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1、Chapter7 细菌及病毒的遗传作图本章要求本章要求7.1 7.1 细菌和病毒遗传研究的意义细菌和病毒遗传研究的意义7.2 7.2 病毒的一般特性及类型病毒的一般特性及类型 7.3 7.3 噬菌体的染色体作图噬菌体的染色体作图7.4 7.4 细菌的细胞和染色体结构细菌的细胞和染色体结构7.5 7.5 细菌的染色体作图细菌的染色体作图v理解细菌和病毒在遗传研究中的优越性和意义；v掌握转化、接合、性导与转导的概念与基本原理；v掌握F-菌株、F+菌株、Hfr菌株的概念、区别和用途；v区别F因子、F因子的异同；v了解温和性噬菌体、烈性噬菌体的生活周期；v掌握原噬菌体、溶源性细菌的概念；v了解细菌和病
2、毒遗传作图的原理和基本过程。本章要求7.1 细菌和病毒遗传研究的意义7.1.1 7.1.1 细菌的培养细菌的培养7.1.27.1.2 细菌在生物进化树中的地位细菌在生物进化树中的地位7.1.37.1.3 细菌和病毒在细菌和病毒在遗传研究中的优越性遗传研究中的优越性7.1.47.1.4 细菌细菌和病毒的拟有性过程和病毒的拟有性过程7.1.1 细菌培养摇瓶培养平皿分离平皿培养7.1.2 细菌在生物进化树中的地位产烷生物盐杆菌7.1.3 7.1.3 细菌和病毒在遗传研究中的优越性细菌和病毒在遗传研究中的优越性vv繁繁殖殖世世代代所所需需时时间间短短。每每个个世世代代以以分分钟钟或或小小时时计计，如大
3、肠杆菌每如大肠杆菌每2020分钟即可繁殖一代。分钟即可繁殖一代。vv易易于于管管理理和和进进行行化化学学分分析析。用用一一支支试试管管就就可可贮贮存存数数以以百百万万计计的的细细菌菌或或病病毒毒，在在短短期期内内累累积积大大量量产产物物，为化学分析提供条件。为化学分析提供条件。vv遗遗传传物物质质较较简简单单。只只有有一一个个位位于于细细胞胞质质内内裸裸露露的的DNADNA或或RNARNA分子。分子。vv便便于于研研究究基基因因的的突突变变。细细菌菌和和病病毒毒属属于于一一倍倍体体，所所有有突变都能立即表现出来。突变都能立即表现出来。vv便便于于研研究究基基因因的的作作用用。细细菌菌可可以以生
4、生活活在在基基本本培培养养基基上上，易易于于获获得得营营养养缺缺陷陷型型，也也易易于于测测知知各各种种营营养养缺缺陷陷型型所所需要的物质，是研究基因作用的好材料。需要的物质，是研究基因作用的好材料。vv可可作作为为研研究究高高等等生生物物的的简简单单模模型型。可可以以从从微微生生物物的的研研究究中中得得到到模模型型，并并从从中中获获得得启启发发，为为开开展展对对高高等等生生物物的的遗传研究开拓思路。的的遗传研究开拓思路。7.1.4 7.1.4 细菌和病毒的拟有性过程细菌和病毒的拟有性过程vv真核生物基因分离、自由组合及连锁交换均通过有性过真核生物基因分离、自由组合及连锁交换均通过有性过程程(减
5、数分裂减数分裂受精受精)实现。细菌和病毒均属于原核生实现。细菌和病毒均属于原核生物，不存在严格意义上的有性过程。物，不存在严格意义上的有性过程。vv细菌细胞内除了染色体外还有一些寄生性细菌细胞内除了染色体外还有一些寄生性复制因子复制因子（如（如噬菌体和质粒），或叫噬菌体和质粒），或叫核外核外或或染色体外因子染色体外因子，它们可以，它们可以在细胞间传递，并且形成细菌染色体间以及细菌染色体在细胞间传递，并且形成细菌染色体间以及细菌染色体与核外遗传因子间的重组体。这种重组体结构类似于真与核外遗传因子间的重组体。这种重组体结构类似于真核生物减数分裂过程中形成的重组体结构。核生物减数分裂过程中形成的重组
6、体结构。vv拟有性过程拟有性过程引起细菌、病毒间遗传物质转移与重组引起细菌、病毒间遗传物质转移与重组的过程。的过程。拟有性过程是细菌、病毒在遗传学研究，特别是作拟有性过程是细菌、病毒在遗传学研究，特别是作为真核生物的模型研究遗传重组和基因结构的重要前提。为真核生物的模型研究遗传重组和基因结构的重要前提。7.2 病毒的一般特性及类型 7.2.1 7.2.1 病毒的一般特性病毒的一般特性7.2.2 7.2.2 病毒的类型病毒的类型7.2.3 7.2.3 噬菌体的生活周期噬菌体的生活周期7.2.1 病毒的一般特性无细胞结构无细胞结构；为蛋白质外壳包裹核而成的颗粒。；为蛋白质外壳包裹核而成的颗粒。形体
