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1、关于细胞培养关于细胞培养第一页，本课件共有46页第一章第一章 绪论及基本理论知识绪论及基本理论知识l第一节第一节 绪论绪论l一、组织培养基本概念一、组织培养基本概念l从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、从体内取出组织模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长适当温度和一定营养条件下，使之生存和生长并维持其结构和功能的方法。并维持其结构和功能的方法。第二页，本课件共有46页第三页，本课件共有46页二、对组织培养的评价二、对组织培养的评价l长时间观察活细胞长时间观察活细胞l便于记录便于记录l细胞种类广泛细胞种类广泛l便于各种不同测试方法便于各种不同测试方法l与体内相同的
2、基因组与体内相同的基因组l易于实验研究易于实验研究l性价比高性价比高l生物制品主要的手段生物制品主要的手段第四页，本课件共有46页三、组织培养发展简史三、组织培养发展简史第五页，本课件共有46页l19071907，Harrison Harrison 悬滴培养法，取蛙胚一片组织，悬滴培养法，取蛙胚一片组织，采用成蛙淋巴做培养基，能存活一周。采用成蛙淋巴做培养基，能存活一周。19101910，Burrows Burrows 用鸡血浆作为鸡胚组织的支持用鸡血浆作为鸡胚组织的支持和营养物质。比淋巴好，能使神经组织、心脏组织及皮和营养物质。比淋巴好，能使神经组织、心脏组织及皮肤生长良好。肤生长良好。lB
3、urrowsBurrows和和Carrel Carrel 成功培养了成年狗、猫、小鼠、成功培养了成年狗、猫、小鼠、豚鼠以及恶性组织的外植物。此外，证明传代可延长细胞豚鼠以及恶性组织的外植物。此外，证明传代可延长细胞的寿命。同时，若把胚胎提取液与血浆混合使用，存活的的寿命。同时，若把胚胎提取液与血浆混合使用，存活的更好。更好。lCarrelCarrel（外科大夫）（外科大夫）发明卡式培养瓶发明卡式培养瓶lW.H.LewisW.H.Lewis和和M.R.Lewis M.R.Lewis 发展出许多合成培养基发展出许多合成培养基l19291929，Fell Fell 组织培养组织培养l我国始于我国始于
4、2020世纪世纪3030年代年代第六页，本课件共有46页第二节第二节 组织培养细胞生物学组织培养细胞生物学l细胞生长指细胞体积增大细胞生长指细胞体积增大;细胞增殖是细胞数量增多。细胞增殖是细胞数量增多。l一、体内外细胞的差异一、体内外细胞的差异l增殖使细胞数量增多增殖使细胞数量增多,分化使机体结构和功能多样化。分化使机体结构和功能多样化。此间每个细胞的生命活动此间每个细胞的生命活动,均听命于外源信号均听命于外源信号,通过相通过相关基因的调控关基因的调控,使之发生增殖或分化的表达。当细胞被离使之发生增殖或分化的表达。当细胞被离体培养后体培养后,信号来源切断信号来源切断,特定基因分化表达减弱或停止
5、，特定基因分化表达减弱或停止，而进化中保守的细胞增殖活动却可维持，遂使体内外细而进化中保守的细胞增殖活动却可维持，遂使体内外细胞出现了差异，这种差异从细胞离体培养的刹那就开始胞出现了差异，这种差异从细胞离体培养的刹那就开始了。了。第七页，本课件共有46页二、培养细胞的分化l1.1.不适应不适应:细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不细胞在体内时所拥有的分化特性减弱或不显显l2.2.脱分化或去分化：即细胞失掉发生分化的能力。脱分化或去分化：即细胞失掉发生分化的能力。l 不适应是因生存条件的改变使分化发生阻抑不适应是因生存条件的改变使分化发生阻抑;从分子从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致，因
