[高三理化生]培养基.ppt

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1、实验三实验三 常用培养基的制备、灭菌与常用培养基的制备、灭菌与消毒消毒实验目的：了解培养基的配制原理实验目的：了解培养基的配制原理 并且掌握配制培养基的一般方法和步骤并且掌握配制培养基的一般方法和步骤 培培养养基基是是人人工工配配制制的的，适适合合微微生生物物生生长长繁繁殖殖或或产产生生代代谢谢产产物物的营养基质的营养基质原则原则:目的明确目的明确;营养协调营养协调;控制控制pHpH、渗透压等条件、渗透压等条件;经济节约经济节约方法：查阅文献方法：查阅文献;精心设计精心设计;试验比较试验比较 步骤：称量、熔化、调步骤：称量、熔化、调PHPH、过滤、分装、过滤、分装、加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌

2、检查加塞、包扎、灭菌、冷却、无菌检查 培养基种类培养基种类:一、按成份的不同划分一、按成份的不同划分 天然培养基、合成培养基、半合成培养基天然培养基、合成培养基、半合成培养基二、按培养基的物理状态划分二、按培养基的物理状态划分 固体培养基、液体培养基、半固体培养基固体培养基、液体培养基、半固体培养基三、按培养基用途划分三、按培养基用途划分 基基础础培培养养基基、加加富富培培养养基基、鉴鉴别别培培养养基基、选选择择培培养基养基 牛肉膏蛋白胨培养基n牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。其配方如下：最普通的细菌基础培养基。其配方如下：n牛肉

3、膏牛肉膏5g5g，蛋白胨，蛋白胨10g10g，NaCl5gNaCl5g，琼脂，琼脂151520g20g，水，水1000mL1000mL，pH7.0pH7.07.2(7.2(后调后调)高氏1号培养基n高氏高氏1 1号培养基是用于分离和培养放线菌的号培养基是用于分离和培养放线菌的合成培养基。其配方如下：合成培养基。其配方如下：n可溶性淀粉可溶性淀粉20g20g，KNOKNO3 3 1g 1g，NaClNaCl 0.5g 0.5g，K2HPOK2HPO4 43H3H2 2O 0.5gO 0.5g，MgSOMgSO4 47H7H2 2O 0.5gO 0.5g，FeSOFeSO4 47H7H2 2O 0

4、.01gO 0.01g，琼脂，琼脂151520g20g，水，水1000mL1000mL，pH7.4pH7.47.67.6。查氏合成培养基n查氏合成培养基是用来分类和培养霉菌的查氏合成培养基是用来分类和培养霉菌的培养基培养基,其配方如下：其配方如下：nNaNO3 3g,KNaNO3 3g,K2 2HPOHPO4 4 1g,1g,KClKCl 0.5g,0.5g,MgSO MgSO4 4.7H.7H2 2O 0.5g,FeSOO 0.5g,FeSO4 4 0.01g,0.01g,蔗糖蔗糖 30g,30g,水水1000mL,pH1000mL,pH自然自然麦芽汁培养基n用来培养酵母菌用来培养酵母菌,干

5、麦芽粉加干麦芽粉加4 4倍水倍水,在在50-50-6060保温糖化保温糖化3-43-4小时，使用碘液试验检查小时，使用碘液试验检查,至糖化完全为止至糖化完全为止,调整糖液浓度调整糖液浓度,煮沸后，煮沸后，过滤，调过滤，调pHpH为为6.06.0。消毒与灭菌消毒与灭菌消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体消毒：消灭病原菌和有害微生物的营养体灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。灭菌：杀灭一切微生物的营养体，芽胞和孢子。方法：方法：物理的方法：加热、过滤、辐射物理的方法：加热、过滤、辐射化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破化学的方法：用化学试剂抑制或杀灭微生物。主要破坏细菌代谢机能。如

