《第六章质粒(参考)课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《第六章质粒(参考)课件.ppt（77页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、第六章第六章 质质 粒粒(plasmid)质粒：质粒：是指存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染是指存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染 色体外、能进行自我复制的遗传因子。色体外、能进行自我复制的遗传因子。a、可以整合到染色体上，又可以游离于染色体外（附加体）可以整合到染色体上，又可以游离于染色体外（附加体）b、质质粒通常是共价、粒通常是共价、闭闭合、合、环环状双状双链链DNA(covalent closed circular DNA，简简称称cccDNA)，c、分子大小范分子大小范围围从从l kb左右到左右到1000 kb。自自20世世纪纪80年年代代中中期期以以来来，在在链链霉霉菌菌
2、、酵酵母母、丝丝状状真真菌菌等等微微生物中都生物中都发现发现了了线线状状DNA质质粒，甚至粒，甚至还还有有RNA质质粒。粒。质质粒粒对对宿宿主主细细胞胞是是非非必必需需的的，但但在在某某些些条条件件下下，质质粒粒能能赋赋予予宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长的优势。宿主细胞以特殊的机能，从而使宿主得到生长的优势。如如抗抗药药性性质质粒粒和和降降解解性性质质粒粒就就能能使使宿宿主主细细胞胞在在有有相相应应药药物物或或化学毒物的环境中生存。化学毒物的环境中生存。质质粒粒也也像像染染色色体体一一样样携携带带编编码码多多种种遗遗传传性性状状的的基基因因，并并授授予予宿宿主主细细胞胞一一定定的的遗
3、遗传传特特性性，许许多多与与医医学学、农农业业、工工业业和和环环境境密密切切相相关关的的重重要要细细菌菌的的特特殊殊特特征征便便是是由由质质粒粒编编码码的的，如如植植物物结瘤、固氮、对有机物的代谢等。结瘤、固氮、对有机物的代谢等。在在基基因因工工程程和和分分子子生生物物学学的的发发展展过过程程中中，质质粒粒也也起起着着非非常常重重要要的的作作用用。以以质质粒粒为为载载体体进进行行的的基基因因克克隆隆技技术术，在在原原核核生生物物和和真真核核生生物物中中表表达达外外源源蛋蛋白白的的方方法法和和技技术术已已在在工工、农农、医医各各个领域中得到广泛应用。个领域中得到广泛应用。因因此此，对对质质粒粒的
4、的研研究究无无论论在在理理论论上上或或应应用用上上均均具具有有十十分分重重要要的意义，是现代生物学研究中的重要课题之一。的意义，是现代生物学研究中的重要课题之一。第一节第一节 质粒的发现和命名质粒的发现和命名 大肠杆菌的大肠杆菌的F因子是第一个被发现因子是第一个被发现(1946年年)的细菌质粒，的细菌质粒，它的发现对细菌遗传学的发展产生了深远的影响。它的发现对细菌遗传学的发展产生了深远的影响。日本学者日本学者(1957年年)报道了志贺菌报道了志贺菌(Shigella)中质粒介导中质粒介导抗生素抗性的转移现象。在以后的抗生素抗性的转移现象。在以后的20多年中，陆续发现各多年中，陆续发现各种细菌携
5、带质粒，且它们的表型特征已远远超过了致育性种细菌携带质粒，且它们的表型特征已远远超过了致育性和药物抗性的范围。和药物抗性的范围。70年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己被广年代末，随着遗传工程的崛起，质粒作为载体己被广泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很多不同微泛应用在遗传工程和分子生物学的研究中。对很多不同微生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能分析，使质粒生物中的质粒进行了基因克隆和生物学功能分析，使质粒的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。的生物学跨入了空前繁荣的研究时期。一、质粒的发现一、质粒的发现二、质粒的命名原则二、质粒的命名原则 质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转