6、此应分析水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致，因此应分析体外培养细胞分化的改变属何种性质。很多细胞在培养体外培养细胞分化的改变属何种性质。很多细胞在培养中的改变只是因培养环境的改变和分化因子的缺乏，导中的改变只是因培养环境的改变和分化因子的缺乏，导致细胞分化表达受阻、分化基因表达抑制或不充分而已。致细胞分化表达受阻、分化基因表达抑制或不充分而已。即便是脱分化也并不意味着细胞分化能力完全丧失。即便是脱分化也并不意味着细胞分化能力完全丧失。第八页，本课件共有46页三、培养细胞形态分类 l1.1.贴附型贴附型 ：只赖于贴附才能生长的细胞称贴附性细：只赖于贴附才能生长的细胞称贴附性细胞或锚着依存性细胞
7、。当细胞贴附在支持物上之后胞或锚着依存性细胞。当细胞贴附在支持物上之后,易失去它们在体内时原有的特征易失去它们在体内时原有的特征,细胞分化现象常变细胞分化现象常变得不显著。在形态上常表现单一化的现象得不显著。在形态上常表现单一化的现象,并常反映其并常反映其胚层起源胚层起源,呈现类似前述呈现类似前述“反祖现象反祖现象”。如来源于内、。如来源于内、外胚层的细胞多呈上皮型外胚层的细胞多呈上皮型;来自中胚层的则易呈成来自中胚层的则易呈成纤维细胞型纤维细胞型,显然与细胞分化有关。由于上述原因显然与细胞分化有关。由于上述原因,体体外培养细胞形态常表现有一般化的倾向。因此在判定培外培养细胞形态常表现有一般化
8、的倾向。因此在判定培养细胞形态时养细胞形态时,很难再按体内细胞标准确定。很难再按体内细胞标准确定。第九页，本课件共有46页la.a.成纤维型细胞成纤维型细胞:本型细胞形态与体内成纤维细胞本型细胞形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名的形态相似而得名;细胞体呈梭形或不规则三角形，细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出中央有卵圆形核，胞质向外伸出2-32-3个长短不同的突个长短不同的突起。细胞在生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走起。细胞在生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走行。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起行。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌
9、、成骨细胞、血管内皮源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等呈本类形态。等呈本类形态。第十页，本课件共有46页lb.b.上上皮皮型型细细胞胞:本本型型细细胞胞具具有有扁扁平平不不规规则则多多角角形形,中中有有圆圆形形核核,细细胞胞紧紧密密相相连连成成单单层层膜膜。起起源源于于内内、外外胚胚层层细细胞胞如如皮皮肤肤表表皮皮及及其其衍衍生生物物、消消化化管管上上皮皮、肝肝、胰胰和和肺肺泡泡上上皮皮等等组组织织培培养养时时,皆皆呈呈上上皮皮型型形形态态。上上皮皮型型细细胞胞生生长长时时,尤尤其其是是外外胚胚层层起起源源的的细细胞胞,细细胞胞之之间间常常出出现现所所谓谓“拉拉网网”,即即在在构构
10、成成上上皮皮膜膜状状生生长长的的细细胞胞群群中中一一些些细细胞胞常常相相互互分分离离卷卷曲曲,致致使使上上皮皮细细胞胞膜膜中中形形成成网网眼眼状状空空洞洞。拉拉网网的的形形成成可可能能与与细细胞胞分分泌泌透透明明质质酸酶有关。酸酶有关。第十一页，本课件共有46页lc.c.游走型细胞游走型细胞:l 本本型型细细胞胞在在支支持持物物上上散散在在生生长长，一一般般不不连连接接成成片片。细细胞胞质质经经常常伸伸出出伪伪足足或或突突起起，呈呈活活跃跃的的游游走走或或变变形形运运动动，速速度度快快而而且且不不规规则则。此此型型细细胞胞不不很稳定，有时亦难和其它型细胞相区别。很稳定，有时亦难和其它型细胞相区