6、重金属离子，磺胺类药物及抗坏细菌代谢机能。如重金属离子，磺胺类药物及抗生素等生素等。加热法：加热法：干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌干热法：火焰灼烧灭菌和热空气灭菌1、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管、火焰灼烧适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，试管口和瓶口，涂布用玻璃棒。口和瓶口，涂布用玻璃棒。2、热空气灭菌利用高温干燥空气（、热空气灭菌利用高温干燥空气（160170）加热灭菌）加热灭菌12h，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，适用于玻璃器皿和培养皿等。原理加热使蛋白质变性，与水的含量有关，当环境和细胞含水量越大，凝固越快。与水的含量有关，当环境和细胞含

7、水量越大，凝固越快。3、注意事项：、注意事项：1）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；）培养基、橡胶制品、塑料制品不能用此法；2）温度控制在）温度控制在180 ；3）物品不能太挤；）物品不能太挤；4）温度降至）温度降至70 时才开箱门。时才开箱门。湿热法湿热法 ：原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，原理：因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。热好。高压蒸汽灭菌法：高压蒸汽灭菌法：1 1、设备：高压灭菌锅、设备：高压灭菌锅2

8、2、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有、时间长短根据灭菌物品的种类和数量不同有所变化。所变化。3 3、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，、适用于培养基、工作服、橡胶物品等的灭菌，也可用于玻璃器皿的灭菌。也可用于玻璃器皿的灭菌。4 4、注意事项：、注意事项：1 1）冷空气彻底排除；）冷空气彻底排除；2 2）加水；）加水；3 3）压力降为）压力降为“0”0”时方可打开时方可打开。n在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，所以，气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压，

9、所以，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，当水蒸气中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。含空气蒸气的温度低于饱和蒸气的温度。灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见度的关系见表表2 常压蒸汽灭菌常压蒸汽灭菌：对对于于不不宜宜用用高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌的的培培养养基基如如明明胶胶培培养养基基、牛牛乳乳培培养养基基，含含糖糖培培养养基基等等可可采采用用此此法法。彻彻底底灭灭菌菌则则采采用间歇灭菌方法。用间歇灭菌方法。煮沸灭菌法：煮沸灭菌法：适用注射器和解剖器皿，时间适用注射器和解剖器皿，时间101015min15min，超高温杀

10、菌超高温杀菌 135-150C135-150C和和2-8s2-8s对牛乳和其它液态食品对牛乳和其它液态食品灭菌灭菌。优点优点 ：保持食品价值和营养成分。保持食品价值和营养成分。过滤除菌：过滤除菌：原理原理：介质在有压力时阻隔微生物。：介质在有压力时阻隔微生物。适用范围适用范围：许多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。：许多材料如血清、抗生素及糖溶液采用此法。设备设备：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。：蔡氏过滤器，滤膜过滤器。优缺点优缺点：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。：不破坏培养基成分，只适用少量滤液。注意事项注意事项：1 1、压力适当；、压力适当；2 2、无菌条件下进行；、无菌条件下进行；3 3

11、、防止渗透现象。、防止渗透现象。辐射灭菌：辐射灭菌：原理：原理：紫外线波长在紫外线波长在200200300nm300nm，具有杀菌作用，以具有杀菌作用，以265-266265-266杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可杀菌力强。此段波长易被细胞中核酸吸收；可产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成产生臭氧和过氧化氢。杀菌效力与强度和时间的乘积成正比。正比。缺点：缺点：穿透力不大。距照射物穿透力不大。距照射物1.2m1.2m为宜。为宜。应用：应用：无菌室，医院。无菌室，医院。注意事项：注意事项：对眼睛和皮肤有刺激作用。对眼睛和皮肤有刺激作用。化学药品灭菌：化学药品灭菌：原理：原理：应