6、移性或亲和质粒可以依据其表型效应、大小、复制特性、转移性或亲和性差异划分为不同的类型。性差异划分为不同的类型。最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特征自行命名，最初发现的质粒均由研究者根据表型、大小等特征自行命名，如如F因子因子(fertility factor，致育因子致育因子)、R质粒质粒(resistance factor，抗性质粒抗性质粒)和和Col质粒质粒(colicin，大肠杆菌毒素质粒大肠杆菌毒素质粒)等。等。随着研究工作的深入和发展，愈来愈多的含有质粒的微生物随着研究工作的深入和发展，愈来愈多的含有质粒的微生物新类群和新质粒被发现，由于缺乏统一的命名规则而导致文新类群和新质
7、粒被发现，由于缺乏统一的命名规则而导致文献中质粒名称的混乱。直至献中质粒名称的混乱。直至1976年年Novick等才提出一个可等才提出一个可为质粒研究者普遍接受和遵循的命名原则。为质粒研究者普遍接受和遵循的命名原则。其规则是：其规则是：u质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成，第一个字质粒的名称一般由三个英文字母及编号组成，第一个字母一律用小写母一律用小写p表示，后两个字母应大写，可以采用发现表示，后两个字母应大写，可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。u编号为阿拉伯数字，用于区分属于同一类型的不同质粒，编号为阿拉伯数字
8、，用于区分属于同一类型的不同质粒，如如pUC18和和pUC19等。等。第二节第二节 质粒的遗传特征质粒的遗传特征一、一、质粒的大小和拷贝数质粒的大小和拷贝数 质粒的大小：以分子质量质粒的大小：以分子质量MDMD或碱基对数或碱基对数kbkb表示，表示，1MD1MD的双链的双链DNA=1.65kbDNA=1.65kb。质粒的大小质粒的大小一般在一般在1-200kb，最大的可达最大的可达1400kb(如苜蓿根瘤如苜蓿根瘤菌菌质粒质粒pRm141a)。质粒的拷贝数是指同一质粒在每个细胞中的数量，不同的质粒的拷贝数是指同一质粒在每个细胞中的数量，不同的质粒在同一细胞中的拷贝数有差异。质粒在同一细胞中的拷
9、贝数有差异。质粒拷贝数是确定某种质粒特性的一个重要参数，从中也质粒拷贝数是确定某种质粒特性的一个重要参数，从中也可获得其复制本质的基本信息。一般而言，质粒的拷贝数可获得其复制本质的基本信息。一般而言，质粒的拷贝数与其分子质量成反比关系，分子质量大的拷贝数低，分子与其分子质量成反比关系，分子质量大的拷贝数低，分子质量小的拷贝数高。质量小的拷贝数高。质粒可根据其拷贝数分为质粒可根据其拷贝数分为严谨型质粒（严谨型质粒（Stringent plasmid）和和松弛型质粒（松弛型质粒（Relaxed plasmid）。n 质粒在细胞内复制时受到控制而与染色体复制同步进行，被质粒在细胞内复制时受到控制而与
10、染色体复制同步进行，被称为严称为严谨谨型质粒。其拷贝数也低，通常只有型质粒。其拷贝数也低，通常只有1-3个拷贝。个拷贝。如如F质粒，每个细胞中只有质粒，每个细胞中只有1-2个拷贝，它们的复制受到严格个拷贝，它们的复制受到严格控制，属于严控制，属于严谨谨型质粒或低拷贝质粒。型质粒或低拷贝质粒。n 另一类质粒的复制与染另一类质粒的复制与染色体复制不同步，称为松驰型质粒。色体复制不同步，称为松驰型质粒。通常每个细胞含有通常每个细胞含有10-100个拷贝，属于高拷贝质粒。个拷贝，属于高拷贝质粒。分子量小的分子量小的CoLEl质质粒，每个细胞中有粒，每个细胞中有10-100个拷贝，个拷贝，它们的复制不受
11、到严格控制，称为松弛型质粒或高拷贝质粒。它们的复制不受到严格控制，称为松弛型质粒或高拷贝质粒。含有松弛型质粒的菌株在含有氯霉素的培养液中细胞分裂含有松弛型质粒的菌株在含有氯霉素的培养液中细胞分裂受到抑制，染色体受到抑制，染色体DNA也停止了复制，但所含的也停止了复制，但所含的ColEl质粒质粒可持续复制可持续复制1015小时，直到每一个细胞中含有小时，直到每一个细胞中含有1 0003 000个质粒。基因工程研究中所用的载体质粒大多数是这一个质粒。基因工程研究中所用的载体质粒大多数是这一类型的质粒。类型的质粒。n 控制拷贝数的基因存在质粒上，同时也是宿主和质粒相互控制拷贝数的基因存在质粒上，同时