11、别。ld.d.多形型细胞多形型细胞:l 除除上上述述三三型型细细胞胞外外，还还有有一一些些组组织织和和细细胞胞，如如神神经经组组织织的的细细胞胞等等，难难以以确确定定它它们们规规律律的的形形态态，可统归入多形型细胞。可统归入多形型细胞。第十二页，本课件共有46页第十三页，本课件共有46页l2.2.悬浮型悬浮型l 有有的的细细胞胞在在培培养养时时不不贴贴附附于于支支持持物物上上，而而呈呈悬悬浮浮状状态态生生长长，如如某某些些癌癌细细胞胞和和血血液液白白细细胞胞可可呈呈悬悬浮浮型型。细细胞胞悬悬浮浮生生长长时时，胞胞体体为为圆圆形形，观观察察时时不不如如贴贴附附型型方方便便。其其优优点点是是细细胞
12、胞悬悬浮浮在在培培养养液液中中生生长长，生生存存空空间间大大，容容许许长长时时间间生生长长，能能繁繁殖殖多多量细胞，便于做细胞代谢等研究。量细胞，便于做细胞代谢等研究。第十四页，本课件共有46页四、培养细胞形态结构l1.1.大体形态：悬浮生长：胞体基本呈圆形大体形态：悬浮生长：胞体基本呈圆形l贴附于支持物：开始为圆形贴附于支持物：开始为圆形,很快经形态演变过渡扁平很快经形态演变过渡扁平形态。附于球体表面时形态。附于球体表面时,细胞与球体呈同心圆细胞与球体呈同心圆,支持支持物表面平坦时物表面平坦时,则细胞先由圆形延展成圆饼形则细胞先由圆形延展成圆饼形,此时的此时的细胞可称之为放射延展细胞细胞可称
13、之为放射延展细胞,其细胞质可区分为其细胞质可区分为:中心区或内质中心区或内质外质或板层区外质或板层区:活跃与不活跃部分。放活跃与不活跃部分。放射延展细胞持续射延展细胞持续0.5-2h0.5-2h过渡为极性细胞。当细胞相过渡为极性细胞。当细胞相互接壤成片后互接壤成片后,极性常变得不明显极性常变得不明显,外质周边部也无外质周边部也无明显活跃部分与不活跃部分的区别。明显活跃部分与不活跃部分的区别。第十五页，本课件共有46页第十六页，本课件共有46页2.2.超微结构超微结构:电镜观察细胞膜分为三层结构，双层类电镜观察细胞膜分为三层结构，双层类脂分子组成；细胞膜向外凸出形成微绒毛；即使细胞脂分子组成；细
14、胞膜向外凸出形成微绒毛；即使细胞连接成片时，在细胞之间仍存在着一定的间隙；细胞连接成片时，在细胞之间仍存在着一定的间隙；细胞相互接触部并可见到桥粒，桥粒的有无可作为识别上相互接触部并可见到桥粒，桥粒的有无可作为识别上皮细胞的标志；细胞膜表面常附有由细胞分泌物形成皮细胞的标志；细胞膜表面常附有由细胞分泌物形成的糖蛋白膜，即细胞外衣，它对细胞的运动，尤其对的糖蛋白膜，即细胞外衣，它对细胞的运动，尤其对细胞贴附于支持物生长有很大作用；微丝存在于细胞细胞贴附于支持物生长有很大作用；微丝存在于细胞膜下面的胞质区膜下皮质层；细胞质中的其它结构如膜下面的胞质区膜下皮质层；细胞质中的其它结构如线粒体、内质网、
15、高尔基氏复合体、中心体和溶酶体线粒体、内质网、高尔基氏复合体、中心体和溶酶体等多集中在细胞内质等多集中在细胞内质第十七页，本课件共有46页l3.3.细胞骨架观察细胞骨架观察(CSL):(CSL):细胞骨架细胞骨架(微丝和微管微丝和微管)是细是细胞质中重要结构之一胞质中重要结构之一,与细胞运动以及细胞转化与细胞运动以及细胞转化有密切关系。有密切关系。l鬼笔环肽显示微丝蛋白染色法：鬼笔环肽显示微丝蛋白染色法：l(1)(1)盖片培养细胞盖片培养细胞(70%-80%(70%-80%汇合汇合),PBS),PBS洗洗3 3次次;l(2)2%(2)2%的甲醛的甲醛/PBS/PBS液液(甲醛按甲醛按37%)3
16、7%)固定固定3min;3min;l(3)0.5%(3)0.5%三硝基甲苯三硝基甲苯/PBS/PBS处理处理3 3次次,每次每次10min,PBS10min,PBS洗洗3 3次次;l(4)(4)用罗丹明标记的鬼笔环肽用罗丹明标记的鬼笔环肽(1:10)(1:10)室温中反室温中反15min,PBS15min,PBS洗洗3 3次次;l(5)60%(5)60%甘油十荧光防淬剂封片甘油十荧光防淬剂封片,荧光显微镜检。荧光显微镜检。第十八页，本课件共有46页l抗管蛋白免疫染色法抗管蛋白免疫染色法:微管主要成分为管蛋白微管主要成分为管蛋白 l(1)(1)支持物培养法支持物培养法,培养在盖片上培养在盖片上,
