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1、Biolink软件使用说明手册安装与卸载运行环境：1. 软件要求： Windows95、Windows98、WindowsMe、 Windows20002. 硬件要求最低配置： CPU：赛扬300内存：64M显示卡：标准VGA，256色显示模式以上硬盘需求：70M以上硬盘空间驱动器： CD-ROM其它设备：鼠标器、声卡（非必备）56Kmodem、XDSL、有线通等上网设备 建议配置： CPU：奔腾II 450内存：128M显示卡：SVGA，16K色以上显示模式其它设备同“最低配置” 安装biolink:您只须将载有的光盘放入光盘驱动器，双击“setup”项即可自动执行安装程序。将显示如下安装界
2、面：界面中的“1”、“2”、“3”、“4”、“5”分别表示安装的5个步骤，数字前面的*表示当前正要安装的项目，按“next”之后，按屏幕提示进行操作，完成安装。启动：安装完成后，在程序组中会出现运行的快捷方式，用户可以在【开始】/【程序】/【博联软件】菜单中单击“run.bat”启动。(程序组中还有一mysql启动快捷方式，mysql程序默认情况下在机器启动后自动运行，若mysql没有开启，请运行该快捷方式。)注册在使用本软件之前，必须先进行注册。注册界面如下：分别在“用户名”、“密码”、“序列号”输入框中输入购买本软件后给予的注册信息，然后按“注册”完成注册过程。界面窗口介绍biolink
3、软件启动以后，显示的窗口即为“主界面”。 Biolink主界面如下：主界面由“标题栏”，“菜单”、“工具栏”、“序列列表”、“序列显示窗”及“状态条”组成。是用户与软件交互，进行查询和分析的主要部分。标题栏 ： 位于主界面的顶部。显示 biolink 软件的版本信息，当前打开的项目名称。菜单 ： 位于主界面的上部，由“文件”，“编辑”，“功能”，“窗口”及“帮助”五个子菜单组成。 工具栏： 位于菜单下方，其中的按钮是菜单中常用基本工具的块捷键。将鼠标放在每个工具栏图标上面，可以看到对它的描述。序列列表： 位于主界面中部左侧。显示当前项目中包含的各序列的名称。序列显示框：位于主界面中部右侧。显示
4、项目中包含的全部序列。可选择使用各种颜色，来表示序列的不同核苷酸或氨基酸残基。状态条： 位于主界面底部。状态条左端显示当前操作的简要信息，右端显示序列显示窗口中鼠标选择的部分序列在序列中的位置。功能介绍 一、 文件菜单： 新建项目： o 单击“文件”菜单中的“新建项目”命令，建立一个新的项目。若当前没有项目打开，则新建一个项目，若当前有项目被打开，则此动作将关闭当前项目，并且给出提示，如下图：按“是”，则打开一个新项目，当前项目不保存。按“否”，则回到当前项目。打开已有项目： o 单击“文件”菜单中的“打开已有项目”命令。若没有新建过任何项目，则会给出提示，如下图：否则，选择已经存在的项目，并
5、按“确定”，则打开所选项目。（此动作将关闭当前项目）如下图：按“确定”，则打开选中的项目，显示如下：补充说明：每一行显示一条序列，拖动滚动条可以查看整条序列。双击序列号可以查看到该序列的详细信息（包括序列号、序列描述和整条序列）。保存当前项目： o 单击“文件”菜单中的“保存当前项目”命令，如果当前项目不是新建的，当前项目被保存，不给出任何提示。如果当前项目是新建的，则会弹出“保存项目”窗口，输入项目名称，保存项目。如下图：另存为： o 单击“文件”菜单中的“另存为.”命令。 o 输入需要保存的项目的项目名，并按“确定”，项目被保存为指定的名称（原项目仍存在）。删除当前项目： o 单击“文件”
6、-“删除当前项目”命令。系统会给出提示，确认是否要删除当前项目。如下图：注意：该操作会删除当前项目中所包含的所有序列信息和分析结果。关闭当前项目： o 单击“文件”菜单中的“关闭当前项目”命令，关闭当前正在使用的项目。导入序列： o 从文件添加： 指向“文件”-“导入序列”子菜单，单击“从文件添加”命令。 选择需要导入的序列文件，并按“确定”，该文件所包含的序列会在主窗口中显示出来。 现在只支持FASTA格式的序列文件。如下图：o 从网络添加： 指向“文件”-“导入序列”子菜单，然后单击“从网络添加”命令。弹出窗口如下： 选择要查询的数据库，现在共有NCBI的Nucleotide数据库和Pro