12、也是宿主和质粒相互作用的结果。作用的结果。类型类型代表质粒代表质粒大小（大小（kb）拷贝数拷贝数宿主宿主表型特征表型特征致育因子F因子95-1001-3大肠杆菌,沙门氏菌,柠檬酸杆菌性纤毛、接合转移R质粒RP4541-3假单胞菌和其它G阴性菌性纤毛、接合转移，抗Ap、Km、Nm、TcR1801-3G阴性菌抗Ap、Km、Su、Cm、SmR6981-3大肠杆菌,奇异变形杆菌抗Km、Nm、Su、Cm、SmR100901-3大肠杆菌,志贺杆菌,沙门氏菌Cm,Sm,Su,Tc,HgpSH621金黄色葡萄球菌Gm,Tm,KmpAD225粪肠球菌Em,Sm,KmCol质粒ColE1910-30大肠杆菌产大肠
13、杆菌素E1ColE210-15志贺杆菌产大肠杆菌素E2ColDF13阴沟杆菌产大肠杆菌素DF13毒性质粒Ent（P307）83大肠杆菌产肠毒素K88质粒大肠杆菌粘附抗原ColV-K302大肠杆菌摄铁载体,免疫机制抗性pZA1056金黄色葡萄球菌肠毒素BTi200根癌农杆菌诱导肿瘤代谢质粒CAM230假单胞菌樟脑降解SAL56假单胞菌水杨酰降解TOL75恶臭假单胞菌甲苯降解pJP4假单胞菌2,4-二氯苯乙酰降解pSym根瘤菌共生固氮质粒大小和类型质粒大小和类型 二、二、质粒的复制质粒的复制 复制子复制子(replicon)是一个复制单位，细菌染色体是一个复是一个复制单位，细菌染色体是一个复制子，
14、每一个质粒也是一个复制子。制子，每一个质粒也是一个复制子。复制起点是复制子起始复制的部位，作为一个复制子，复制起点是复制子起始复制的部位，作为一个复制子，至少需要有一个复制起点，即至少需要有一个复制起点，即ori位点。大肠杆菌染色体的位点。大肠杆菌染色体的复制起点称为复制起点称为oriC，质粒的复制起点叫做质粒的复制起点叫做oriV。质质 粒粒 复复 制制 子子 拷拷 贝贝 数数pBR322及其衍生质粒及其衍生质粒pMB1 15-20pUC系列质粒系列质粒 pMB1 500-700pACYC及其衍生质粒及其衍生质粒 p15A 10-12pSC101及其衍生质粒及其衍生质粒 pSC101 5 C
15、olE1 ColE1 15-20几种常见质粒载体所携带的复制子几种常见质粒载体所携带的复制子质质粒的复制主要是通粒的复制主要是通过过型复型复制和制和滚环滚环复制两种方式之一复制两种方式之一进进行的，其中以行的，其中以型复制型复制为为主。主。在在型复制中，有型复制中，有单单向复制和向复制和双向复制两种双向复制两种类类型。型。革兰氏阴性细菌中多数质粒是革兰氏阴性细菌中多数质粒是以以型方式复制，型方式复制，R1、R100等等是是单单向复制，向复制，F、R6k等是双等是双向复制向复制类类型。型。1.质粒复制的方式质粒复制的方式 质粒滚环复制示意图质粒滚环复制示意图质粒只编码一种或质粒只编码一种或少数几
16、种与复制有少数几种与复制有关的蛋白质，而复关的蛋白质，而复制所需要的其他蛋制所需要的其他蛋白，如白，如DNADNA聚合酶、聚合酶、引物酶、连接酶、引物酶、连接酶、RNA-HRNA-H酶、旋转酶酶、旋转酶(gyrasegyrase)和拓扑异和拓扑异构酶构酶I I、DnaBDnaB和和DnaCDnaC等都是利用寄等都是利用寄主的复制酶体系。主的复制酶体系。在革兰氏阳性细菌中大多在革兰氏阳性细菌中大多数质粒是以滚环方式复制。数质粒是以滚环方式复制。v 复复制制起起点点是是一一段段特特定定的的DNA序序列列，长长约约几几百百碱碱基基对对，在在其其相相关关的的调调控控元元件件中中含含有有由由质质粒粒或或
17、宿宿主主染染色色体体编编码码的的、参参与与DNA合成起始调控因子的结合位点。合成起始调控因子的结合位点。v 在在大大多多数数质质粒粒中中，与与复复制制有有关关的的蛋蛋白白质质基基因因位位于于它它们们的的作作用用位位点点ori序序列列附附近近，因因此此ori位位点点周周围围的的小小范范围围DNA是是质质粒复制所必需的。粒复制所必需的。v 如如果果质质粒粒DNA的的大大部部分分区区域域被被去去掉掉，而而只只保保留留质质粒粒的的ori序列，而且质粒是环状的，则质粒仍然能进行复制。序列，而且质粒是环状的，则质粒仍然能进行复制。2.复制起点复制起点(ori)区的功能区的功能 v 将将ori区区克克隆隆到
18、到一一个个不不能能自自主主复复制制的的环环状状双双链链DNA分分子子上上并并引引入入到到原原核核细细胞胞后后，该该重重组组DNA具具有有自自主主复复制制能能力力。分分子子克克隆隆中中常常用用的的质质粒粒载载体体就就是是以以这这种种方方法法构构建建的的，同同时时用用这这种方法可以确定哪部分种方法可以确定哪部分DNA是是ori区并研究区并研究ori区的功能。区的功能。vori区区域域常常决决定定了了质质粒粒的的许许多多特特性性，如如质质粒粒的的寄寄主主范范围围和和质质粒的拷贝数。粒的拷贝数。质粒的寄主是指质粒能在其中自我复制的生物种类。质粒质粒的寄主是指质粒能在其中自我复制的生物种类。质粒的寄主范