17、PBS,PBS中洗中洗330s;330s;l(2)3%(2)3%甲醛液固定甲醛液固定20min,PBS20min,PBS洗洗31min,31min,吸干多余吸干多余PBS;PBS;l(3)(3)冷丙酮冷丙酮(-10(-10-20),-20),令细胞面向上令细胞面向上,作用作用7min,7min,PBSPBS中洗中洗31min,31min,吸干多余的吸干多余的PBS;PBS;l(4)(4)直径直径6cm6cm碟皿碟皿,中央滴浓度为中央滴浓度为0.1-0.2mg/ml0.1-0.2mg/ml的一级抗的一级抗管蛋白抗体管蛋白抗体,细胞面向下细胞面向下,置置3737温箱中温箱中45min45min至至
18、1h1hl(5)(5)令盖片浮在令盖片浮在PBSPBS液面液面,用镊子挟出用镊子挟出,PBS,PBS洗，洗，l(6)(6)二级荧光抗体处理二级荧光抗体处理:按按(4)(4)进行进行,漂洗漂洗l(7)(7)封片封片,荧光显微镜下观察。荧光显微镜下观察。第十九页，本课件共有46页第二十页，本课件共有46页l考马斯亮蓝考马斯亮蓝:l(1)(1)支持物盖片培养支持物盖片培养,戊二醛固定戊二醛固定15min,15min,蒸馏水漂洗；蒸馏水漂洗；l(2)(2)考马斯亮蓝液中染色考马斯亮蓝液中染色60min,60min,漂洗；漂洗；l(3)(3)分化分化:置入含甲醇冰醋酸液中置入含甲醇冰醋酸液中,微丝逐渐明
19、显微丝逐渐明显,终止终止;l(4)(4)漂洗，脱水，各度酒精，二甲苯，树胶封片。漂洗，脱水，各度酒精，二甲苯，树胶封片。l细胞内微丝呈蓝色细胞内微丝呈蓝色,如分化较好时背地清亮如分化较好时背地清亮,反之会影响反之会影响微丝的清晰度。微丝的清晰度。第二十一页，本课件共有46页五、组织培养细胞的生长和增殖过程l1.1.组织培养细胞生命期：是指细胞在培养中持续增殖组织培养细胞生命期：是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。和生长的时间。l细胞生存过程中经历以下三个阶段：细胞生存过程中经历以下三个阶段：la.a.原代培养期原代培养期:也称初代培养也称初代培养,即从体内取出组织接即从体内取出组织接种培养到
20、第一次传代阶段种培养到第一次传代阶段,一般持续一般持续1-41-4周。此期细周。此期细胞呈活跃的移动胞呈活跃的移动,可见细胞分裂可见细胞分裂,但不旺盛。细胞群但不旺盛。细胞群是异质的是异质的,也即各细胞的遗传性状互不相同也即各细胞的遗传性状互不相同,细胞相细胞相互依存性强互依存性强,由于原代培养细胞和体内细胞性状相由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大似性大,是检测药物很好的实验对象。是检测药物很好的实验对象。第二十二页，本课件共有46页lb.b.传代期传代期:初代培养细胞一经传代后便改称做细胞初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养系。在全生命期中此期的持
21、续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛。并能维持二倍条件较好情况下，细胞增殖旺盛。并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，应在初代培养期或传代为保持二倍体细胞性质，应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代后早期冻存。一般情况下当传代30-5030-50次后，细次后，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。第三期。第二十三页，本课件共有46页lc.c.衰退期衰退期:此期细胞仍然生存此期细胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖但增殖很慢或不增殖;细胞形态轮廓增强细胞形