7、tein数据库以及Swiss-prot数据库。 选择要显示的记录数。当选择的是NCBI数据库时，可以设置符合查询条件的返回记录数，该数值的大小决定了查询速度的快慢 输入查询条件，并按“查询”，则满足条件的序列在查询结果框中显示。 选择需要导入的序列，并按“获取序列”，所选序列被导入。 选择需要查看详细信息的序列，按“网络信息”，可以从网络上直接查看序列信息。 单击“关闭”按钮，关闭数据库查询窗口。保存序列： o 单击“文件”菜单中的“保存序列”命令，保存当前选择的序列。删除序列： o 单击“文件”菜单中的“删除序列”命令，删除当前选择的序列。系统会弹出确认窗口要求确认删除。如下图：按“是“，删
8、除所选序列。按“取消“，取消该操作。退出： o 单击“文件”菜单中的“退出”命令，退出本系统。二、 编辑菜单：是对序列文件进行相关的操作 撤销： 单击“编辑”菜单中的“撤销”命令，撤消上一步的操作。恢复： 单击“编辑”菜单中的“恢复”命令，恢复上次撤销所进行的操作。 剪切： 选中要编辑的序列的某一段。 单击“编辑”菜单中的“剪切”命令，把选中的这一段放入剪贴板，并在当前位置删除。 复制： 选择要编辑的序列的某一段。 单击“编辑”菜单中的“复制”命令，把选中的这一段放入剪贴板。粘贴： 在要放入信息的编辑栏中，单击要放入信息的位置 单击“编辑”菜单中的“粘贴”命令，把剪贴板中的内容插入当前位置。三
9、、 功能菜单：对序列进行分析，包括“等电点分析” 、“SSCP” 、“BLAST” 、“酶切图谱” 、“ORF” 、“PSORT” 、“理化性质” 、“DAS” 、“引物设计”。等电点分析： a) 选中要进行分析的序列，单击“功能”菜单中的“等电点分析”命令，进行等电点分析。在此，以一个序列号为AF1的序列为例，进行等电点分析，其余分析方法与之类似。按“是”，则弹出“分析结果”窗口，如下图：按“否”，则不查看结果。此序列的参数设置请参考等电点分析的参数设置。SSCP： b) 选中要进行分析的序列，单击“功能”菜单中的“SSCP”命令，进行SSCP分析。此序列的参数设置请参考SSCP参数设置。
10、BLAST： c) 选中要进行分析的序列，单击“功能”菜单中的“BLAST”命令，进行BLAST分析。此序列的参数设置请参考BLAST参数设置。酶切图谱： d) 选中要进行分析的序列，单击“功能”菜单中的“酶切图谱”命令，进行酶切图谱分析。此序列的参数设置请参考酶切图谱参数设置。 ORF： e) 选中要进行分析的序列，单击“功能”菜单中的“ORF”命令，进行ORF分析。此序列的参数设置请参考ORF参数设置。PSORT： f) 选中要进行分析的序列，单击“功能”菜单中的“PSORT”命令，进行PSORT分析。此序列的参数设置请参考PSORT参数设置。理化性质： g) 选中要进行分析的序列，单击“
11、功能”菜单中的“理化性质”命令，进行理化性质分析。此序列的参数设置请参考理化性质参数设置。DAS： h) 选中要进行分析的序列，单击“功能”菜单中的“DAS”命令，进行DAS分析。此序列的参数设置请参考DAS参数设置。 引物设计： i) 选中要进行分析的序列，单击“功能”菜单中的“引物设计”命令，进行引物设计分析。此序列的参数设置请参考引物设计参数设置。四、 窗口 输出窗口: a) 单击“窗口”菜单中的“输出窗口”命令，弹出“结果输出窗口”。 输出彩色序列（默认已选）: b) 单击“窗口”菜单中的“输出彩色序列”命令，则改变序列输出色彩，若命令选项前打“”，说明输出序列为彩色，否则为黑色。 五