7、极微小形体极微小；只有在电子显微镜下才能观察到。；只有在电子显微镜下才能观察到。化学组成简单化学组成简单；主要是核酸和蛋白质。；主要是核酸和蛋白质。只含一种核酸只含一种核酸（DNADNA或或RNARNA）。缺乏独立代谢能力缺乏独立代谢能力（依赖宿主（依赖宿主)。繁殖方式独特繁殖方式独特；只能依赖宿主活细胞的代谢机制，通过；只能依赖宿主活细胞的代谢机制，通过核酸复制和蛋白质合成后再装配成完整的病毒颗粒的方核酸复制和蛋白质合成后再装配成完整的病毒颗粒的方式进行繁殖。式进行繁殖。具有双重存在方式具有双重存在方式；或营专性寄生在活细胞内，或在细；或营专性寄生在活细胞内，或在细胞外以大分子颗粒状态进行传
8、播。胞外以大分子颗粒状态进行传播。对干扰素敏感，而对抗生素不敏感对干扰素敏感，而对抗生素不敏感。7.2.2 病毒的类型根据宿主来划分：v细菌病毒:一般称为噬菌体（一般称为噬菌体（phagephage）v植物病毒v无脊椎动物病毒v脊椎动物病毒v亚病毒:类病毒、拟病毒、朊病毒n n类病毒：一个单链环状的裸露的类病毒：一个单链环状的裸露的RNARNA。n n拟病毒：线状单链拟病毒：线状单链RNARNA环状单链环状单链RNARNA。n n朊病毒：蛋白质颗粒。朊病毒：蛋白质颗粒。7.2.3 噬菌体的生活周期vv烈性噬菌体烈性噬菌体（virulent phagevirulent phage）噬菌体侵入宿主
9、细噬菌体侵入宿主细胞后，利用宿主细胞内的物质进行自身遗传物质和蛋白质胞后，利用宿主细胞内的物质进行自身遗传物质和蛋白质的合成，组装出许多子噬菌体，使宿主细胞裂解而释放子的合成，组装出许多子噬菌体，使宿主细胞裂解而释放子噬菌体，这类噬菌体称为烈性噬菌体。噬菌体，这类噬菌体称为烈性噬菌体。裂解周期裂解周期：吸附：吸附 侵入侵入 核酸的复制、转录与蛋核酸的复制、转录与蛋白质的生物合成白质的生物合成 装配装配 释放释放 v温和性噬菌体温和性噬菌体（temperate phagetemperate phage）原噬菌体原噬菌体（prophageprophage）某些噬菌体侵染细菌后，其某些噬菌体侵染细菌
10、后，其DNADNA整合到宿主染色体中，这种处于整合状态的噬菌体称整合到宿主染色体中，这种处于整合状态的噬菌体称为原噬菌体。为原噬菌体。溶源性细菌溶源性细菌（lysogeniclysogenic bacteria bacteria）含有原噬菌体的含有原噬菌体的宿主细菌称为溶源性细菌，或宿主细菌称为溶源性细菌，或溶源体溶源体。温和性噬菌体温和性噬菌体在噬菌体侵入后，细菌并不裂解，而是在噬菌体侵入后，细菌并不裂解，而是以原噬菌体或质粒的形式存在的一类噬菌体称为温和性噬以原噬菌体或质粒的形式存在的一类噬菌体称为温和性噬菌体。菌体。原噬菌体通过诱导（原噬菌体通过诱导（inductioninduction
11、）可转变为烈性噬菌体可转变为烈性噬菌体。诱导方式有多种，如温度改变、与非溶源性细菌的接合等。诱导方式有多种，如温度改变、与非溶源性细菌的接合等。7.3 噬菌体的染色体作图v 7.3.1 T7.3.1 T2 2噬菌体的基因重组与作图噬菌体的基因重组与作图v 7.3.2 7.3.2 噬菌体的基因重组与作图噬菌体的基因重组与作图v 7.3.3 7.3.3 基因的细微结构作图基因的细微结构作图v 7.3.4 7.3.4 互补测验和顺反测验互补测验和顺反测验v7.3.1T2噬菌体的基因重组与作图噬菌体遗传性状可分为噬菌体遗传性状可分为 噬菌斑的形态噬菌斑的形态 宿主范围宿主范围（1 1）噬菌斑突变噬菌斑
12、突变：T T噬菌体的噬菌体的r r-突变体突变体 正常噬菌体，正常噬菌体，r r+，产生的产生的菌斑小而边缘模糊菌斑小而边缘模糊 突变噬菌体，突变噬菌体，r r-，产生的产生的菌斑大两倍而边缘清晰菌斑大两倍而边缘清晰（2 2）宿主范围突变宿主范围突变：T T噬菌体的噬菌体的h h-突变体突变体大肠杆菌大肠杆菌B B株是株是T T2 2的宿主，大肠杆菌的宿主，大肠杆菌B/2B/2株对株对T2T2产生抗性产生抗性 一种发生在一种发生在T T2 2上的上的h h-突变体，能利用突变体，能利用B B和和B/2B/2株株 而而h h+只能利用只能利用B B株株n n将两种不同的将两种不同的T T2 2突
