺嘌呤营养缺陷型。由于在核酸的合成途径中缺少了一个酶，使肌苷酸(IMP)不能进一步合成AMP，因而发酵液中大量累积IMP，可分离提取制备IMP。3、酶促合成法、酶促合成法n即利用生物体的酶系统和模拟生物体的条件制备核苷酸。如酶促磷酸化法生产ATP；光合磷酸化法是在离体条件下利用植物叶中的液绿体（通常用菠菜叶），把光能转变成高能磷酸键，固定在ADP上，使ADP形成ATP。4、提取法、提取法n利用动植物和微生物
44、为原料，提取核苷酸。n例如从兔肌肉中提取ATP，从酵母或白地霉中提取辅酶A等。核酸类药物核酸类药物一、核苷酸的制备一、核苷酸的制备1、酶解法制备核苷酸、酶解法制备核苷酸 n我国从60年代开始使用核酸酶P1降解核糖核酸生产单核苷酸。n日本年产呈味核苷酸（肌苷酸和鸟苷酸）3000吨，其中60%是使用酶解法生产的。2、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（、双酶法生产肌苷酸和鸟苷酸（IG）n呈味核苷酸的主要品种是肌苷酸钠和鸟苷酸钠，商品名简称为（IG），用核酸酶P1降解RNA可获得GMP和AMP，其中AMP经脱氨生成IMP。双酶法生产（I G）工艺。3、菌体自溶法生产核苷酸、菌体自溶法生产核苷酸n磷酸二酯酶在合
45、适的条件下降解细胞内的RNA可产生5-核苷酸。在国内用谷氨酸产生菌体自溶法生产5-核苷酸。4、碱水解法生产、碱水解法生产2，3-混合核苷酸混合核苷酸nRNA结构中的磷酸二酯键对于碱性条件不稳定，很容易生成2，3-环状磷酸酯，此环状磷酸酯对碱更不稳定，加水分解生成2，3-混合核苷酸。n从RNA水解成2，3-核苷酸的降解率达95以上，将2，3-混合核苷酸制成每片含50100mg的片剂，经临床使用，对非特异性血小板减少症、对白血球减少症、癌肿的化疗和放疗后的升白血球均有较好疗效。5、半合成法制备核苷酸、半合成法制备核苷酸n由于发酵法生产核苷的产率很高，核苷悬浮于磷酸三甲酯或磷酸三乙酯中，在冷却条件下
46、加入氯化氧磷，进行磷酸化，从核苷生成5-核苷酸收率可达90%。二、核苷的制备二、核苷的制备1、RNA化学水解法制备核苷化学水解法制备核苷 RNA经甲酰胺化学水解制备核苷2、发酵法生产核苷、发酵法生产核苷 发酵法生产核苷是近代发酵工程领域中的杰出成果，产率高，周期短，控制容易，产量大。用发酵法生产各种核苷的菌株有着许多共同特点：它们都使用磷酸单酯酶活力很强的枯枯草草芽芽孢孢杆杆菌菌或短小芽抱杆菌或短小芽抱杆菌为诱变出发菌株；它们都是通过使用物理或化学诱变方法选育出在遗传性状上具有特定标记的诱变菌诱变菌；它们在发酵培养时必须提提供供限限量量的的生生长长因因素素，并且好氧，在某一特定的范围内累积大量
47、核苷。三、叠氮胸苷（三、叠氮胸苷（Azidothymidine，AZT）1、结构与性质、结构与性质 AZT是1987美国FDA批准的治疗艾滋病的新药。AZT的药理作用是人体内经磷酸化后生成了3-叠氮-2-脱氧胸腺嘧啶核苷酸，后者取代了正常的胸腺嘧啶核苷酸参与病毒DNA的合成，含有AZT成份的DNA不能继续复制，从而达到阻止病毒增殖的目的。2、生产工艺、生产工艺 此合成路线的起始原料是胸苷，目前主要是从DNA水解法制备，由于原料来源少，合成路线较复杂，成本很高。四四、聚聚 肌肌 胞胞 苷苷 酸酸（聚聚 肌肌 胞胞）（Poyinosinic，Polycytidylic Acid，Poly1：C）（
48、一）结构与性质（一）结构与性质n1967年美国人Field发现聚肌胞是干扰素诱导物，而且具有广谱抗病毒作用。本品是人工合成的干扰素诱导剂，系由多聚肌苷酸和多聚胞苷酸组成的双股多聚核苷酸。n本品可溶于0.85氯化钠溶液。（3）固固定定化化多多核核苷苷酸酸磷磷酸酸化化酶酶：将将分分离离纯纯化化的的酶酶液液滴滴加加入入冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核苷酸磷酸化。冰浴中的载体，得到共价结合的固定化多核苷酸磷酸化。（二）生产工艺（二）生产工艺70年代中期我国开始研制聚肌胞，其生产工艺如下：1、底物、底物5-核苷二磷酸吡啶盐的制备核苷二磷酸吡啶盐的制备5-核苷酸（核苷酸（5-肌苷酸或肌苷酸或5-胞苷酸）胞苷酸）5-核苷二磷酸吡啶盐核苷二磷酸吡啶盐（即（即CDP吡啶盐，吡啶盐，IDP吡啶盐）吡啶盐）2、固定化多核苷酸磷酸化酶的制备、固定化多核苷酸磷酸化酶的制备3、Poly I：C制备制备（1）底物预处理：CDP吡啶盐转成锂盐，IDP转成钠盐。（2）酶促反应：在磷酸液冲液中溶解，等摩尔Poly I与Poly C混合，生成产品。（三）作用与用途（三）作用与用途 本品具有抗病毒，抗肿瘤，增强淋巴细胞免疫功能和抑制核酸代谢等作用。本品注入人体诱导产生干扰素。临床已试用于肿瘤、血液病、病毒性肝炎及痘类毒性感染等多种疾患。