12、、 帮助 帮助: a) 单击“帮助”菜单中的“帮助”命令获取帮助信息。 关于: b) 显示本软件的一些相关信息，包括版本号等等，按“关闭”即可退出。工具使用说明 序列分析：在软件主界面序列编辑框（右）编辑好序列，然后用鼠标点中左边相应的该序列ID号，单击工具菜单，选择相应工具按钮，点击，在弹出的对话框中选择相应参数后，最后确定。 查阅结果：直接查阅：软件在每一个序列分析完成后将自动弹出一个确认框，这时用户可以选择确定直接查阅分析的结果，也可以选择取消等以后再查阅分析结果；查阅所有结果：点击菜单栏上的窗口选项，选择输出窗口，所有结果文件都会在输出窗口中有列出来。选中文件名字，单击显示按钮或双击该
13、文件就可以查阅结果了。 结果文件处理：在输出窗口中，用户可以选择左边的功能按钮对结果文件进行处理。保存：将结果文件存在用户指定的文件夹中；打印：将结果文件内容在打印机上输出；删除：从硬盘上将此文件删除。分析工具使用说明： 1. 等电点分析 功能：计算蛋白质的等电点。 描述：等电点，指蛋白质所带的净电荷数为0（即不带电）时的pH值，是蛋白质重要的理化特性之一。根据氨基酸侧链的电荷数，就能够计算出给定pH值下，蛋白质所带电荷的理论值（将氨基酸侧链的电荷与氨基端和羧基端的电荷相加求和）。通过计算一定pH范围内蛋白质所带的净电荷数，就可找到等电点。本程序在假设不存在离子之间相互作用而改变离子化倾向的前
14、提下，从蛋白质的氨基酸组成来计算等电点。 输入：蛋白序列。 输出： o 一定pH值时蛋白序列所带的净电荷数列表（pH值的增幅为0.5） o 计算所得的等电点参数：无2. 蛋白质二级结构预测（SSCP）： 功能:此软件用于蛋白质二级结构，即双螺旋结构的分析预测。 输入：蛋白质的氨基酸序列； 输出：分为以下几个选项（百分比）： alpha-折叠 beta-螺旋 转角和螺旋卷曲 分类情况3. BLAST 功能: BLAST对一条或多条序列, 在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对。同时还能发现具有缺口的可能比对上的序列。 描述: BLAST是基于Altschul等人在J.Mol.Biol 上发表的方
15、法(J.Mol.Biol.215:403-410(1990),在序列数据库中对查询序列进行同源性比对工作。从最初的BLAST发展到现在NCBI提供的BLAST2.0,已将有缺口的比对序列也考虑在内了。BLAST可处理任何数量的序列,包括蛋白序列和核酸序列;也可选择多个数据库但数据库必须是同一类型的,即要么都是蛋白数据库要么都是核酸数据库。所查询的序列和调用的数据库则可以是任何形式的组合,既可以是核酸序列到蛋白库中作查询,也可以是蛋白序列到蛋白库中作查询,反之亦然。共有五种：1. 是核酸序列到核酸库中的一种查询。库中存在的每条已知序列都将同所查序列作一对一地核酸序列比对。2. 是蛋白序列到蛋白库
16、中的一种查询。库中存在的每条已知序列将逐一地同每条所查序列作一对一的序列比对。3. 是蛋白序列到核酸库中的一种查询。与相反，它是将库中的核酸序列翻译成蛋白序列，再同所查序列作蛋白与蛋白的比对。4. 是核酸序列到核酸库中的一种查询。此种查询将库中的核酸序列和所查的核酸序列都翻译成蛋白（每条核酸序列会产生条可能的蛋白序列），这样每次比对会产生种比对阵列。由于这种比对的复杂性，因此在比对中对缺口不予以考虑。5. 是核酸序列到蛋白库中的一种查询。先将核酸序列翻译成蛋白序列（一条核酸序列会被翻译成可能的六条蛋白），再对每一条作一对一的蛋白序列比对。输入：输入的形式是将所需查询的序列输入查询框。（注：可以
17、有两种形式：一种是FASTA格式的序列，一种是gi号。）输出：输入的形式是对查询序列和数据库作一简单介绍，依照序列位置的前后列出库中得分最高（HSPs）的序列名，列出HSP序列，标明同源程度和比对上的碱基，列出选用的一些参数。 参数：比对的显示方法：pairwise：标准的BLAST对其方式，查询序列于数据库序列一一对应。Query-anchored with identities：按照特征做固定查询。Query-anchored without identities：不按照特征做固定查询。Flat Query-anchored with identities。Flat Query-ancho