13、变体进行杂交，对其杂交子突变体进行杂交，对其杂交子代进行重组分析代进行重组分析n n杂交方法：杂交方法：n n将将B B和和B/2B/2两种大肠杆菌细胞混合两种大肠杆菌细胞混合n n同时接种高浓度的同时接种高浓度的T T2 2噬菌体的噬菌体的h h-r r+和和h h+r r-两种突变体，两种突变体，保证绝大多数细菌都被一个以上噬菌体感染保证绝大多数细菌都被一个以上噬菌体感染n n两种不同的噬菌体两种不同的噬菌体DNADNA可能在宿主细胞内进行重组，可能在宿主细胞内进行重组，从而产生从而产生非亲本型子代非亲本型子代h h+r r+和和h h-r r-。亲本型亲本型 重组型重组型接种在同时长有B
14、和B/2株的培养基上h+r-h-r+h+r-h-r+h+r+h-r-半透明,大 透明,小 半透明,小 透明,大 由于不同速溶性噬菌体的突变体在表型上不由于不同速溶性噬菌体的突变体在表型上不同，可分别写成同，可分别写成rara、rbrb、rcrc等。用等。用rxhrxh+r r+h h-可可对其进行基因定位。对其进行基因定位。7.3.1 T2噬菌体的基因重组与作图由由rxhrxh+r r+h h-实验结果（表实验结果（表7-17-1，P P137137）可知可知 RfRfra-hra-h=24%=24%RfRfrb-hrb-h=12.3%=12.3%RfRfrc-hrc-h=1.6%=1.6%，
15、据重组值可知据重组值可知3 3个个r r基因和基因和h h基因的排列方式有基因的排列方式有 rara rbrb rcrc h h rara rcrc h h rbrb rara rbrb h h rcrc rara h h rcrc rbrb又又rcrc-rbrb+rcrc+rbrb-RfRfrc-rbrc-rb=14%h=14%h位于位于rbrb 和和rcrc之间。之间。（中间两种情况都有可能，哪一个对呢？）（中间两种情况都有可能，哪一个对呢？）hrcrarbv7.3.2 噬菌体的基因重组与作图 凯泽（凯泽（KaiserKaiser，19551955）用用UVUV照射处理照射处理噬菌体，噬菌
16、体，得到得到5 5个个噬菌体的突变系：噬菌体的突变系：S S 小噬菌斑小噬菌斑 mi mi 微小噬菌斑微小噬菌斑 C C 完全清亮的噬菌斑完全清亮的噬菌斑 C0 C01 1除中央一个环其余部分都清亮的噬菌斑除中央一个环其余部分都清亮的噬菌斑 C0 C02 2比比C0C01 1更浓密的中央环噬菌斑更浓密的中央环噬菌斑n nS C0S C01 1 mi+mi+975+975S C0S C01 1 mi 924 mi 924S +30S +30+C0+C01 1 mi 32 mi 32S C0S C01 1+61+61+mi 51+mi 51S +mi 5S +mi 5+C0+C01 1+13+13
17、总数总数 209120912.9%5.3%0.86%Rf s-co1=3.76%Rf s-mi=6.16%Rf co1-mi=9.92%负干扰：在噬菌体的三点测验中发现一个单交换发生后，会增加另一个单交换发生的概率，这时干扰系数为负值，这种现象称为负干扰。1 S 3.76 C01 6.16 mi7.3.3 基因的细微结构作图：n n1、T4噬菌体r区的作图将将T T4 4噬菌体噬菌体rr区的两个不同突变型区的两个不同突变型r r1 1和和r r2 2杂交：杂交：r r1 1 +亲本型：亲本型：r r1 1+和和+r+r2 2（B B菌株上产生突变型、菌株上产生突变型、K K菌株上不长）菌株上不
18、长）+r+r2 2 重组型：重组型：+（B B菌株和菌株和K K菌株上都产生野生型）菌株上都产生野生型）和和r r1 1r r2 2（B B菌株上产生突变型、菌株上产生突变型、K K菌株上不长）菌株上不长）基因内不同位点的突变会产生不同的突变等位基因，从而产生不同的类型。将这些不同的突变体杂交，会发生基因内重组，可以计算出基因内重组的相对频率，从而确定基因内各突变位点的排列顺序和相对位置，即基因的细微结构作图。n n2、缺失作图 将突变体进行初步筛选的方法：判断突将突变体进行初步筛选的方法：判断突变发生的区域。变发生的区域。缺失：基因或染色体片段的丢失。缺失：基因或染色体片段的丢失。只能与只能
19、与a a区中的突变体杂区中的突变体杂 交才能产生野生型重组体交才能产生野生型重组体 只能与只能与c c区中的突变体杂区中的突变体杂 交才能产生野生型重组体交才能产生野生型重组体 a b c a b c 与两者都不能产生野生型与两者都不能产生野生型 重组体的突变体位于重组体的突变体位于b b区区例（例（例（例（p141p141p141p141图图图图7-137-137-137-13）7.3.4 互补测验和顺反测验n n互补作用：互补作用：两个突变型细胞的两条同源染色体同两个突变型细胞的两条同源染色体同处在一个杂合体细胞或局部合子时（二倍体或部处在一个杂合体细胞或局部合子时（二倍体或部分二倍体），