12、用化学制剂破坏细菌代谢机能。应用化学制剂破坏细菌代谢机能。杀菌剂如重金属离子；杀菌剂如重金属离子；抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。抑菌剂如磺胺类及多数抗生素。注意：注意：与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类与药品的浓度高低，时间长短，微生物种类以及微以及微 生物所处的环境有关。生物所处的环境有关。常用化学杀菌剂有：常用化学杀菌剂有：乙醇、醋酸、石碳酸乙醇、醋酸、石碳酸 福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等福尔马林、升汞、高锰酸钾、新洁尔灭等 分分离离与与纯纯化化：从从混混杂杂的的微微生生物物群群体体中中获获得得只只含含某一种或某一株微生物的过程。某一种或某一株微生物的过程。为为什什么么要要进进行

13、行纯纯培培养养：平平板板上上的的单单一一菌菌落落并并不不一定保证是一种菌。一定保证是一种菌。常常用用的的分分离离、纯纯化化方方法法：单单细细胞胞挑挑取取法法、稀稀释释涂布平板法稀释混合平板法、平板划线法涂布平板法稀释混合平板法、平板划线法 实验四 微生物的分离、纯化及培养技术稀释涂布平板法稀释涂布平板法 ：步步骤骤：1 1、倒倒平平板板：牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨培培养养基基，高高氏氏I I号号培培养养基基，查查氏氏培培养养基基冷冷却却至至55-6055-60时时，混混匀匀后后倒倒平平板板，牛牛肉肉膏膏蛋蛋白白胨胨培培养养基倒基倒4 4皿，高氏皿，高氏I I号培养基和查氏培养基各倒号培养基和查氏

14、培养基各倒3 3皿。皿。2 2、制制备备污污水水稀稀释释液液：10g10g土土样样，加加入入90ml90ml无无菌菌水水中中，在在三三角角瓶瓶中中振振摇摇20min20min。取取0.5ml 0.5ml 加加入入盛盛有有4.5ml4.5ml无无菌菌水水的的试试管管中中，以此类推，制成不同稀释度。以此类推，制成不同稀释度。3 3、涂涂布布：将将上上述述每每种种培培养养基基平平板板底底面面标标记记稀稀释释度度，然然后后用用无无菌菌吸吸管管从从最最后后三三种种稀稀释释度度，即即1010-4-4、1010-5-5和和1010-6-6的的试试管管中中吸吸取取0.1ml0.1ml对号放入平板上，用玻棒涂布

15、。对号放入平板上，用玻棒涂布。4 4、培培养养：高高氏氏I I号号和和查查氏氏倒倒置置培培养养于于2828培培养养箱箱中中培培养养3-3-5days5days，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在3737培养培养1-2days1-2days。5 5、挑菌落：转至斜面，检查是否一致，保存。挑菌落：转至斜面，检查是否一致，保存。平板划线法：平板划线法：1 1、倒倒平平板板，标标记记培培养养基基名名称称，编编号号和和实实验日期。验日期。2 2、划线方法、划线方法 稀释混合平板法稀释混合平板法 ：1 1、先加菌、先加菌2 2、倒平板时注意培养基温度、倒平板时注意培养基温度3 3、混合均匀、

16、混合均匀 微生物培养技术微生物培养技术1 1、斜面接种、斜面接种2 2、液体培养基接种、液体培养基接种3 3、穿刺接种、穿刺接种将已接种的斜面、半固体和液体培养基放置培将已接种的斜面、半固体和液体培养基放置培养箱中培养将生长好的菌种用牛皮纸包好，养箱中培养将生长好的菌种用牛皮纸包好，置置44冰箱中保存。冰箱中保存。观察菌落形态并记录序号序号 来源来源 大小大小 形状形状 边缘边缘 颜色颜色 表面表面 代谢物代谢物 种类种类实验五：放线菌及霉菌形态观察实验五：放线菌及霉菌形态观察目的要求目的要求1.1.了解放线菌、霉菌的形态观察的原理。了解放线菌、霉菌的形态观察的原理。2.2.学习并掌握观察放线