19、围通常是由的寄主范围通常是由ori区决定的。有些质粒如区决定的。有些质粒如ColEl类型的类型的质粒，包括质粒，包括pBR322、pET和和pUC具有较窄的寄主范围，这具有较窄的寄主范围，这些质粒只在些质粒只在E.coli及一些亲缘关系较近的如沙门菌和克氏杆及一些亲缘关系较近的如沙门菌和克氏杆菌菌(Klebsiella)中复制。中复制。相反，相反，RP4、RK2和和RSFl010及从及从G+细菌中分离的滚环复制细菌中分离的滚环复制的质粒都属于广寄主范围的质粒都属于广寄主范围(broad host range)质粒。广寄主范质粒。广寄主范围的质粒一般能编码与复制起始有关的所有蛋白，这样就不围的质
20、粒一般能编码与复制起始有关的所有蛋白，这样就不依赖于寄主的功能。依赖于寄主的功能。三、三、质粒复制的调控质粒复制的调控 质粒的复制机理与细菌染色体的基本相同，但质粒的复制机理与细菌染色体的基本相同，但二者之间的复制调控则有区别。至今所研究的质粒，二者之间的复制调控则有区别。至今所研究的质粒，其复制调控一般采用直接或间接的负调控机制，负其复制调控一般采用直接或间接的负调控机制，负调控因子可以是蛋白质、调控因子可以是蛋白质、RNA或或DNA重复序列。重复序列。目前关于质粒的调控大致可以分为两种类型：目前关于质粒的调控大致可以分为两种类型：抑制物抑制物-靶位调控（靶位调控（inhibitor-tar
21、get regulation）重复子重复子-竞争结合调控（竞争结合调控（iteron-binding regulation）1.抑制物抑制物-靶位调控靶位调控u特点是依赖一小段反向转录的特点是依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物，通作为抑制物，通过与目标过与目标RNA的互补结合阻止质粒复制的起始。的互补结合阻止质粒复制的起始。u目标目标RNA是质粒是质粒DNA复制的引物或用于编码复制所复制的引物或用于编码复制所需的需的Rep蛋白的蛋白的mRNA。u属于这一类复制调控的质粒有属于这一类复制调控的质粒有ColE1、pT181、p15A、pMB1、RSF1010、CloDF13、R1等。等。1）Co
22、lE1质粒的复制调控质粒的复制调控 ColE1为为6.6kb的小质粒，拷贝数的小质粒，拷贝数1020。其复制。其复制不需任何质粒编码的蛋白质，而是完全依赖于宿主提不需任何质粒编码的蛋白质，而是完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质，包括分子伴侣、供的寿命较长的酶和蛋白质，包括分子伴侣、DNA聚聚合酶合酶I和和,DNA依赖的依赖的RNA聚合酶、核糖核酸酶聚合酶、核糖核酸酶H(RNase H),DNA促旋酶和拓扑异构酶促旋酶和拓扑异构酶I。ColE1质粒质粒DNA的复制，从的复制，从oriV开始，单向进行。控开始，单向进行。控制此种质粒制此种质粒DNA复制启动的两种关键因素复制启动的两种关键因素
23、RNAI和和RNA，以及另一种负调控因子，以及另一种负调控因子Rop蛋白，都是由蛋白，都是由ColE1 DNA转录产生的。转录产生的。uRNA也叫做复制引物。也叫做复制引物。RNA分子在转录起点附近同互补分子在转录起点附近同互补的模板的模板DNA形成一种杂交分子，被形成一种杂交分子，被RNaseH酶所切割，从而释酶所切割，从而释放出放出3-OH末端，作为供末端，作为供DNA聚合酶聚合酶合成合成DNA的引物。的引物。RNA前体的合成起始于其复制起点上游前体的合成起始于其复制起点上游555bp处的启动子处的启动子区，继而穿过复制起点，终止于下游大约区，继而穿过复制起点，终止于下游大约150个核苷酸
24、附近的个核苷酸附近的一个位点。此约一个位点。此约750个核苷酸的起始转录物的个核苷酸的起始转录物的5端折叠成复杂的端折叠成复杂的二级结构，从而使二级结构，从而使RNA产生一个富产生一个富G环，后者与位于模板链复环，后者与位于模板链复制起点上游制起点上游20个核苷酸处的质粒个核苷酸处的质粒DNA富富C区正好匹配。随后，区正好匹配。随后，该该RNA转录产物由转录产物由RNaseH加工为成熟引物，其切割位点位于加工为成熟引物，其切割位点位于复制起点内复制起点内5个个A序列中。所得的序列中。所得的555个核苷酸的成熟个核苷酸的成熟RNA II被被DNA聚合酶聚合酶I用作引物启动前导链的合成。用作引物启