20、野生型基因补偿突变基因的缺陷而分二倍体），野生型基因补偿突变基因的缺陷而使细胞的表型恢复正常的作用。否则，两种突变使细胞的表型恢复正常的作用。否则，两种突变型一定具有相同功能型一定具有相同功能(相同基因）损伤。相同基因）损伤。属于同一基因的两个突变不能互补，互补通属于同一基因的两个突变不能互补，互补通常发生在不同基因之间的突变。常发生在不同基因之间的突变。n n顺反顺反/互补测验：互补测验：通过比较顺式和反式构型细胞的通过比较顺式和反式构型细胞的表型从而判断影响某一表型的表型从而判断影响某一表型的2 2个突变是属于等位个突变是属于等位基因内突变还是属于非等位基因间突变的测验。基因内突变还是属于
21、非等位基因间突变的测验。n n一对同源染色体上两个突变发生在同一条染色体上，基因一对同源染色体上两个突变发生在同一条染色体上，基因型为型为AB/-AB/-时称为顺式构型；若发生在两条染色体上，基时称为顺式构型；若发生在两条染色体上，基因型为因型为A-/-BA-/-B时称为反式构型。时称为反式构型。n n测验时，如果顺式为野生型，而反式为突变型，则这两突测验时，如果顺式为野生型，而反式为突变型，则这两突变发生在同一基因的不同位置；如果顺式和反式都为野生变发生在同一基因的不同位置；如果顺式和反式都为野生型，则这两突变分别发生在两个基因内。型，则这两突变分别发生在两个基因内。7.4 细菌的细胞和染色
22、体结构7.4.1 形态特征7.4.2 细菌细胞结构的特点7.4.3 细菌DNA与质粒7.4.4 细菌遗传的实验研究方法7.4.1 7.4.1 形态特征形态特征vv细菌是细菌是单细胞单细胞生物，细胞结生物，细胞结构包括细胞壁、细胞膜、细构包括细胞壁、细胞膜、细胞质和核区，部分细菌还有胞质和核区，部分细菌还有某些特殊结构，如鞭毛、伞某些特殊结构，如鞭毛、伞毛、荚膜、芽胞、气泡等；毛、荚膜、芽胞、气泡等；v生活周期短，易培养；v易获得其生化突变型；v大小不一，形态各异。常见细菌的形状有杆状、球状和螺旋状，其中以杆状最常见。7.4.2 细菌细胞结构的特点v无真正的细胞核无真正的细胞核。细菌细胞只在菌体
23、中央有一。细菌细胞只在菌体中央有一个遗传物质集中区个遗传物质集中区核区，无核膜和核仁，核区，无核膜和核仁，其功能与细胞核相当，由一个环状其功能与细胞核相当，由一个环状DNADNA分子高分子高度缠绕而成，其中央部分还有度缠绕而成，其中央部分还有RNARNA与支架蛋白，与支架蛋白，这样的核区称为这样的核区称为拟核拟核。v缺乏线粒体、叶绿体、内质网、缺乏线粒体、叶绿体、内质网、GCGC等细胞器。等细胞器。7.4.3 细菌DNA与质粒vv细细菌菌DNADNA：是是一一个个很很长长的的共共价价闭闭合合环环状状双双链链分分子子（dsDNAdsDNA），通通常常以以超超螺螺线线体体的的形形式式存存在在于于细
24、细菌菌体体内内。细细菌菌无无典典型型的的染染色色体体结结构构，没没有有组组蛋蛋白白与与DNADNA分分子子结结合合，DNADNA仅仅与与一一些些碱碱性性蛋蛋白白相相结结合合。细细菌菌DNADNA中中有有一一定定比比例例（约约1%1%）的的碱碱基基被被甲甲基基化化，其其中中以以腺腺嘌嘌呤呤居居多多，胞胞嘧嘧啶啶次次之之。细细菌菌的的遗遗传传物物质质比比较较简简单单，适适宜宜用用作作基基因结构和功能的研究。因结构和功能的研究。vv质粒质粒：细菌体内含有的一种染色体外的：细菌体内含有的一种染色体外的小型环状小型环状DNADNA。质粒实质上是一些携带着决定细菌某些遗传特性的基质粒实质上是一些携带着决定
25、细菌某些遗传特性的基因，如抗药、产毒、致病、形成芽胞、产生色素或抗因，如抗药、产毒、致病、形成芽胞、产生色素或抗生素等的基因。生素等的基因。质粒能独立于染色体存在和复制，还质粒能独立于染色体存在和复制，还能在细胞间传递能在细胞间传递。vv附加体：附加体：有些质粒能有些质粒能整合到细菌染色体中，在染色体整合到细菌染色体中，在染色体的控制下随染色体一起复制的控制下随染色体一起复制，这类质粒称为附加体，这类质粒称为附加体（episomeepisome）。）。7.4.4 7.4.4 细菌遗传的实验研究方法细菌遗传的实验研究方法培养基的类型：基本培养基（野生型）完全培养基（突变型）选择培养基（鉴定突变类