17、菌、霉菌形态的操作方学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法。法。3.3.初步了解放线菌、霉菌的形态特征。初步了解放线菌、霉菌的形态特征。放线菌是一群丝状，放线菌是一群丝状，G G+的细菌，在气生菌的细菌，在气生菌丝末端形成孢子。丝末端形成孢子。细胞壁主要成分是肽聚糖，最适细胞壁主要成分是肽聚糖，最适pHpH与细菌与细菌相似。主要以孢子方式进行无性繁殖。相似。主要以孢子方式进行无性繁殖。其其DNA DNA 碱基组成中碱基组成中GCGC含量特别高。超过任含量特别高。超过任何已知的细菌。何已知的细菌。许多临床应用的抗生素都由链霉菌种产生。许多临床应用的抗生素都由链霉菌种产生。放线菌放线菌(Acti

18、nomycetes)分生孢子丝分生孢子丝琼脂表面琼脂表面基内菌丝基内菌丝气生菌丝气生菌丝The cross section of an actinomycete colony showing the substrate mycelium（基内菌丝）基内菌丝）and aerial mycelium（气生菌丝）气生菌丝）with chains of conidiospores（分生孢子）分生孢子）分生孢子丝分生孢子丝琼脂表琼脂表面面基内菌丝基内菌丝气生菌丝气生菌丝The cross section of an actinomycete colony showing the substrate my

19、celium（基内菌丝）基内菌丝）and aerial mycelium（气气生菌丝）生菌丝）with chains of conidiospores（分生孢子）分生孢子）n放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成放线菌生长到一定阶段，大部分气生菌丝分化成孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢孢子丝，通过横割分列的方式产生成串的分生孢子。孢子丝形态多样，有直、弯曲、钩状、螺旋子。孢子丝形态多样，有直、弯曲、钩状、螺旋状、轮生等多种形态。孢子也有球形、椭圆形、状、轮生等多种形态。孢子也有球形、椭圆形、杆状和瓜子状等等。它们的形态构造都是放线菌杆状和瓜子状等等。它们的形态构造都是放线菌分类鉴

20、定的重要依据。分类鉴定的重要依据。放线菌的菌落早期绒状同放线菌的菌落早期绒状同细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、细菌菌落月牙状相似，后期形成孢子菌落呈粉状、干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。干燥，有各种颜色呈同心圆放射状。链链霉霉菌菌的的各各种种孢孢子子丝丝结结构构链霉菌的分离链霉菌的分离：pH中性偏碱 喜干（含水少）采用含各种无机盐的选择性培养基已知放线菌能够产生500多种抗生素。大多数抗生素对不同的细菌有独特的疗效有50多种被实际应用Antibiotics放线菌放线菌Actinomycetes 霉菌霉菌 (molds)(molds)n是是丝状真菌的总称丝状真菌的总称,即即“发霉的真

21、菌发霉的真菌”。通常指菌。通常指菌丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。常丝体比较发达而又不产生大型子实体的真菌。常在潮湿的气候下大量生长繁殖。在潮湿的气候下大量生长繁殖。形态特征（形态特征（Morphological Morphological characteristics characteristics）n属异养型真核生物，具有丝状或管状结构，单个分支称为菌丝。菌丝形成的网络状结构称为菌丝体。n营养菌丝（vegetative mycelium）：汲取营养n气生菌丝（aerial mycelium）n繁殖菌丝:孢子丝，进行繁殖。分类（分类（classificationclassifica

22、tion）n有隔菌丝：有隔菌丝中有横隔膜将菌丝分隔成多个细胞，在菌丝生长过程中细胞核的分裂伴随着细胞的分裂，每个细胞含有一至多个细胞核。横隔膜可以使相邻细胞之间的物质相互沟通。如曲霉和青霉。n无隔菌丝：菌丝中无横膈膜，整个细胞是一个单细胞，菌丝内有许多核，在生长过程中只有核的分裂和原生质体质量的增加，没有细胞数目的增多。如毛霉和根霉。(1)nonseptate(2)septate繁殖方式n无性繁殖：无性繁殖：芽生孢子节孢子孢囊孢子后垣孢子分生孢子n有性繁殖：有性繁殖：卵孢子接合孢子子囊孢子Sporangiospores 孢囊孢子（Sporangiospores are formed withi

