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1、植酸酶的分子生物学与基物因工程 组员：张亚丽 耿红汭 黄银霞植酶酸的分子生物学和基因工程n植酶酸 植酸酶介绍、用途、研究意义n植酶酸的分子生物学 1、微生物来源的植酸酶的酶学性质 2、植酸酶基因 3、植酸酶的高级结构n植酶酸的基因工程 1、在微生物中高效表达植酸酶基因 2、植酸酶的植物基因工程 3、植酸酶的热稳定性 植酶酸n植酶酸分子结构植酸酶n植酸酶是一种能水解植酸的磷酸酶类。它能将植酸磷(六磷酸肌醇)降解为肌醇和无机磷酸。植酸酶n此酶分为两类：3植酸酶(EC3 1 3 8)和6一植酸酶(EC 3 1 26)。植酸酶广泛存在于植物、动物和微生物中如玉米、小麦等高等植物，枯草芽孢杆菌、假单孢杆
2、菌、乳酸杆菌、大肠杆菌等原核微生物及酵母、根霉、曲霉等真核微生物中。植酸酶n植酸酶是一种能将饲料中植酸磷水解成无机磷和肌醇新型单胃动物饲料添加剂。植酸酶 n植酸酶可作为一种单胃动物的饲料添加剂，它的饲喂效果已在世界范围内得到了确证。它可使植物性饲料中磷的利用率提高60，粪便中磷排泄量减少40，同时还可降低植酸的抗营养作用。因此在饲料中添加植酸酶对提高畜禽业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。植酸酶n植酸酶作为一种能将饲料中植酸磷水解成无机磷和肌醇的新型单胃动物饲料添加剂，主要应用于猪、鸡、鸭等单胃动物和水产养殖动物，应用范围广，需求量大。植酸酶n它在欧洲使用较为广泛，在我国目前还没有商
3、品化的植酸酶生产，但是，考虑到我国的国情，植酸酶在我国的推广使用有着极为重要的意义。植酸酶植酸酶在我国的推广使用所具有的重要意义：n植酸酶的使用能减轻江河、水域环境的磷污染。我国江河、水域的富营养化污染极为严重如滇池的严重污染、近期发生的红潮等。造成污染的关键因子是水体中的氮和磷过量。我国每年从畜禽粪便中排出的磷就达250万t之多，是水体富营养化污染的罪魁祸首之一。植酸酶 形成高磷粪便的原因是饲料中的磷没有得到有效利用。植酶酸的使用将使畜禽粪便中的磷排出量减少4075即我国将大大减轻江海、水域等环境的磷污染。植酸酶n植酸酶能缓解我国磷资源匮乏、磷供应不足的局面。我国是一个缺磷大国，磷的产量不足
4、需求量的十分之一，是仅亚于蛋白质的第二大缺口饲料原料。植酸酶 植酸酶的使用可代替饲料原料中所添加的无机磷(磷酸氢钙)，全国每年少用磷酸氢钙80120万吨，从而可关停相应一批污染重的磷酸氢钙生产厂，这对我国这种严重缺磷的国家而言有着更为重要的社会效益和生态效益。植酸酶 植酸酶到目前为止并没有得到广泛的推广应用。植酸酶主要原因是：n植酸酶在天然材料中的含量太低，难以大量生产，生产成本昂贵 n植酸酶的抗逆性，尤其是热稳定性不能完全满足饲料及饲料加工的要求 植酸酶n随着基因工程技术的发展为这些问题的解决提供了一条有效的新途径，植酸酶的基因工程研究已成为世界性的研究热点。植酸酶的分子生物学n在1907年
5、Suzuki等就在谷糠中发现了具有植酸酶活性的磷酸酶，接下来的较长的一个时期中研究都集中在植物和动物器官中的植酸酶第一个纯化的植酸酶来源于麸皮，研究发现它虽然具有植酸酶活性但植酸并不是它的特异性底物。植酸酶的分子生物学n来源于植物的植酸酶均属于6-植酸酶最适pH范围在5.07.5，不适合在单胃畜禽酸性的胃中起作用而且在植物中含量极低，因而从应用的角度出发60年代末植酸酶的研究转向最适pH值为酸性、酶含量较高的微生物来源的植酸酶。植酸酶的分子生物学微生物来源的植酸酶的酶学性质n许多微生物都能产生植酸酶尤其在曲霉屑中。1968年Shieh等“发现所用的22株黑曲霉菌中有21株能产生植酸酶。第一个被
6、分离纯化的植酸酶来源于Aspergitlusterreus No9A一1，它的最适pH值为4.5，最适酶反应温度为70，此酶在pH 1.29.0均能稳定维持其活性。植酸酶的分子生物学微生物来源的植酸酶的酶学性质n从此以后陆续从十几种微生物中分离到植酸酶，如枯草芽孢杆菌、假单孢杆菌、乳酸杆菌、大肠杆菌、酵母、曲霉等，并对酶的生理生化性质进行了较深入的研究。其中来源与 Aficuum NRRL3135(A.niger var awamori)的植酸酶PHYA具有较好的耐热性，在酸性条件下有较高的酶活性，被认为是目前最具有应用前景的饲用植酸酶，其酶学性质研究也较为深入。植酸酶的分子生物学微生物来源的