26、型）补充培养基（具体突变类型的确定）vv 细胞计数细胞计数(培养物细胞浓度培养物细胞浓度)vv 建立纯系的方法建立纯系的方法vv 选择培养法鉴定突变型与重组型选择培养法鉴定突变型与重组型vv 突变型与重组型的批量筛选方法突变型与重组型的批量筛选方法v 细胞计数细胞计数(培养物细胞浓度培养物细胞浓度)培养物中微生物计数方法是微生物学的基本实验技术，其基本思路是：对原培养物进行连续稀释；进行平板涂抹培养；由于一个细胞形成一个菌落，计数菌落数；根据稀释倍数计算原培养物中的细胞浓度。Results of the serial dilution technique and subsequent cult
27、ure of bacteriav 建立纯系的方法建立纯系的方法纯培养纯培养纯系：由单个细胞繁殖而来的菌落称为纯系。菌种纯：采用平板表面涂布法或划线法获得单株菌落。这种方法获得的纯系，称为“菌种纯”。菌株纯：利用显微操纵器进行菌丝尖端切割等方法获得单个细胞，并直接培养建立纯系，这种方法获得的纯系称为“菌株纯”。v选择培养法鉴定突变型与重组型选择培养法鉴定突变型与重组型 许多细菌的突变都与培养基营养成分及培养条件有关。许多细菌的突变都与培养基营养成分及培养条件有关。营养缺陷型的筛选、鉴定营养缺陷型的筛选、鉴定选择培养法。选择培养法。是根据菌是根据菌株在株在基本培养基基本培养基和和营养培养基营养培养
28、基上的生长表现上的生长表现差异差异将菌将菌株分为原养型株分为原养型(在基本培养基上能正常生长在基本培养基上能正常生长)与营养缺与营养缺陷型陷型(在基本培养基上不能正常生长，只能在相应的营在基本培养基上不能正常生长，只能在相应的营养培养基上生长养培养基上生长)，该方法，该方法一次只能检出一种突变型一次只能检出一种突变型。其它突变类型的筛选、鉴定其它突变类型的筛选、鉴定对于其它的突变类型对于其它的突变类型(如温度敏感型如温度敏感型)，也可以通过培养条件的选择培养来，也可以通过培养条件的选择培养来筛选与鉴定。筛选与鉴定。n n选择培养法的缺点：选择培养法的缺点：选择培养法的缺点：选择培养法的缺点：n
29、 n效率不高：一次可鉴定、筛选一种突变型效率不高：一次可鉴定、筛选一种突变型效率不高：一次可鉴定、筛选一种突变型效率不高：一次可鉴定、筛选一种突变型n n影印培养法影印培养法影印培养法影印培养法：n n黎德伯格夫妇为高效检测、分离混和群体不同突变型设计黎德伯格夫妇为高效检测、分离混和群体不同突变型设计黎德伯格夫妇为高效检测、分离混和群体不同突变型设计黎德伯格夫妇为高效检测、分离混和群体不同突变型设计了影印培养法，该方法原理与选择培养法一致了影印培养法，该方法原理与选择培养法一致了影印培养法，该方法原理与选择培养法一致了影印培养法，该方法原理与选择培养法一致n n采用影印法将完全培养基上的单菌落
30、同时接种到不同采用影印法将完全培养基上的单菌落同时接种到不同采用影印法将完全培养基上的单菌落同时接种到不同采用影印法将完全培养基上的单菌落同时接种到不同选择选择选择选择培养基培养基培养基培养基上，同时对所有菌落进行选择，提高鉴定效率上，同时对所有菌落进行选择，提高鉴定效率上，同时对所有菌落进行选择，提高鉴定效率上，同时对所有菌落进行选择，提高鉴定效率n n注意：注意：注意：注意：n n最初的培养基必须是最初的培养基必须是最初的培养基必须是最初的培养基必须是完全培养基完全培养基完全培养基完全培养基，各种突变型都能够生长，各种突变型都能够生长，各种突变型都能够生长，各种突变型都能够生长n n模板接
31、种时必须采用适当的方法如涂布或划线法，使培养模板接种时必须采用适当的方法如涂布或划线法，使培养模板接种时必须采用适当的方法如涂布或划线法，使培养模板接种时必须采用适当的方法如涂布或划线法，使培养物菌落之间分开物菌落之间分开物菌落之间分开物菌落之间分开v 突变型与重组型的批量筛选方法影印培养法（Lederberg,1952）7.5 细菌的染色体作图7.5.1 7.5.1 接合接合（conjugation)conjugation)7.5.2 7.5.2 转化转化(transformation)(transformation)7.5.3 7.5.3 性导性导(sexductionsexduction