25、动前导链的合成。质粒质粒DNA的复制过程的复制过程uRNA是复制的负调节物是复制的负调节物 RNA可以通过同可以通过同RNA结合，结合，以阻止其与模板以阻止其与模板DNA发生杂交作用。发生杂交作用。colE1复制子不能影响质粒复制所必需的宿主酶的活性，复制子不能影响质粒复制所必需的宿主酶的活性，因此，一旦因此，一旦DNA合成启动后，便不能改变其速度或进程。合成启动后，便不能改变其速度或进程。故而拷贝数的控制必须在故而拷贝数的控制必须在DNA复制启动时或启动前进行。复制启动时或启动前进行。质粒质粒DNA的合成依赖于复制起点处稳定的的合成依赖于复制起点处稳定的DNA-RNA II杂交体的形成。正常
26、情况下，复制的起始是由正确折叠与不杂交体的形成。正常情况下，复制的起始是由正确折叠与不当折叠的当折叠的RNA II间相互转化的平衡来控制的，前者可形成间相互转化的平衡来控制的，前者可形成稳定的杂交体，后者则不能。稳定的杂交体，后者则不能。这一平衡的改变主要由这一平衡的改变主要由RNA来控制，来控制，RNA是由是由RNA基因的反义链编码的基因的反义链编码的108个碱基小分子转录物。它个碱基小分子转录物。它折叠成可与新生折叠成可与新生RNA II前体结合的三叶草结构，从而阻止前体结合的三叶草结构，从而阻止后者折叠成形成稳定杂交体所必需的二级结构后者折叠成形成稳定杂交体所必需的二级结构。ColE1质
27、粒复制起点结构质粒复制起点结构与与RNA I的的配配对对有有可可能能引引起起引引物物RNA二二级级结结构构的的改改变变，从从而而阻阻止止了了3-OH 的的产产生生（RNaseH 不不能能切切割割）uROM/ROP蛋白对蛋白对RNA负调节活性的调控负调节活性的调控由质粒编码的一种被称为由质粒编码的一种被称为ROM(RNA modulator)或或ROP(repressor of primer)的蛋白质可提高的蛋白质可提高RNA与与RNA结合的效率。结合的效率。ROM蛋白通过促进蛋白通过促进RNA和和RNA杂杂交体的形成，增强交体的形成，增强RNA的负调节作用。的负调节作用。ROM是含有是含有63
28、个氨基酸的多肽的同型二聚体，它由位于个氨基酸的多肽的同型二聚体，它由位于colE1复制起点下游复制起点下游400个核苷酸处的一个基因所编码。该个核苷酸处的一个基因所编码。该二聚体每个亚单位含有由一个转角连接的两个二聚体每个亚单位含有由一个转角连接的两个螺旋，因而螺旋，因而此二聚体是由此二聚体是由4个个螺旋组成的呈双重对称的紧密束状结构。螺旋组成的呈双重对称的紧密束状结构。ROM蛋白与蛋白与RNA和和RNA具有相似的亲和力。它促使具有相似的亲和力。它促使这两种这两种RNA分子的互补结合物由不稳定的中间体变为更稳定分子的互补结合物由不稳定的中间体变为更稳定的结构。的结构。rom/rop基因缺失至少
29、可使基因缺失至少可使colE1质粒拷贝数提高两个数量级。例质粒拷贝数提高两个数量级。例 如，如，rom/rop基因的缺失可使较早期组建的载体基因的缺失可使较早期组建的载体pBR322在每个细菌细胞中的在每个细菌细胞中的质粒拷贝数从质粒拷贝数从1520个增至个增至500个以上，在个以上，在rom/rop基因中插入一段外源基因中插入一段外源DNA片段，则可导致致死性的大量质粒片段，则可导致致死性的大量质粒DNA复制。复制。2）R1质粒的复制调控质粒的复制调控uR1质粒是质粒是IncF类型的代表质粒，其复制调控也是在类型的代表质粒，其复制调控也是在RNA和蛋白质的作用下进行的，但和蛋白质的作用下进行
30、的，但RNA是间接调控的。是间接调控的。u质粒复制起始所必需的质粒复制起始所必需的RepA蛋白能在两个启动子的作用蛋白能在两个启动子的作用下转录。质粒刚进入细胞尚无下转录。质粒刚进入细胞尚无CopB时，时，RepA在自身启动在自身启动子下迅速转录；当达到适当的拷贝数时，子下迅速转录；当达到适当的拷贝数时，PrepA启动子被启动子被CopB阻遏，阻遏，RepA只能从只能从PcopB转录。转录。ucopA自身启动子带动下从自身启动子带动下从repA基因的互补链进行转录，基因的互补链进行转录，因此其因此其RNA与与repA的翻译起始区重叠但转录方向相反，二的翻译起始区重叠但转录方向相反，二者之间形成
31、双链结构，被染色体编码的切割双链者之间形成双链结构，被染色体编码的切割双链RNA的的RNase降解。降解。BBBAAAPcopARNase2.重复子重复子-竞争结合调控竞争结合调控nF、P1、R6k、RK2、RP4和和pSC101等质粒是通过等质粒是通过RepA进行复制调控的，它们在复制起始位点（进行复制调控的，它们在复制起始位点（ori）和复制基因（和复制基因（rep）附近存在多个）附近存在多个17-22bp的的DNA短短片段，这些短片段被叫做重复子（片段，这些短片段被叫做重复子（iteron），含有重），含有重复子序列的质粒也叫重复子质粒（复子序列的质粒也叫重复子质粒（iteron pla