23、n a sporangium）节孢子Arthrospores分生孢子分生孢子ConidiosporesConidiospores卵孢子（卵孢子（OosporesOospores）antheridiumoospheresoosporesoogoniumOospores formation接合孢子接合孢子 ZygosporesZygospores接合孢子接合孢子形成过程形成过程子囊孢子子囊孢子 AscosporesAscospores几种常见霉菌属主要特征分布作用与用途根霉属菌丝无隔,单细胞迅速蔓延,有假根,孢子囊呈黑色,产生孢子囊和接合孢子常长在淀粉类食品上如馒头、面包、甘薯等能将淀粉转化为糖，

24、用于生产糖化酶，酿造甜酒等曲霉属菌丝分隔，分生孢子梗顶端膨大，顶囊上生辐射状小梗菌落疏松、颜色多样空气、谷物、土壤和各种有机物上分解淀粉和蛋白质能力强，用于制曲、制醋、生产柠檬酸、酶制剂及糖化饲料等青霉属菌丝分隔，孢子梗呈扫帚形，菌落由紧密到疏松，多呈蓝绿色空气、土壤及物品上，腐烂的柑橘上更多青霉素产生菌，也用于制备农用抗生素和发酵饲料根霉 根霉的形态结构曲霉曲霉曲霉的形态结构左侧分生孢子梗具有一层小梗；右侧分生孢子梗具 有二层小梗 青霉青霉 青霉的形态结构 A单轮型 B非对称型 C对称二轮型实验内容n人们设计了各种培养和观察方法，人们设计了各种培养和观察方法，这些方法的主要目的是为了尽可能这

25、些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌和霉菌自然生长状态下保持放线菌和霉菌自然生长状态下的形态特征。本实验采用插片法。的形态特征。本实验采用插片法。n插片法插片法:倒平板倒平板插片插片接种接种培养培养镜镜检检记录绘图记录绘图 n压印法压印法:倒平板倒平板划线接种划线接种挑取菌落挑取菌落加盖玻片加盖玻片镜检镜检记录绘图记录绘图n埋片法埋片法:倒琼脂倒琼脂切槽切槽接种接种培养培养镜镜检检记录绘图记录绘图 n倒平板倒平板 将培养基熔化后，倒将培养基熔化后，倒10-1210-12毫升左右于灭菌培养皿毫升左右于灭菌培养皿内，凝固后使用内，凝固后使用.n插片插片 将灭菌的盖玻片以将灭菌的盖玻片以4545度

26、角插入培养皿内的培养基度角插入培养皿内的培养基中，插入深约为中，插入深约为1/21/2或或1/31/3。n 接种与培养接种与培养 用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，用接种环将菌种接种在盖玻片与琼脂相接的沿线，放置放置2828培养培养3 37 7天。天。n 观察观察 培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用培养后菌丝体生长在培养基及盖玻片上，小心用镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的镊子将盖玻片抽出，轻轻擦去生长较差的一面的菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压菌丝体，将生长良好的菌丝体面向的载玻片，压放于载玻片上。直接在显微镜下观察。放于载玻片上。直接在显微镜下观察。关键

27、步骤及注意事项n倒平板要厚一些，接种时划线要密。倒平板要厚一些，接种时划线要密。n插片时要有一定角度并与划线垂直。插片时要有一定角度并与划线垂直。n观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。适当视野，更换高倍镜观察。n如果用如果用0.1%0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会更好。色后观察，效果会更好。实验六、菌种保藏 几种常用的保藏方法：几种常用的保藏方法：1 1、传代培养法、传代培养法 保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基保藏的菌种通过斜面、穿刺或疱肉培养基（用于厌氧细菌）培养好后，置（用于厌氧细