32、)7.5.4 7.5.4 转导转导(transduction)(transduction)一个细菌细胞的DNA与另一个细菌细胞的DNA的交换与重组可以通过四种方式进行：7.5.1 接合v 接合现象的发现和证实接合现象的发现和证实v F F因子及其在杂交中的行为因子及其在杂交中的行为v 中断杂交实验作图中断杂交实验作图v接合现象的发现和证实 1946 1946年，年，J.LederbergJ.Lederberg&E.Tatum&E.Tatum 的大肠杆菌杂交试验：的大肠杆菌杂交试验：材料材料：大肠杆菌：大肠杆菌(Escherichia coliEscherichia coli)K)K1212菌株
33、的两个营菌株的两个营养缺陷型品系：养缺陷型品系：菌株菌株AA甲硫氨酸缺陷型甲硫氨酸缺陷型 metmet-和生物素缺陷型和生物素缺陷型 biobio-；菌株菌株BB苏氨酸缺陷型苏氨酸缺陷型 thrthr-和亮氨酸缺陷型和亮氨酸缺陷型 leuleu-。方法方法：将：将A A、B B两菌株混和，在基本培养基两菌株混和，在基本培养基(固体固体)上涂上涂布培养。布培养。结果结果：平板上长出原养型菌落：平板上长出原养型菌落(+)(+)。上述试验获得的原养型菌落可能产生于：上述试验获得的原养型菌落可能产生于：亲本菌株亲本菌株A A或或B B发生了发生了回复突变回复突变；两品系细胞通过培养基交换养料两品系细胞
34、通过培养基交换养料互养作用互养作用；两品系间发生了两品系间发生了转化作用转化作用；发生发生细胞融合细胞融合，形成了，形成了异核体或杂合二倍体异核体或杂合二倍体。为了验证这些原养型菌落产生的可能而进行为了验证这些原养型菌落产生的可能而进行的研究最终表明：这些解释均不成立。的研究最终表明：这些解释均不成立。结果分析回复突变可能的排除回复突变可能的排除 LederberyLederbery和和TatumTatum利用的双营养缺陷型菌株进行试利用的双营养缺陷型菌株进行试验，已基本排除验，已基本排除A A或或B B品系发生回复突变产生原养型细菌品系发生回复突变产生原养型细菌的可能。因为：的可能。因为：单
35、基因单基因回复突变的频率约为回复突变的频率约为1010-6-6；双基因双基因回复突变的频率则为回复突变的频率则为1010-12-12，频率很低。，频率很低。但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高（但试验中产生原养型菌落产生的频率非常高（1010-7-7），），因此基本可以排除回复突变的可能。因此基本可以排除回复突变的可能。互养作用及其排除互养作用及其排除试验材料 A品系：A-B+T1S(met-bio-thr+leu+T1S)；B品系：A+B-T1R(met+bio+thr-leu-T1R)。试验方法：将A、B品系混合接种在基本培养基表面，短时间后喷噬菌体T1杀死A品系，使其不能持续产生thr
36、与leu供B品系持续生长。结果：仍然出现原养型菌落。结论：表明互养并非原养型菌落出现的原因，而可能发生了遗传重组。转化作用及其排除 LederberyLederbery和和TatumTatum曾把曾把品系品系A A的的培养液经加热灭菌，加入到培养液经加热灭菌，加入到B B品品系的培养物中系的培养物中，未得到原养型，未得到原养型菌落，表明原养型菌落可能不菌落，表明原养型菌落可能不是由转化作用产生。是由转化作用产生。戴维斯戴维斯(DawisDawis,1950),1950)的的U U型管型管试验试验：结果也没有得到原养型：结果也没有得到原养型细菌。细菌。结论：结论：细胞直接接触是原养型细胞直接接触
37、是原养型细菌产生的必要条件，从而否细菌产生的必要条件，从而否定了转化的可能性。定了转化的可能性。异核体和杂合二倍体的可能性异核体和杂合二倍体的可能性 若细菌细胞发生融合，产生异核体或双杂合二倍体。这若细菌细胞发生融合，产生异核体或双杂合二倍体。这两种情况类似于二倍体生物的杂合体两种情况类似于二倍体生物的杂合体,将产生原养型菌落。将产生原养型菌落。异核体异核体：指由于细胞融合而在细胞内含有遗传组成：指由于细胞融合而在细胞内含有遗传组成 不同的两个或多个细胞核。不同的两个或多个细胞核。双杂合二倍体双杂合二倍体：是指异核体进一步发生核融合，形成二：是指异核体进一步发生核融合，形成二 倍体细胞核，核内