22、态轮廓增强,最后衰退凋亡。在少数情况下最后衰退凋亡。在少数情况下,以上三期任何一点，由子某种因素的影响，细胞可以上三期任何一点，由子某种因素的影响，细胞可能发生自发转化，转化的标志之一是细胞可获得永能发生自发转化，转化的标志之一是细胞可获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变
23、成异倍体大多变成异倍体,细胞转化亦可用人工方法诱发，转细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。化后的细胞也可能具有恶性性质。第二十四页，本课件共有46页第二十五页，本课件共有46页l2.2.组织培养细胞一代生存期组织培养细胞一代生存期l 所谓细胞所谓细胞“一代一代”一词，系仅指从细胞接种到分一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，如某一细胞系为第离再培养时的一段时间，如某一细胞系为第153153代细代细胞，即指该细胞系已传代胞，即指该细胞系已传代153153次。它与细胞世代或次。它与细胞世代或倍增不同倍增不同;在细胞一代中，细胞能倍增在细胞一代中，细胞能倍增3-63
24、-6次。细胞次。细胞传一代后，一般要经过三个阶段。传一代后，一般要经过三个阶段。第二十六页，本课件共有46页la.a.潜伏期潜伏期:先经过悬浮期先经过悬浮期,此时细胞胞质回缩此时细胞胞质回缩,胞体呈胞体呈圆球形。接着是贴壁圆球形。接着是贴壁,悬浮期结束。细胞贴附支持物悬浮期结束。细胞贴附支持物后后,除先经过前述延展过程变成极性细胞除先经过前述延展过程变成极性细胞,还要经过一还要经过一个潜伏阶段个潜伏阶段,才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时时,可有运动活动可有运动活动,基本无增殖基本无增殖,少见分裂相。初代培少见分裂相。初代培养细胞潜伏期长养细胞潜伏期长,约约
25、24-9624-96小时或更长小时或更长,连续细胞系和连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短肿瘤细胞潜伏期短,仅仅6-246-24小时小时;细胞接种密度大时细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时,标标志细胞已进入指数增生期。志细胞已进入指数增生期。第二十七页，本课件共有46页lb.b.指数增生期指数增生期:细胞分裂相数量可作为判定细胞生细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数数(MI)(MI)表示，即细胞群中每表示，即细胞群中每10001000个细胞中的分裂个细胞中的
26、分裂相数。一般细胞的分裂指数介于相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%-0.5%,0.1%-0.5%,初代初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达高达3%-5%(3%-5%(肿瘤细胞偏高肿瘤细胞偏高)。指数增生期是细胞一代。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实脸最好的和中活力最好的时期，因此是进行各种实脸最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续增生期持续3-53-5天后，随细胞数量不断增多、生长天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合