28、菌）培养好后，置4C4C冰箱中存放冰箱中存放，定期进行传代培养、再存放。，定期进行传代培养、再存放。可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌可用胶塞代替棉塞或在斜面上覆盖一层无菌液体石蜡来进一步延长保存期。液体石蜡来进一步延长保存期。2 2、载体法、载体法 使生长合适的微生物吸附在一定的载体上使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。进行干燥。常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠和滤纸片等。麸皮、磁珠和滤纸片等。3 3、悬液法、悬液法 将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。将细菌、酵母菌细胞悬浮在一定的溶液中保存。溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸

29、缓冲液、食盐水等。溶液包括蒸馏水、糖溶液、磷酸缓冲液、食盐水等。4 4、冷冻法、冷冻法 使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低使菌种始终存放在低温环境下的保藏方法。包括低温法和液氮法。温法和液氮法。此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。注意控制降温此法关键是要克服细胞的冷冻损伤。注意控制降温速率及保护剂的使用。速率及保护剂的使用。5 5、真空干燥法、真空干燥法 这类方法包括冷冻真空干燥法和这类方法包括冷冻真空干燥法和L L干燥法。干燥法。冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温冷冻真空干燥法是将要保藏的微生物样品先经低温预冻，然后在低温状态下进行减压干燥。预冻，然后在低温状态下进行减压干燥

30、。L-L-干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持干燥法则不需要低温预冻样品，只是使样品维持在在101020C20C范围内进行真空干燥。范围内进行真空干燥。操作方法操作方法 1 1、斜面保藏法、斜面保藏法 将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待将菌种转接在适宜固体斜面培养基上，待其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好其充分生长后，用牛皮纸将棉塞部分包扎好（棉塞换成胶塞效果更好），置（棉塞换成胶塞效果更好），置4C4C冰箱中包冰箱中包藏。藏。保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放保藏时间依微生物的种类而定。霉菌、放线菌及芽线菌及芽孢菌孢菌保存保存2 24 4个月移种一次，酵母菌个月移种一次，酵母菌

31、间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周间隔两个月，普通细菌一个月，假单胞菌两周传代一次。传代一次。此法优此法优点点是操作简单、使用方便，缺点是是操作简单、使用方便，缺点是保藏时间短、易被污染。保藏时间短、易被污染。2 2、液体石蜡保藏法、液体石蜡保藏法 将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，将无菌石蜡加在已长好菌的斜面上，其用量以高出斜面顶端其用量以高出斜面顶端1CM1CM为准，使菌种为准，使菌种与空气隔绝。与空气隔绝。将试管直立，置低温或室温下保存。将试管直立，置低温或室温下保存。此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、此法实用且效果较好。霉菌、放线菌、芽孢菌可保藏两年以上，酵母菌可保藏芽孢菌可保藏两

32、年以上，酵母菌可保藏1 12 2年，普通细菌也可保藏年，普通细菌也可保藏1 1年左右。年左右。3 3、穿刺保藏法、穿刺保藏法 按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好按穿刺接种方式培养菌种，菌种长好后用胶塞封严，置后用胶塞封严，置44冰箱存放。冰箱存放。4 4、砂土管保藏法、砂土管保藏法（1 1）河砂处理）河砂处理 取河砂若干加入盐酸取河砂若干加入盐酸10%10%，加热煮沸，加热煮沸30min30min除去除去有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最有机机质。倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用后一次用蒸镏水冲洗，烘干后用4040目筛子过筛，弃去目筛子过筛，弃去粗颗粒