38、含有两种遗传物质。倍体细胞核，核内含有两种遗传物质。细菌为单倍配子体生物，异核体和二倍体只能暂存。细菌为单倍配子体生物，异核体和二倍体只能暂存。培养繁殖过程中必将发生分离，产生各种缺陷型菌落，对培养繁殖过程中必将发生分离，产生各种缺陷型菌落，对试验中得到的原养型菌落后代研究表明，试验中得到的原养型菌落后代研究表明，后代没有出现预后代没有出现预期的性状分离现象。期的性状分离现象。W.Hayes的实验（1952）链霉素处理链霉素处理A A菌菌 完全培养基培养一段时间完全培养基培养一段时间 洗涤离心洗涤离心 B B菌菌 重组体未减少重组体未减少 基本培养基基本培养基链霉素处理B菌 完全培养基培养一段
39、时间 洗涤离心 A菌 无重组体产生 基本培养基 该实验说明细菌接合过程中遗传物质的转移是单向的，即遗传物质从A株转移到了B株。v接合现象的发现和证实Hayes(1952)Hayes(1952)研究表明研究表明：大肠杆菌两种不同菌株大肠杆菌两种不同菌株(品系品系)接合过程中遗传物质的转接合过程中遗传物质的转移是移是单向单向的，从而认为大肠杆菌存在两种类型：的，从而认为大肠杆菌存在两种类型：雌性雌性与与雄性雄性，分别作为接合过程中遗传物质的，分别作为接合过程中遗传物质的受体受体与与供体供体。经过上述分析可以认为：在经过上述分析可以认为：在LederberyLederbery和和TatumTatum
40、及其及其它类似试验中，发生了一种不同于转化的遗传重组方式，它类似试验中，发生了一种不同于转化的遗传重组方式，称之为称之为接合接合。接合接合(conjugation)conjugation)：指通过细胞间的直接接触将指通过细胞间的直接接触将遗传物遗传物质从供体质从供体(donor)donor)转移到受体转移到受体(receptor)receptor)的重组过程。的重组过程。n nHayesHayesHayesHayes等进一步研究发现，等进一步研究发现，等进一步研究发现，等进一步研究发现，大肠杆菌在接合中作供体的大肠杆菌在接合中作供体的大肠杆菌在接合中作供体的大肠杆菌在接合中作供体的能力受细胞内
41、一种能力受细胞内一种能力受细胞内一种能力受细胞内一种致育因子致育因子致育因子致育因子(性因子性因子性因子性因子)，即，即，即，即F F F F因子因子因子因子控制。控制。控制。控制。n nF F F F因子的化学本质是因子的化学本质是因子的化学本质是因子的化学本质是DNADNADNADNA分子分子分子分子，可以以可以以可以以可以以自主状态存在于细胞自主状态存在于细胞自主状态存在于细胞自主状态存在于细胞质中质中质中质中或或或或整合到细菌的染色体整合到细菌的染色体整合到细菌的染色体整合到细菌的染色体上。上。上。上。n nF F F F因子可在因子可在因子可在因子可在细菌细胞间进行细菌细胞间进行细菌
42、细胞间进行细菌细胞间进行转移转移转移转移。F因子与细菌结构、生理差异vF因子及其在杂交中的行为致育因子致育因子：决定细菌雄性的是：决定细菌雄性的是染色体外的一个共价环染色体外的一个共价环状状DNADNA分子分子，称为，称为致育因子致育因子（fertility factorfertility factor），），又又称为称为F F F F因子因子或或F F质粒质粒。供体菌供体菌（雄性菌）：含有（雄性菌）：含有F F因子的细菌，因子的细菌，F F因子游离于因子游离于宿主染色体外，记为宿主染色体外，记为 F F F F+。受体菌受体菌（雌性菌）：不含有（雌性菌）：不含有F F因子的细菌，记为因子的细
43、菌，记为 F F F F。HfrHfrHfrHfr菌株菌株（高频重组菌株）：指高频重组菌株）：指 F F F F 因子整合到宿主染因子整合到宿主染色体中的菌株，其重组频率比色体中的菌株，其重组频率比 F F F F+高高10001000多倍。多倍。F因子的存在状态性性伞伞毛毛形形成成结结合合桥桥，进进而而诱诱导导F F因因子子上上traYztraYz基基因因表表达达，产产生生核核酸酸内内切切酶酶，该该酶酶在在oriToriT转转移移起起始始点点处处一一条条单单链链上上切切开开一一个个口口，供供体体DNADNA以以单单链链从从55末末端端开开始始向向受受体体转转移移，两条单链分别复制后受体内质粒
44、两条单链分别复制后受体内质粒DNADNA环化环化。F F因因子子在在宿宿主主染染色色体体上上有有许许多多特特定定的的插插入入位位点点和和方方向向，整合频率为每代整合频率为每代1010-5-51010-7-7。接接合合过过程程：细细菌菌间间接接触触接接合合管管形形成成单单链链断断裂裂单单链链DNADNA从从供供体体向向受受体体转转移移单单链链复复制制DNADNA双双链链形形成成部部分分二二倍体倍体重组交换重组交换（偶数次交换）。（偶数次交换）。vFF-v HfrF-F与F-接合 F因子的特点F细菌可以把F因子传给后代。F细菌经吖啶橙处理F因子丢失，丢失后不再出现。F可以和F杂交，而不能和F杂交。