7、植酸酶的酶学性质n这种来源的植酸酶PHYA属于3一植酸酶是一种檐基化蛋白，糖基化含量为273，糖链中富含甘露糖，表观分子量约为85kD。它的最适pH值为2.5和5.5、最适温度为55，在37、pH2.5的条件下以植酸钠为底物的Km值为50mmolCa2+、Fe2+对酶活性无影响，Mn2+、Co2+有激活作用，能使酶活性分别提高30和13植酸酶的分子生物学微生物来源的植酸酶的酶学性质nCu2+、Zn2+、Fe2+和Cu+对酶活性有抑制作用，其中前两种为非竞争性竞争，后两种为竞争性抑制。另外，对一些来源于动物、植物的酸性磷酸酶有抑制作用的抑制剂如磷霉素对它却没有抑制作用。植酸酶的分子生物学微生物来
8、源的植酸酶的酶学性质n它对植酸酶有很高的底物特异性，酶的特异比活性为105 105 umg酶蛋白，是目前发现的比活性最高的植酸酶之一，它降解植酸磷形成的终产物是单磷酸肌醇和无机正磷酸。植酸酶的分子生物学微生物来源的植酸酶的酶学性质n来源于A.niger 963植酸酶PHYA酶学性质与来源于A.ficuum NRRI 3135(Aniger var awamori)的植酸酶PHYA基本相似，仅在最适pH上有所差异 前者最适pH值为1.8和5.7。来源于大肠杆菌的植酸酶的分子量为43kD，最适pH值为3.5，特异性活性为750 umg。植酸酶的分子生物学微生物来源的植酸酶的酶学性质n来源于枯草芽孢
9、杆菌的植酸酶的分子量为43kD，最适PH值为7.0。目前发现的绝大部分微生物来源的植酸酶分解植酸盐形成的终产物均是单磷酸肌醇和无机正磷盐，但1998年Mcchlzuki等从西方许旺酵母中分离出的植酸酶可将植酸盐分解为肌醇和无机磷酸。植酸酶的分子生物学微生物来源的植酸酶的酶学性质n另外一些微生物来源的酸性磷酸酶虽然最适底物不是植酸盐，但也具有部分植酸酶的活性，如来源于黑曲霉 的最适PH2.5的酸性磷酸酶，来源于大肠杆菌的最适PH2.5的磷酸酶。植酸酶的分子生物学植酸酶基因n到目前为止，共有十余个植酸酶编码基因得到了分离克隆。几乎所有分离得到的植酸酶基因都申请了专利。植酸酶的分子生物学植酸酶基因n
10、最先分离出的植酸酶基因是Aspergillus ficuum NRRL 3135的phyA基因。该结构基因全长1506bp，其中+46+147的102bp的核苷酸序列是一典型的真菌内含子序列，其上有真菌内含子的特征保守序列：Donor序列GTATGC、Lariat序列GCTGAC及Acceptor序列CAG。植酸酶的分子生物学植酸酶基因n它的基因编码467个氨基酸，根据信号肽序列结构规则推断，N端的19个氨基酸为信号肽，信号的肽切割位点在+19位的Gly之后。植酸酶的分子生物学植酸酶基因n来源于Aspergillus ficuum NRRL3135的植酸酶是一种糖基化蛋白，在phyA编码的氨基
11、酸序列上，发现了10个潜在的N一糖基化位点(AsnXSerThr，x为任意氯基酸)。从氨基酸推断出的理论分子量约为51.4kD，糖基化后的表观分子量在85 kD左右。植酸酶的分子生物学植酸酶基因n氨基酸序列上存在组氨酸酸性磷酸酶的活性位点保守序列（Active-site sequence）：CQVTFAQVL_SRHGARYPTDSKGK，它位于氨基酸序列的+52+74，可归为组氨酸酸性磷酸酶这一家族。Aspergillus ficuum NR-RL3135的phyA基因中G+C百分含量达到68.3，这是丝状真菌中高表达蛋白编码序列所特有的特征之一。植酸酶的分子生物学植酸酶基因n来源于丝状真菌
12、，尤其是曲霉的phyA基因无论在核苷酸来源、编码的氨基酸序列等基因结构上，还是在基因产物的酶学特征上均具有较高的相似性 植酸酶的分子生物学植酸酶基因n例如他们的编码基因长度相当，核苷酸同源性较高，编码的氨基酸个数都在460480之间，氨基酸序列上也有较高同源性，均具有活性位点保守序列RHGxRxP，在氨基酸序列上有数量不等的潜在糖基化位点，翻译后的蛋白都需要糖基化修饰后才具有正常的生物学活性。植酸酶的分子生物学植酸酶基因nphyB基因与phyA相比，虽然也属于组氨酸酸性磷酸酶家族，有活性位点保守序列RHGxRxP，但核苷酸序列及编码的氨基酸序列同源性较低，实际上它的最适底物不是植酸盐，它仅是具