33、，备用。粗颗粒，备用。（）土壤处理（）土壤处理 取取非非耕耕作作层层不不含含腐腐殖殖质质的的痩痩黄黄土土或或红红土土，加加自自来来水水浸浸泡泡洗洗涤涤数数次次，直直至至中中性性。烘烘干干后后碾碾碎碎，用用100100目目筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。筛子过筛，粗颗粒部分丢掉。(3)(3)砂土混合砂土混合 处处理理妥妥当当的的河河砂砂与与土土壤壤按按3 3：1 1的的比比例例掺掺合合(或或根根据据需需要要而而用用其其他他比比例例，甚甚至至可可全全部部作作砂砂或或土土)均均匀匀后后，装装入入10 x100mm10 x100mm的的小小试试管管或或安安瓿瓿管管中中，每每管管分分装装1g1g左左右右，塞塞

34、上上棉棉塞塞，进进行行灭灭菌菌(通通常常采采用用间间歇歇灭灭菌菌2-32-3次次)，最最后烘干。后烘干。(4)(4)无菌检查无菌检查 每每1010支支砂砂土土管管随随机机抽抽1 1支支，将将砂砂土土倒倒入入肉肉汤汤培培养养基基中中，3030培培养养40h40h，若若发发现现有有微微生生物物生生长长，所所有有砂砂土土管管则则需需重重新新灭灭菌菌，再再作作无无菌菌试试验，直至证明无菌后方可使用。验，直至证明无菌后方可使用。(5)(5)菌悬液的制备菌悬液的制备 取取生生长长健健壮壮的的新新鲜鲜斜斜面面菌菌种种，加加入入2-3ml2-3ml无无菌菌水水(每每18x180mm 18x180mm 的的试管

35、斜面菌种试管斜面菌种)，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。，用接种环轻轻将菌苔洗下，制成菌悬液。(6)(6)分装样品分装样品 每每支支砂砂土土管管(注注明明标标记记后后)加加入入0 05ml5ml菌菌悬悬液液(刚刚刚刚使使砂砂土土润润湿湿为宜为宜)，用接种针拌匀。用接种针拌匀。(7)(7)干燥干燥 将将装装有有菌菌悬悬液液的的砂砂土土管管放放入入干干燥燥器器内内，干干燥燥器器底底部部盛盛有有干干燥燥剂剂。用真空泵抽干水分后火焰封口用真空泵抽干水分后火焰封口(也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口也可用橡皮塞或棉塞塞住试管口)。(8)(8)保存保存 置置44冰冰箱箱或或室室温温干干燥燥处处，每每隔隔一一

36、定定的的时时间间进进行行检检测测。此此法法多多用用于于产产芽芽孢孢的的细细菌菌、产产生生孢孢子子的的霉霉菌菌和和放放线线菌菌。在在抗抗生生素素工工业业生生产产中中应用广泛、应用广泛、效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。效果较好，可保存几年时间，但对营养细胞效果不佳。5 5、冷冻真空干燥法、冷冻真空干燥法 （1 1）冻干管的准备：中性硬制玻璃，烘干，灭菌。）冻干管的准备：中性硬制玻璃，烘干，灭菌。（2 2）菌种培养：细菌芽孢脱落；霉孢子丰满。）菌种培养：细菌芽孢脱落；霉孢子丰满。（3 3）保护剂的配制：配制，灭菌，检查）保护剂的配制：配制，灭菌，检查 （4 4）菌悬液的制备：）菌悬液的制备：2-3ml2-3ml保护剂保护剂 （5 5）分装样品：菌悬液每管）分装样品：菌悬液每管0.2ml0.2ml （6 6）预冻：程序控温仪降温预冻：程序控温仪降温 （7 7）冷冻真空干燥：）冷冻真空干燥：-50-50下下抽真空抽真空 （8 8）取出样品：轻敲松散即达标）取出样品：轻敲松散即达标 （9 9）第二次干燥：）第二次干燥：（1010）熔封）熔封 （1111）存活性检测：抽取一管进行存活性检查）存活性检测：抽取一管进行存活性检查 (12(12）保存：）保存：44保存保存