27、成片。空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。第二十八页，本课件共有46页第二十九页，本课件共有46页lc.c.停滞期停滞期:细胞数量达饱和密度后细胞数量达饱和密度后,细胞停止增殖细胞停止增殖,进入停滞期进入停滞期,此时细胞数量持平此时细胞数量持平,故称平顶期。停故称平顶期。停滞期细胞虽不增殖滞期细胞虽不增殖,但仍有代谢活动但仍有代谢活动,继而培养继而培养液中营养渐趋耗尽液中营养渐趋耗尽,代谢产物积累、代谢产物积累、pHpH降低。此时降低。此时需传代需传代,否则细胞会中毒否则细胞会中毒,发生形态改变发生形态改变,重则从底重则从底物脱落死亡物脱落死亡,故传代应越早越好。传代过晚故传代应越早越好。
28、传代过晚(已有中已有中毒迹象毒迹象)能影响下一代细胞的机能状态。在这种能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下情况下,虽进行了传代虽进行了传代,因细胞已受损因细胞已受损,需要恢复需要恢复,至少还要再传至少还要再传1-21-2两代两代,通过换液淘汰掉死细胞和通过换液淘汰掉死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后使受损轻微的细胞得以恢复后,才能再用。才能再用。第三十页，本课件共有46页第三十一页，本课件共有46页生长曲线测定：l接种接种2121孔孔/24/24孔板细胞孔板细胞,分分7 7组组,每组每组3 3孔孔,培养一周培养一周(7(7天天),),期间逐日检测一组期间逐日检测一组,计数计数,最后把最后把
29、7 7天中的细天中的细胞数值绘成图胞数值绘成图,即为细胞生长曲线。即为细胞生长曲线。l(1)(1)悬液制备悬液制备 l(2)(2)接种接种l(3)(3)计数检测计数检测 l(4)(4)绘图绘图:用座标图纸绘成生长曲线用座标图纸绘成生长曲线第三十二页，本课件共有46页l细胞分裂指数细胞分裂指数(MI):(MI):l待取得逐日分裂相数值后，也可绘成细胞分裂指数曲待取得逐日分裂相数值后，也可绘成细胞分裂指数曲线。注意，细抱分裂指数曲线与生长曲线趋势基本一线。注意，细抱分裂指数曲线与生长曲线趋势基本一致，但不完全相同，如当细胞增长达饱合密度并进入致，但不完全相同，如当细胞增长达饱合密度并进入停止期后，
30、细胞数值很大，而分裂相可完全消失。停止期后，细胞数值很大，而分裂相可完全消失。第三十三页，本课件共有46页l接种存活率和克隆形成率接种存活率和克隆形成率:l2-52-5个细胞个细胞/cm/cm2 2被接种到底物上被接种到底物上,贴壁并能存活生长形成贴壁并能存活生长形成细胞小群的细胞百分数值称接种存活率细胞小群的细胞百分数值称接种存活率,用以表示细胞用以表示细胞群的活力。由于检测接种存活率时是借观察克隆群的活力。由于检测接种存活率时是借观察克隆(通常为通常为16-5016-50个细胞个细胞)形成情况形成情况,又因每个克隆都来自一个细胞又因每个克隆都来自一个细胞,因此也称克隆形成率。细胞接种存活率
31、与细胞活力成正因此也称克隆形成率。细胞接种存活率与细胞活力成正比，比，第三十四页，本课件共有46页六、培养细胞增殖动力学l1.1.增殖态：增殖态即细胞进行增殖的状态或过程增殖态：增殖态即细胞进行增殖的状态或过程;细细胞增殖或自我复制的手段为细胞有丝分裂。细胞胞增殖或自我复制的手段为细胞有丝分裂。细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制;两者是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。只有在两两者是正常细胞增殖过程缺一不可的前提。只有在两者完成后，细胞才能发生分裂者完成后，细胞才能发生分裂;而细胞有丝分裂所完而细胞有丝分裂所完成的主要是细胞质和细胞核的分配。
32、以上三个基成的主要是细胞质和细胞核的分配。以上三个基本过程是细胞增殖态主要的活动，三个过程有阶本过程是细胞增殖态主要的活动，三个过程有阶段性，又相互依存。段性，又相互依存。第三十五页，本课件共有46页la.Ga.G1 1期期:细胞分裂后期细胞分裂后期,或或DNADNA合成前期合成前期,G,G1 1期是细胞质期是细胞质复制的主要阶段复制的主要阶段,细胞进入细胞进入G G1 1期标志细胞已进入增殖期标志细胞已进入增殖态。上一次细胞分裂后所形成的子细胞是否能进入态。上一次细胞分裂后所形成的子细胞是否能进入G G1 1期期,取决于外源生长因子和其它增殖相关因子的调控。取决于外源生长因子和其它增殖相关因