45、F和F杂交后代皆为F，而且可以以107频率获得重组体后代。Hfr与F-接合奇偶次交换奇偶次交换 Hfr品系与F菌株的异同相同都能和F杂交。杂交都要通过接合管和受体菌相联接。高剂量链霉素处理后都不影响杂交，说明它们都是作为一种供体。不同产生重组子频率不同，HfrF104，FF107。FF后代F，HfrF后代F。F细菌经吖啶橙处理变成F，Hfr经吖啶橙处理仍为Hfr。n n中断杂交实验中断杂交实验n n19571957年年E.WollmanE.Wollman和和E.JacobE.Jacob设计完成设计完成n n将对将对链霉素敏感的链霉素敏感的HfrHfr菌株菌株与对与对链霉素有抗性的链霉素有抗性的
46、F F-菌株菌株混合培养，每隔一段时间间隔取样，然后剧烈震荡以混合培养，每隔一段时间间隔取样，然后剧烈震荡以中断杂交，分开已经紧密接合的供体和受体杂交对。中断杂交，分开已经紧密接合的供体和受体杂交对。然后将震荡后的培养物接种到含链霉素的完全培养基，然后将震荡后的培养物接种到含链霉素的完全培养基，杀死所有杀死所有HfrHfr细菌，以选择含有供体基因的抗链霉素受细菌，以选择含有供体基因的抗链霉素受体细菌。对形成菌落的体细菌。对形成菌落的F F-细胞用影印培养法测定基因型。细胞用影印培养法测定基因型。n n该方法主要根据基因转移的先后次序，该方法主要根据基因转移的先后次序，以时间为位以时间为位，求基
47、因间的遗传距离。求基因间的遗传距离。v中断杂交实验作图中断杂交实验作图(巴斯德实验室，巴斯德实验室，Elie Wolliman和和Francois Jacob)1分钟20%的重组值+直接计算ade与lac之间的重组值7.5.2 转化v转转化化（transformationtransformation）：指指某某些些细细菌菌（或或其其它它生生物物）能能通通过过其其细细胞胞膜膜摄摄取取周周围围介介质质中中的的DNADNA片片段段，并并将将此此外外源源DNADNA片片段段整整合合到到自自己己染色体组中的过程。染色体组中的过程。非感受态细胞外源DNA被洗掉了转化因子感受态细胞外源DNA仍与细胞结合整合
48、吸收两种核酸内切酶：切外源DNA为约14kb的片段使外源DNA片段变为单链吸附洗涤v整整合合：供供体体单单链链DNADNA进进入入受受体体细细胞胞后后与与受受体体染染色色体体的的某某一一部部分分联联会会，并并进进一一步步置置换换受受体体的的对对应染色体区段的过程。应染色体区段的过程。vv实例实例vv转化的过程转化的过程vv转化在遗传分析中的应用转化在遗传分析中的应用基础知识基础知识n n野生型肺炎双球菌菌落野生型肺炎双球菌菌落为为光滑型光滑型，一种突变型，一种突变型为为粗糙型粗糙型，两者根本差，两者根本差异在于荚膜形成异在于荚膜形成n n荚膜的主要成分是多糖，荚膜的主要成分是多糖，具特殊的抗原
49、性具特殊的抗原性n n不同抗原型是遗传的、不同抗原型是遗传的、稳定的，一般情况下不稳定的，一般情况下不发生互变发生互变荚膜荚膜 菌落菌落 毒性毒性 类型类型光滑型光滑型S S发达发达 光滑光滑有有I,II,I,II,IIIIII粗糙型粗糙型R R无无粗糙粗糙无无I,III,IIGriffith转化研究(1928)Griffith对其试验结论及发展n n根据上述研究结果根据上述研究结果GriffithGriffith认为：认为：n n(有毒有毒)死细菌中的某种物质转移到死细菌中的某种物质转移到(无毒无毒)活细菌中，活细菌中，并使之具有毒性，导致小家鼠死亡并使之具有毒性，导致小家鼠死亡n n将这种
50、细菌遗传类型的转变称为将这种细菌遗传类型的转变称为转化转化，并将引起转化，并将引起转化的物质称为的物质称为转化因子转化因子(tranformingtranforming principle)principle)n n但是当时的化学与生化分析技术还无法鉴定杀死细菌但是当时的化学与生化分析技术还无法鉴定杀死细菌中的确切成分，因而不能确定转化因子为何物中的确切成分，因而不能确定转化因子为何物n n以后一些研究者重复上述试验，并且加入了以后一些研究者重复上述试验，并且加入了体外培养体外培养试验，试验，即：将加热杀死的即：将加热杀死的SIIISIII细菌与无毒细菌与无毒RIIRII细菌混合培养，然细菌混