13、有植酸酶活性的酸性磷酸酶。植酸酶的分子生物学植酸酶基因n来源于细菌的植酸酶也是另一类植酸酶，它的编码基因较短，编码蛋白的分子量也小，它的核苷酸序列及编码的核苷酸序列与phyA和phyB及已报道的磷酸酶基因没有同源性，它也没有普遍存在于phyA和phyB编码蛋白上的活性位点保守序列RHGxRxP，这说明它不属于组氨酸酸性磷酸酶家族。植酸酶的分子生物学植酸酶基因n对这一类植酸酶研究仅在近年来才开始涉及,1998 年 Ker ovuo等才首次从 Bacillus s ubtilis 中分离出其完整的编码基因。来源于 Bacillus s ubtilis 的植酸酶基因 phyC 全长 1152,编码
14、383个氨基酸,其中 N 端的26 个氨基酸是信号肽序列。生物学活性依赖钙离子的存在。植酸酶的分子生物学植酸酶基因n目前唯一报道的植物来源的植酸酶基因是 Maugenset等 于 1998 年从萌发的玉米种子中分离的,成熟酶由两个相同的亚基组成,亚基的结构基因(CDNA)全长 1167bp,编码 387 个氨基酸,理论分子量为 41kD。植酸酶的分子生物学植酸酶基因n它与微生物来源的植酸酶没有氨基酸序列同源性,但存在一个包含活性位点保守序列 RHGxRxP 的 33 个氨基酸的同源区,与来源于 Aspergillus f icuum NRRL3135 的 phyA 和 phyB 相比,这一段氨
15、基酸序列的同源性分别达到 48%和 51%。植酸酶的分子生物学植酸酶基因n丝状真菌来源的 p hyA 基因编码的植酸酶,其 RHGxRxP 序列一般位于 N端,如 A sp er gillus f icuum NRRL3135 的 p hyA 中它的位置在+81+87,而玉米植酸酶中,RHGxRxP 序列位置较靠后,在+204+210 的区域上。植酸酶的分子生物学植酸酶的高级结构n对植酸酶的高级结构研究较多的是来源于 Asp er gillusf icuum NRRL3135 的 phyA 编码的植酸酶 PHYA,Kostrewa等利用 X 衍射分析了它的晶体结构。植酸酶的分子生物学植酸酶的高
16、级结构nPHYA 的高级结构中有 5 对二硫键:Cys8-Cys17、Cys48-Cys391、Cys192-Cys442、Cys241-Cys295、Cys413-Cys421,用盐酸胍变性处理后,植酸酶活性丧失,说明二硫键在植酸酶的折叠上扮演着重要的作用。植酸酶的分子生物学植酸酶的高级结构nPHYA 的晶体结构可分为两部分:一个大的结构域和一个较小的结构域,结构域的中心是一个由 6 片组成的折叠片。植酸酶的分子生物学植酸酶的高级结构nPHYA 的晶体结构在两个结构域的内表面有一很深的凹套,凹套中有酶催化活性的必需氨基酸 Arg58 和 His59,它们是植酸酶活性位点保守序列 RHGxRx
17、P 中的前两个氨基酸,在以前的研究中利用化学修饰的方法就已证实RHGxRxP 序列中的 Arg 58与鼠的低分子量酸性磷酸酶的晶体结构有很高的结构相似性,说明它属于组氨酸酸性磷酸酶家族。植酸酶的基因工程n植酸酶的基因工程主要是要解决两个问题,一个是植酸酶在天然材料中表达水平太低,这造成植酸酶难以大量生产及生产成本过高的问题,通过基因工程技术利用生物反应器则有望成百上千倍地提高它的表达量。植酸酶的基因工程n另一个问题是天然植酸酶的一些性质不能完全适合饲料加工业和饲料养殖业的要求,如抗逆性、在动物体内的有效性等,特别是植酸酶的热稳定性。植酸酶的基因工程n利用基因工程的手段在分子水平上对基因进行遗传
18、操作,则有望使这些性质得到改善。植酸酶的基因工程在微生物中高效表达植酸酶基因n目前,植酸酶基因表达的研究主要集中在来源于曲霉的植酸酶基因 phyA 和 phyB 上。植酸酶的基因工程在微生物中高效表达植酸酶基因n1993 年 Piddington 等将产植酸酶的 A.niger Var.A wamor i ALK0243 通过紫外诱变获得植酸酶表达量较高的突变株 A.niger ALK02268,以它为受体,将同样来源于 A.niger Var.Awamori ALK0243 的植酸酶基因 phyA 和phyB 分别导入其中,阳性克隆子中 phyA 的表达量达到 329u/mL,比受体菌提高了