33、子的调控。在在G G1 1期中期中,接受外界因子影响的特定阶段接受外界因子影响的特定阶段,称调节点。称调节点。培养细胞属旺盛增殖细胞群体培养细胞属旺盛增殖细胞群体,一般具有较短的一般具有较短的G G1 1期期,衰退细胞持续时间长。衰退细胞持续时间长。G G1 1期主要为细胞内的蛋期主要为细胞内的蛋白质合成、白质合成、RNARNA合成、多聚核蛋白体合成增多等合成、多聚核蛋白体合成增多等;G;G1 1期期胞体逐渐增大胞体逐渐增大,是镜下唯一可感知的变化。是镜下唯一可感知的变化。第三十六页，本课件共有46页lb.Sb.S期：即期：即DNADNA合成期合成期,主要机能活动为进行主要机能活动为进行DNA
34、DNA合成。各种细胞合成。各种细胞DNADNA合成持续时间差别不大合成持续时间差别不大,比较恒定比较恒定,平均平均6-8h,6-8h,除用抑制除用抑制DNADNA合成药物如合成药物如5-5-氟尿嘧啶等外氟尿嘧啶等外,细胞一旦进入细胞一旦进入S S期期,DNA,DNA合成过合成过程一经开始程一经开始,大多能持续进行大多能持续进行,独立性较大独立性较大,对对环境不利因素有一定耐受能力。但环境不利因素有一定耐受能力。但DNADNA在进行合在进行合成时成时,多核苷酸双链发生分离多核苷酸双链发生分离,在此阶段在此阶段,易受易受致突变或致癌因素作用致突变或致癌因素作用,DNA,DNA合成期是遗传物质易合成
35、期是遗传物质易受致突变物损伤的时期。受致突变物损伤的时期。第三十七页，本课件共有46页lc.Gc.G2 2期期:发生在发生在DNADNA合成后和本次细胞分裂期之前，合成后和本次细胞分裂期之前，故也称故也称DNADNA合成后期或细胞分裂前期。细胞进入合成后期或细胞分裂前期。细胞进入G G2 2期后，期后，DNADNA含量已加倍，具有含量已加倍，具有4 4倍量的倍量的DNADNA。在。在G G2 2期主要的变化是与细胞分裂相关的期主要的变化是与细胞分裂相关的RNARNA的合成和的合成和染色质的螺旋化。本期持续时间较短，平均染色质的螺旋化。本期持续时间较短，平均2-52-5小时。小时。G G2 2期
36、对外界环境敏感，易受温度、期对外界环境敏感，易受温度、pHpH及及各种其它因素的影响而受阻不能进入各种其它因素的影响而受阻不能进入M M期，但不利期，但不利作用消除后却能很快恢复。作用消除后却能很快恢复。第三十八页，本课件共有46页ld.Md.M期期:即细胞有丝分裂期，培养细胞分裂仍即细胞有丝分裂期，培养细胞分裂仍以有丝分裂方式进行增殖。以有丝分裂方式进行增殖。M M期结束形成两个期结束形成两个子细胞，是细胞增殖周期的终结期。处于分裂子细胞，是细胞增殖周期的终结期。处于分裂中的细胞叫分裂相，在生活状态下可以直接观中的细胞叫分裂相，在生活状态下可以直接观察到，培养细胞是研究细胞有丝分裂过程理想察
37、到，培养细胞是研究细胞有丝分裂过程理想的对象，细胞分裂过程分前中后末四期，活细的对象，细胞分裂过程分前中后末四期，活细胞分裂过程表现如下胞分裂过程表现如下:第三十九页，本课件共有46页l 前期前期:细胞核发生转动可能是前期的开始。当细胞核发生转动可能是前期的开始。当染色体在核中出现并愈来愈清楚时染色体在核中出现并愈来愈清楚时,证明细胞已进证明细胞已进入分裂前期。稍后入分裂前期。稍后,核膜和核仁突然解体消失核膜和核仁突然解体消失,染色染色体混于细胞质中并呈现活跃的运动。同时从细胞体混于细胞质中并呈现活跃的运动。同时从细胞膜表面向外伸出很多长短不等的突起膜表面向外伸出很多长短不等的突起,它们此起它