18、red without identities。显示的描述数目：显示的比对数目：4. 限制性内切酶图谱分析 功能: 用于辨别DNA序列中的限制性内切酶图谱的功能性。 输入：DNA序列。注：所有的a, c, g, t都被认为是碱基，其它所有字母都被忽视。 输出：其输出结果的窗口包含3个部分： a、所有查找到的酶的位置； b、按酶切的位点排列出所有查找出的酶； c、按照酶的先后顺序排列出所有的酶切位置。 参数：此软件中列出了超过400种以上的限制性内切酶，可以全部选择或部分选择或只选择其中的几种所需酶进行查看。 5. 开放阅读框（ORF） 功能：识别基因编码区。基因编码区指可以由核糖体翻译成蛋白质的
19、序列，它的5端有转录和翻译的起始位点（起始密码子），3端有转录和翻译的终止位点（终止密码子）。在原核基因中，编码区是一个单独的ORF；而真核基因的编码区通常包含几个不相连的ORF（被非编码序列，即内含子所分隔）。描述：识别 DNA序列中的开放阅读框，并将其翻译成相应的蛋白产物。一个开放阅读框（ORF）是指一个起始和终止密码子之间的序列。每条双链DNA有6个潜在的读框（reading frames）或称相位（phase）：一条链沿5-3方向有3个读框（forward），称为正向读框；则其互补链沿5-3方向的3个读框称为反向读框（reverse）。输入：DNA序列。 输出：显示蛋白产物的序列（以单
20、个字母表示）。 参数：For ORF longer than 300bp-限定开放阅读框的下限值为300bp（过短的ORF不太可能翻译成蛋白）。6. PSORT分析 功能：预测蛋白质在细胞内定位。 描述：PSORT是预测蛋白质在细胞内定位的程序。输入一条蛋白质序列和它的来源（如动物或酵母），PSORT会根据已知蛋 白信号肽等特征分析出输入序列在细胞中的定位及相关信息。CR: 信号肽N末端带电荷区域；UR：x信号肽中央疏水区域。 输入：氨基酸序列。 输出：可得到的结果有识别信号肽序列、跨膜区、膜的拓扑学结构、线粒体蛋白、核蛋白、叶绿体蛋白、微粒体蛋白、内 质网蛋白、溶酶体蛋白、脂蛋白和氨基酸组成
21、等。 1）对输入序列的确认概述 2）Step 1 原核生物 Lipop: 脂蛋白分析 Possible modific. site: -1 CR区域末端位置的更改，-1表示 未进行更改 CRend: 10 MCG: 识别信号肽 Length of UR: 2 Peak Value of UR: 0.80 Net Charge of CR: 0 Discriminant Score: -12.00 革兰式阴性菌中，大多数质膜和膜外蛋白在氨基端都有信号序列 （也称导向肽），介导新生肽进入细胞质膜后被切 除。一些膜蛋 白会保留一段信号肽序列。Discriminant Score为正值，分值越 高信号
22、肽序列存在的可能性越高 GvH：信号肽的切除 Signal Score (-7.5) 为正值，且分值越高意味着信号肽序列被切 除的可能性越高。Possible cleavage site表示信号肽 序列C末端 的切割位点。 Amino Acid Composition of Predicted Mature Form: 预测的成熟蛋白氨基酸组成分析 calculated from 1 正值越高，为外膜蛋白的可能性越高ALOM: Finding transmembrane regions (Klein et al.)跨膜区识别 count: 0 value: 34.06 threshold: 0