19、 7.3 倍,phyB 的表达量提高了59倍。植酸酶的基因工程在微生物中高效表达植酸酶基因n同年,Van Hartingsveldt 等将来源于 A.f icumm NRRL3135的 p hyA 基因导回原菌株,使 phyA 基因的拷贝数增加到 15 个以上,从而使植酸酶的表达量提高到7600u/mL。植酸酶的基因工程在微生物中高效表达植酸酶基因nMoore E.等在 A.oryzae 中表达来源于酵母的植酸酶基因和来源于 A.niger762的 phyB 基因,其结果也是使表达量分别提高到 840u/mL和 750u/mL。植酸酶的基因工程在微生物中高效表达植酸酶基因n从总体上看,以上的这
20、些表达研究获得的表达水平还较低,但却证实了利用基因工程手段来提高植酸酶的表达、生产这一途径的有效性。植酸酶的基因工程在微生物中高效表达植酸酶基因1.Van Gorcomd等将植酸酶基因 phyA 置于来源于 A.niger 的淀粉葡萄糖苷酶(AG)启动子之下,信号肽序列用AG 信号肽的 18 个氨基酸序列等、AG 信号肽的 24 个氨基酸序列及植酸酶原来的信号肽序列 3 种构建植酸酶基因重组到 A.niger 基因组中获得阳性克隆子 植酸酶的基因工程在微生物中高效表达植酸酶基因n在这 3 种构建中其植酸酶在重组菌株中的表达量分别达到了 1.1,0.5,2.8x 105u/mL,与天然植酸酶产生
21、菌株仅有不到 100u/mL相比有了大幅度的提高,目前,这一菌株已用来工业化生产植酸酶。植酸酶的基因工程在微生物中高效表达植酸酶基因n1998 年我国采用异源受体毕赤酵母(Pichia pastoris)作为生物反应器高效表达了来源于 A.niger 963 的植酸酶基因phyA。为了能在毕赤酵母中高水平表达植酸酶的基因工程在微生物中高效表达植酸酶基因n 首先对其结构基因进行了改造,去掉原 phyA 基因中的内含子和信号肽编码序列,在不改变所编码氨基酸的情况下定点突变优化了对此基因在酵母中高效表达起关键作用的 Arg 密码子。植酸酶的基因工程在微生物中高效表达植酸酶基因n改造后的植酸酶基因与来
22、源于酿酒酵母的因子信号肽编码序列3端以正确的阅读框架融合,启动子采用诱型高效酒精氧化酶 1 启动子,电击转化后将植酸酶基因整合到毕赤酵母基因组中,重组酵母中表达的植酸酶能分泌到培养基中,与天然植酸酶在酶学性质上没有差异，具有正常的生物学活性。植酸酶的基因工程在微生物中高效表达植酸酶基因n Arg 密码子经优化改造后,其植酸酶表达量比未经优化的高约 37 倍。重组酵母经高密度发酵后,植酸酶的表达量达到 5x105u/mL 以上,比原植酸酶产生菌 A.niger 963 的表达量高约 3000倍。植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程n植酸酶作用的底物 植酸磷是存在于植物性饲料中的,如玉米、大豆等种
23、子,如果在它们种子中本身就含有足量的植酸酶,在饲喂过程中在动物的肠胃道中释放出来降解饲料中植酸磷,这样就省去了植酸酶添加剂的生产及在饲料中的添加,一举两得,这无疑是植酸酶应用的最佳方法。植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程n90 年代科学家们开始尝试这一方面的研究,并取得了阶段性的进展。植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程n首先是从对模式植物烟草的研究开始的,Jan Pen 等将来源于 A.niger 的植酸酶基因phyA 转移到植物烟草中,用35S 启动子控制phyA,并用烟草的 PR-S 蛋白的信号肽序列取代phyA上原有的信号肽序列 植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程n结果发现,在烟草