32、smid）。）。n重复子能与复制必需的重复子能与复制必需的RepA蛋白竞争性结合，从而蛋白竞争性结合，从而抑制了质粒的复制和拷贝数的增加。抑制了质粒的复制和拷贝数的增加。转录自体调控（转录自体调控（transcriptional autoregulation）：）：RepA蛋白通过与自身启动子区结合而抑制自身的合成蛋白通过与自身启动子区结合而抑制自身的合成p质粒浓度较低时，质粒浓度较低时，RepA只与一个质粒结合；质粒浓只与一个质粒结合；质粒浓度较高时，度较高时，RepA通过与重复子序列的结合使两个质粒通过与重复子序列的结合使两个质粒联结在一起，因此阻止了质粒的复制。联结在一起，因此阻止了质粒
33、的复制。p重复子质粒的复制不仅受重复子质粒的复制不仅受RepA蛋白浓度的控制，而蛋白浓度的控制，而且受质粒浓度，更确切地说重复子序列浓度的控制。且受质粒浓度，更确切地说重复子序列浓度的控制。偶联模型（偶联模型（coupling or handcuffing model）：）：重复重复子序列间的相互作用使两个质粒偶联在一起，从而抑制子序列间的相互作用使两个质粒偶联在一起，从而抑制了质粒复制的起始。了质粒复制的起始。四、四、不相容性和质粒的类群不相容性和质粒的类群质粒不相容性：质粒不相容性：是指亲缘关系相近的两种质粒，在非选择性条是指亲缘关系相近的两种质粒，在非选择性条件下常不能稳定地存在于同一个
34、细胞中，经过若干代的培养，件下常不能稳定地存在于同一个细胞中，经过若干代的培养，只含有同一种质粒的细胞越来越多，而含有两种质粒的细胞相只含有同一种质粒的细胞越来越多，而含有两种质粒的细胞相对减少。对减少。这种现象称为质粒的不相容性（这种现象称为质粒的不相容性（incompatibility）。）。一般来说，同种质粒衍生物是不相容的，而不同质粒的一般来说，同种质粒衍生物是不相容的，而不同质粒的衍生物衍生物则可能是相容性的，也可能是不相容性的。则可能是相容性的，也可能是不相容性的。n 质粒的不相容性也是与质粒复制起始的控制密切相关的。质粒的不相容性也是与质粒复制起始的控制密切相关的。由于性状相近的
35、质粒通常具有相同或相似的复制调控机制，由于性状相近的质粒通常具有相同或相似的复制调控机制，其阻遏物其阻遏物(抑制物或重复序列抑制物或重复序列)亦相似，在调控时，它们也能亦相似，在调控时，它们也能随机地与其中的任一质粒的复制区结合而阻遏了其复制过程，随机地与其中的任一质粒的复制区结合而阻遏了其复制过程，并进而使之在子代细胞中丢失。并进而使之在子代细胞中丢失。由于阻遏物的结合是随机的，因此两个质粒在由于阻遏物的结合是随机的，因此两个质粒在子子代细胞中的代细胞中的出现几率相等，即各占出现几率相等，即各占50。对于高拷贝数质粒而言，质。对于高拷贝数质粒而言，质粒在子代细胞中的丢失需要多次分裂才能实现。
36、粒在子代细胞中的丢失需要多次分裂才能实现。n 有些质粒能够稳定地存在于同一细胞中，是因为控制拷贝有些质粒能够稳定地存在于同一细胞中，是因为控制拷贝数的机制完全不同。数的机制完全不同。例如，例如，F质粒和质粒和ColE1质粒二者是相容的，也就是说，它们质粒二者是相容的，也就是说，它们分别属于不同的不相容群（分别属于不同的不相容群（different incompatibility group）。）。有些细菌在同一个细胞中可以含有几种不同类型的质粒，例有些细菌在同一个细胞中可以含有几种不同类型的质粒，例如，如，Borrelia burgdorferi（博氏疏螺旋体博氏疏螺旋体）含有含有17种不种不
37、同类型的环状和线状质粒。同类型的环状和线状质粒。n 在细菌中已区分出大量的不相容群（在细菌中已区分出大量的不相容群（Inc），），同一种不相同一种不相容群的质粒享有调节它们复制子的共同机制。容群的质粒享有调节它们复制子的共同机制。因此，也可以根据复制子是否相同来划分质粒的不相容群，因此，也可以根据复制子是否相同来划分质粒的不相容群，携带有相同复制子的不同质粒属于同一不相容群，它们不携带有相同复制子的不同质粒属于同一不相容群，它们不能共存于同一细能共存于同一细菌菌中。中。带带有不同复制子的质粒属于不同的不相容群，它们可以共有不同复制子的质粒属于不同的不相容群，它们可以共存于同一细存于同一细菌菌中
