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1、Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1实时荧光定量实时荧光定量PCRTaqMan探针法探针法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2 序列选取应在基因的保守区段；序列选取应在基因的保守区段；避免引物自身或与引物之间形成避免引物自身或与引物之间形成4个或个或4个以上连续配对，个以上连续配对，避免引物自身形成环状发卡结构；避免引物自身形成环状发卡结构；典型的引物典型的引物18到到24个核苷长。引物需要足够长，保证序个核苷长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位
2、点的可能性。列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。Tm值在值在5565，GC含量在含量在40%60%；引物之间的引物之间的TM相差避免超过相差避免超过2；引物的引物的3端避免使用碱基端避免使用碱基A，引物的，引物的3端避免出现端避免出现3个或个或3个以上连续相同的碱基；个以上连续相同的碱基；为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；Taqman探针技术要求片段长度在探针技术要求片段长度在50bp150bp；引物末端（最后引物末端（最后5个核苷酸）不能有超过个核苷酸）不能有超过2个的个的G和和C。TaqMan技术引物设计原则技术引
3、物设计原则Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics3TaqMan探针设计原则探针设计原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针；先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针；探针长度应在探针长度应在15-45bp（最好是（最好是20-30bp)，以保证结合特异性；，以保证结合特异性；探针的探针的DNA折叠和二级结构；尽量避开二级结构；折叠和二级结构；尽量避开二级结构；Tm值在值在65-70，通常比引物，通常比引物TM值高值高5-10（至少要（至少要5），以），以确保在退火过程中探针先于引物与目的片段结合，确保在退火过程中探针先于引
4、物与目的片段结合，GC含量在含量在40%70%；探针的探针的5端应避免使用端应避免使用G鸟嘌呤鸟嘌呤因为因为5G会有淬灭作用，而会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；整条探针中，碱基整条探针中，碱基C的含量要明显高于的含量要明显高于G的含量的含量G含量高会含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。一次，如果发现有非特异
5、性互补区，建议重新设计引物探针。Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics4Taqman MGB 探针设计探针设计探针的探针的5端避免出现端避免出现G，即使探针水解为单个碱基，与报，即使探针水解为单个碱基，与报告基团相相连的告基团相相连的G碱基仍可淬灭基团的荧光信号。碱基仍可淬灭基团的荧光信号。Tm值应为值应为65-67。尽量缩短尽量缩短Taqman MGB探针，但探针长度不少于探针，但探针长度不少于13bp。尽量避免出现重复的碱基，尤其是尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免出现碱基，应避免出现4个或个或4个以上的个以上的G重复出现。重复出现。原则上原则上MGB探针只要有一个碱基突变，探针只要有一个碱基突变，MGB探针就会检探针就会检测到测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号)。