24、种子中检测到了植酸酶活性,其表达积累量可达到种子中可溶性蛋白的 1%,表达的植酸酶能够进行糖基化,其分子量约为67kD,脱糖基化处理后分子量降低到 60kD。植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程n烟草中表达的植酸酶的分子量比天然植酸酶 85kD 的分子量小,其原因可能与植酸酶的糖基化上差异有关。动物饲喂试验表明,其饲喂效果与在饲料中直接添加等量的植酸酶相当。植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程n另外,储藏在种子中的植酸酶有很好的稳定性,在种子磨成粉的加工过程中及在室温下储存一年后植酸酶活性不丧失。植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程nVerwoerd 等也做了类似的工作,由于是利用非组织特异性
25、启动子组成型表达植酸酶,所以在转基因烟草中检测到了植酸酶,其中在叶子中植酸酶的表达量最高,达到可溶性蛋白的14.4%。植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程n另外,植酸酶在烟草中表达,似乎并不影响烟草的形态、生长、及种子的萌发。植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程nVan Ooi jen 等利用特异性cruciferin 启动子在烟草种子中特异性表达植酸酶,表达量达到种子中可溶性蛋白的 0.15%,而在转基因茎、根中未检查到植酸酶的表达。植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程 以上仅是在模式植物烟草上进行的一些初步研究,但却证明了这一思路的可行性：n植酸酶基因可在植物中高表达,也可在种子中特异性表
26、达 n植酸酶基因的表达对植物生长、形态及种子萌发没有显著影n在种子中的植酸酶具有很好的稳定性。植酸酶的基因工程植酸酶的植物基因工程n这些结果为进一步将植酸酶基因转化到真正的饲料作物玉米、大豆中,培养出种子富含植酸酶的大豆、玉米提供了依据和可行性。植酸酶的基因工程植酸酶的热稳定性n目前,通过基因工程微生物发酵来大规模廉价生产饲料用植酸酶酶制剂使这一问题已基本得到解决,但植酸酶制剂应用上的另一个关键性问题始终没有能够得到解决,即酶的热稳定性。植酸酶的基因工程植酸酶的热稳定性n加工饲料都需经过一个制粒工艺,在制粒过程中有一个短暂的高温过程,温度一般在 75 93 摄氏度,一般的植酸酶活性在此高温下大
27、幅度地不可逆丧失。所以能在饲料中真正得到推广利用的植酸酶必须是具有良好热稳定性的。植酸酶的基因工程植酸酶的热稳定性n但另一方面,饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性,因为饲料用酶最终的作用场所又是动物正常体温(37摄氏度左右)的肠胃道中,这与工业上所使用的一些高温酶不同。植酸酶的基因工程植酸酶的热稳定性n从嗜温微生物 Myceliop hthora ther mop hila、Asp ergillus ter r eus等中分离到的高温植酸酶其最适温度在 70 800C,虽然具有很好的耐温性,但它在 37下的酶活性极低,在饲料中没有使用价值。而相反,来源于 A.niger 等的植酸酶在37下
28、具有较高酶活性,但它又不能经受制粒时的高温。植酸酶的基因工程植酸酶的热稳定性n如何解决使其又耐短暂的制粒高温、又能在动物正常体温下具有高酶活性这一对矛盾是目前包括植酸酶在内的所有饲料用酶制剂均需解决的问题。植酸酶的基因工程植酸酶的热稳定性n在酶的耐热性方面已进行了许多富有成效的研究,一种较简单有效的方法就是对酶进行后加工处理,即研究酶的包被技术,使酶包裹在包衣中而免受制粒高温的破坏,包衣在动物胃中可被消化而释放出酶。植酸酶的基因工程植酸酶的热稳定性n目前一些商品化的植酸酶就是采用这种技术,但它的加工成本较高,如能通过基因工程、蛋白质技术等使植酸酶本身就具有良好的热稳定性无疑是很有意义的。植酸酶的基因工程植酸酶的热稳定性n植酸酶的热稳定性研究目前还处于知识积累阶段,还未取得大的突破。近年来，已从嗜温微生物中发现多种高温植酶，对它们的结构与热稳定性的研究将为植酸酶的热稳定性改造提供信息。植酸酶的分子生物学和基因工程