38、。例如中。例如p15A、R6K、F能与能与colE1质粒相质粒相容。容。细菌种类细菌种类 质粒不相容群质粒不相容群 代表性质粒代表性质粒 革兰氏阴性细菌革兰氏阴性细菌IncFF,R386,R455,F,R386,R455,ColVColVIncFR1,R100R1,R100IncFCol1B-K98Col1B-K98IncFIncFR124R124IncAIncARA1RA1IncCIncCR40a,R55R40a,R55IncHIncHR27,R726R27,R726IncIIncIColIb-P9,R144,R483,R64,R621aColIb-P9,R144,R483,R64,R621
39、aIncMIncMR69,R466bR69,R466bIncNIncNR46,R15,N3,pKM101R46,R15,N3,pKM101IncOIncOR16,R723R16,R723IncPIncPRP1,RP4,R68,R751,R690,RK2RP1,RP4,R68,R751,R690,RK2IncQIncQRSF1010,pKT212,pKT230,RSF1010,pKT212,pKT230,pGSSpGSSIncWIncWR7K,R388,pSA747R7K,R388,pSA747IncXIncXR6KR6K 革兰氏阳性细菌革兰氏阳性细菌pT181pT181pT181,pC221,
40、pS194,pC223,pUB112,pE194pT181,pC221,pS194,pC223,pUB112,pE194pUB110pUB110pBC110,pBC16pBC110,pBC16pSN2pSN2pSN2,pE12,pIM13pSN2,pE12,pIM13五、五、质质粒的粒的稳稳定性定性(细细胞分裂中的胞分裂中的质质粒分配粒分配)质粒的不稳定性（质粒的不稳定性（plasmid instability）包括两个方面：）包括两个方面：分离的不稳定性（分离的不稳定性（segregation instability）：）：指在细胞分裂过程中，有一个细胞没有获得质粒指在细胞分裂过程中，有一个
41、细胞没有获得质粒DNA，并最终增殖成为无质粒的优势群体，并最终增殖成为无质粒的优势群体结构的不稳定性（结构的不稳定性（structural instability）：指）：指由于转座作用或重组作用引起的质粒由于转座作用或重组作用引起的质粒DNA的重排的重排或缺失。或缺失。1 1、每个世代每个质粒平均都必须至少发生一次复制；、每个世代每个质粒平均都必须至少发生一次复制；2 2、当细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须平均分配、当细胞分裂时，复制产生的质粒拷贝必须平均分配 到两个子细胞中去。到两个子细胞中去。要使质粒能够保持稳定的遗传，至少需要满足下要使质粒能够保持稳定的遗传，至少需要满足下面两个方面
42、的条件：面两个方面的条件：在细胞分裂过程中，质粒分配到子细胞的途径可分为：在细胞分裂过程中，质粒分配到子细胞的途径可分为：随机分配随机分配(random distribution)主动分配主动分配(active distribution)这些质粒的稳定性是通过两种机制来实现的：这些质粒的稳定性是通过两种机制来实现的：（1 1）质质粒粒编编码码的的基基因因产产物物，如如质质粒粒编编码码的的致致死死蛋蛋白白来来抑抑制不含质粒的子细胞。制不含质粒的子细胞。（2 2）质粒上的分配体系（）质粒上的分配体系（par）。1.主主动动分配的机理分配的机理 对低拷贝质粒而言，需要某种特定机制，将细胞分裂对低拷贝
43、质粒而言，需要某种特定机制，将细胞分裂与质粒复制协调起来，以保证每个细胞至少获得一个拷与质粒复制协调起来，以保证每个细胞至少获得一个拷贝。目前已对贝。目前已对F、R1分配机制进行了深入研究。分配机制进行了深入研究。par区叫做分配区区叫做分配区(partition region)或分配座位或分配座位(partition locus)：是指在细胞分裂过程中使质粒拷贝数均等的分配到是指在细胞分裂过程中使质粒拷贝数均等的分配到子子细胞中的质粒细胞中的质粒DNA序列。序列。在在F质粒中质粒中par区是同复制起点紧密相邻的，而在区是同复制起点紧密相邻的，而在R1质粒质粒中则是远离其复制起点。质粒的复制与
44、分配是分开独立进中则是远离其复制起点。质粒的复制与分配是分开独立进行的，而且行的，而且par区还会使无亲缘关系的其他质粒保持稳定。区还会使无亲缘关系的其他质粒保持稳定。n主动分配体系的主动分配体系的par区区GGTCTGATTATTAGTCTGGGACCACGGTCCCACTCGTATCGTCCCAGACTAATAATCAGACCCTGGTGCCAGGGTGAGCATAGCAG-35-10SDsopAsopBsopCSopASopB在在F F质粒中，质粒中，parpar区由区由sopAsopA和和sopBsopB两个基因及两个基因及sopCsopC区组成区组成sopAsopA和和sopBsop