38、们此起彼伏犹如液面沸腾。此时细胞质逐渐回缩彼伏犹如液面沸腾。此时细胞质逐渐回缩,细胞细胞体趋于变圆体趋于变圆,遂与底物附着面减少遂与底物附着面减少,易脱落入培养液易脱落入培养液中中,染色体由分散状态渐向细胞中央部移动染色体由分散状态渐向细胞中央部移动,然后然后突然突然“冻结冻结”于赤道平面于赤道平面,到此前期结束到此前期结束,中期开始中期开始,前期持续时间前期持续时间20-3020-30分钟。分钟。第四十页，本课件共有46页l中期中期:胞质进一步回缩胞质进一步回缩,胞体呈圆球形胞体呈圆球形,与支持与支持物附着面缩小达极限。如于此时摇动培养瓶壁物附着面缩小达极限。如于此时摇动培养瓶壁,在培养液的
39、冲击下在培养液的冲击下,细胞极易从瓶壁脱落细胞极易从瓶壁脱落,依此依此可作为收集中期分裂相的简易方法。染色体可作为收集中期分裂相的简易方法。染色体集中于赤道平面后集中于赤道平面后,失去明显的运动失去明显的运动,中期染色中期染色体集聚在赤道平面上称中期板。细胞分裂中期持体集聚在赤道平面上称中期板。细胞分裂中期持续续20-3020-30分钟分钟min,min,本期细胞对外界因素敏感本期细胞对外界因素敏感,易易受外界因素如秋水仙素作用发生阻滞、延缓或停受外界因素如秋水仙素作用发生阻滞、延缓或停止向后期过渡。止向后期过渡。第四十一页，本课件共有46页l 后期后期:一且中期板染色体开始一分为二，即一且中
40、期板染色体开始一分为二，即标志后期开始。接着染色体分成两组分别向两标志后期开始。接着染色体分成两组分别向两极移动，与此同时整个细胞由圆球形逐渐变成极移动，与此同时整个细胞由圆球形逐渐变成椭圆球形椭圆球形;在赤道部并出现绞窄，胞体呈哑铃在赤道部并出现绞窄，胞体呈哑铃形。后期时两组染色体相互分离，是细胞分形。后期时两组染色体相互分离，是细胞分裂过程中最快的，仅持续裂过程中最快的，仅持续5-75-7分钟，在显微镜分钟，在显微镜下可直接观察到。下可直接观察到。第四十二页，本课件共有46页l 末期末期:此时两组染色体已达于两极，胞体中部此时两组染色体已达于两极，胞体中部进一步变细。继之一切变化与前期相反
41、进一步变细。继之一切变化与前期相反;染色体染色体变成染色质、核仁核膜再现、胞体逐渐分离、形成变成染色质、核仁核膜再现、胞体逐渐分离、形成两个子细胞，但两者间仍有细丝相连，经过较长时两个子细胞，但两者间仍有细丝相连，经过较长时间后才彻底分开。两个子细胞独立后，细胞质又复间后才彻底分开。两个子细胞独立后，细胞质又复延展附于底物变扁，整个细胞又恢复成原有状态延展附于底物变扁，整个细胞又恢复成原有状态;末末期持续时间期持续时间20-3020-30分钟。分钟。第四十三页，本课件共有46页l2.2.功能态：功能态为细胞进行特定功能活动如分功能态：功能态为细胞进行特定功能活动如分泌、传导、吞噬，收缩等的时期
42、，是细胞的第二泌、传导、吞噬，收缩等的时期，是细胞的第二种生存状态。细胞完成特定功能是在细胞发生分种生存状态。细胞完成特定功能是在细胞发生分化基础上完成的。因此，细胞功能态也是细胞的化基础上完成的。因此，细胞功能态也是细胞的分化态，功能态存在于细胞分裂之后，分化态，功能态存在于细胞分裂之后，G G1 1期前，也期前，也即在两次增殖态之间。若从细胞增殖态周期角度即在两次增殖态之间。若从细胞增殖态周期角度看，功能态是两次增殖周期之间的间期或看，功能态是两次增殖周期之间的间期或G0G0期。细期。细胞的增殖态和功能态是相对的状态，能发生交替和有胞的增殖态和功能态是相对的状态，能发生交替和有相互依存的关
43、系，根据这两种状态属性的不同，可把相互依存的关系，根据这两种状态属性的不同，可把细胞分作如下三类细胞分作如下三类:第四十四页，本课件共有46页la.a.活跃增殖细胞活跃增殖细胞:这类细胞是以增殖为主的细胞，这类细胞是以增殖为主的细胞，它们增殖频繁，具有较短的它们增殖频繁，具有较短的G G0 0期，无分化现象。从期，无分化现象。从而它们的而它们的G G0 0期最为符合间期概念，故可称之为期最为符合间期概念，故可称之为G G0i0i 。体内各种干细胞、肿瘤细胞和体外培养细胞均。体内各种干细胞、肿瘤细胞和体外培养细胞均属之，本型细胞在体外易于培养，成活率高。属之，本型细胞在体外易于培养，成活率高。第四十五页，本课件共有46页09.12.2022感感谢谢大大家家观观看看第四十六页，本课件共有46页