45、B反反式作用基因式作用基因sopCsopC:顺顺式作用位点，式作用位点，也叫类着丝粒位点也叫类着丝粒位点12个个43bp的正向重复序列的正向重复序列SopB与与sopC区区结结合，形成蛋合，形成蛋白白-核酸复合物，核酸复合物，该该复合物参复合物参与与质质粒的分配。粒的分配。sopA和和sopB构成构成一个转录单位，一个转录单位，其产物其产物SopA和和SopB两种蛋白协两种蛋白协同抑制同抑制sopAB操操纵子的转录，属纵子的转录，属于自体阻遏蛋白。于自体阻遏蛋白。有一对有一对7bp的反向重复序列的反向重复序列 SopA蛋蛋白白与与sopAB转转录录单单位位的的启启动动子子区区的的操操纵纵基基因
46、因结结合合，对其转录进行调控；对其转录进行调控；SopB蛋蛋白白虽虽不不能能与与sopAB操操纵纵子子的的启启动动子子结结合合，但但它它能能促进促进SopA蛋白的结合能力。蛋白的结合能力。因因此此，SopB蛋蛋白白必必须须维维持持在在适适当当的的浓浓度度，才才能能保保证证F质质粒在细胞内的稳定性。粒在细胞内的稳定性。复制复制质粒质粒分配分配细胞分裂细胞分裂质粒质粒分配复合体分配复合体复制体复制体一种尚未知的结构很快地将一种尚未知的结构很快地将两个质粒移向细胞的两极。两个质粒移向细胞的两极。细菌质粒细菌质粒DNA的分配模型图的分配模型图质粒质粒DNA在位于细胞中央在位于细胞中央的复制体的复制体(
47、replisome)的作的作用下进行复制。质粒复制用下进行复制。质粒复制后，分配蛋白与后，分配蛋白与sopCsopC位点位点结合形成分配复合物。结合形成分配复合物。复制后的质粒均等地分配到两复制后的质粒均等地分配到两个子细胞中，分配后的质粒可个子细胞中，分配后的质粒可能在分配蛋白的作用下，定位能在分配蛋白的作用下，定位于细胞的特定区域。于细胞的特定区域。F质质粒粒基基因因组组中中控控制制寄寄主主致致死死功功能能的的基基因因ccdA和和ccdB，属属于于同同一一个个自自我我调调节节的的操操纵纵子子，分分别别编编码码8.3kD和和11.7kD的两种蛋白。的两种蛋白。在在含含质质粒粒的的细细胞胞中中
48、，CcdA蛋蛋白白作作为为解解毒毒剂剂专专门门与与毒毒剂剂CcdB蛋白蛋白结结合，并使之失效。合，并使之失效。在在没没有有CcdA蛋蛋白白的的情情况况下下，CcdB蛋蛋白白通通过过抑抑制制DNA解解旋旋酶酶的的活活性性，或或引引发发解解旋旋酶酶诱诱导导寄寄主主染染色色体体DNA发发生生双双链链断断裂裂，从从而而使使染染色色体体在在细细胞胞分分裂裂过过程程中中无无法法进进行行正正确确的的分分配。配。n寄主致死体系（寄主致死体系（host-killing mechanism）在新在新产产生的无生的无质质粒的子粒的子细细胞中，开始的胞中，开始的时时候是含有候是含有CcdA和和CcdB这这两种蛋白两种
49、蛋白质质的。的。但由于但由于无无ccd操操纵纵子子可可发发生生进进一步的一步的转录转录，因此随后，因此随后这这两两种蛋白种蛋白质质的的浓浓度便逐度便逐渐渐下降。毒下降。毒剂剂CcdB和解毒和解毒剂剂CcdA具具有不同的有不同的稳稳定性，是定性，是导导致分裂后致分裂后细细胞致死的关胞致死的关键键因素。因素。CcdA蛋白蛋白质质不不稳稳定，易被蛋白水解定，易被蛋白水解酶酶(protease)降解，于降解，于是是较稳较稳定的定的CcdB蛋白蛋白质质便可行使其便可行使其对对寄主寄主细细胞的致死作用。胞的致死作用。随随机机分分配配：是是指指在在细细胞胞分分裂裂过过程程中中质质粒粒拷拷贝贝数数在在两两个个
50、子子细细胞胞之之间间是是随随机机分分配配的的。在在一一般般情情况况下下，通通过过随随机机分分配配质质粒粒也也能能够够得得到到稳稳定定的的遗遗传传，但但在在分分裂裂中中也也会会出出现现无无质质粒粒的的子子细胞。细胞。2.随机分配机制随机分配机制(random distribution)ColEl等等多多数数高高拷拷贝贝质质粒粒一一般般没没有有par基基因因，它它们们依依赖赖于于高高拷拷贝质贝质粒的随机分配来粒的随机分配来实现实现分裂分裂过过程中的程中的稳稳定性。定性。但但在在某某些些情情况况下下，尤尤其其是是在在recA+的的宿宿主主细细胞胞中中，ColE1常常能能彼彼此此重重组组而而形形成成多