23、.0 PERIPHERAL Likelihood = 34.06 modified ALOM score: -7.31 通常，只有细胞质膜蛋白有疏水性跨膜区，因此可作为分类信号。 Count: 预测的跨膜区数 比较value和threshold的值，决定是否是结构蛋白 Rule: 蛋白定位 真核生物 MCG: 识别信号肽 GvH：信号肽的切除 Amino Acid Composition of Predicted Mature Form: 预测的成熟蛋白氨基酸组成分析ALOM: Finding transmembrane regions (Klein et al.)跨膜区识别 Gavel: 识
24、别线粒体导向肽 motif at: 3 Uncleavable? Ipos set to: 13 Discrimination of mitochondrial target seq.: negative (-0.64) 3）Step 2 真核生物 HDEL Count: 0 HDEL MOTIF，识别内质网 Checking apolar signal for intramitochondrial sorting Mitochondrial matrix? Score: 0.10 检测线粒体蛋白的非极性信号，对有线粒体导向肽的蛋白进行分类 SKL motif (signal for pero
25、xisomal protein): pos: -1(23), count: 0 Amino Acid Composition Tendency for Peroxisome: 23.77 Peroxisomal proteins? Status: notclr AAC score (peroxisome): 0.640 识别过氧化物酶体蛋白 普遍存在于真核细胞。 SKL MOTIF：羧基末端3个残基 Amino acid composition tendency for vacuolar proteins Score: -42.83 Status: negative 识别溶酶体和液泡蛋白 Ch
26、ecking the amount of Basic Residues (nucleus) Checking the 4 residue pattern for Nuclear Targeting Checking the 7 residue pattern for Nuclear Targeting Checking the Robbins & Dingwall consensus (nucleus) 识别核蛋白 如果K和R氨基酸的组成数超过20%，则可能为核蛋白。 Checking the RNA binding motif (nucleus or cytoplasm) Nuclear S
27、ignal Status: negative ( 0.00) 识别RNA蛋白 Checking CaaX motif. Checking N-myristoylation. Checking CaaX motif. Cytoplasmic protein? Score1: 0.450 识别脂铆定蛋白 膜蛋白的拓扑结构预测 跨膜区N末端两侧15个残基的净电荷差异决定膜蛋白的拓扑结构。 “I（middle）”标明N末端跨膜区的中心位置。 4）final results 参数： 序列来源： a. Gram-positive bacterium:（革兰式阳性菌） 细胞膜，细胞质，或胞外，例如分泌型蛋白
28、 b. Gram-negative bacterium: （革兰式阴性菌） 细胞质，内膜，质膜，外膜 c. yeast: （酵母） 细胞质，线粒体（外膜，膜间隙，内膜和基质），微体（过氧物酶体），核子，内质网（ER），高尔基体，液泡 ，胞膜或膜外 d.animal（动物） 细胞质，线粒体（外膜，膜间隙，内膜和基质），微体（过氧物酶体），核子，内质网（ER），高尔基体，溶酶体 ，胞膜或膜外 e.plant（植物） 线粒体（外膜，膜间隙，内膜和基质），微体（过氧物酶体），核子，内质网（ER），高尔基体，液泡，胞膜或膜 外，叶绿体（基质，基粒和类囊体膜） 序列号： 在结果中加入标识，默认值为序列的I
29、D号。将输入序列文件的第一个字作为ID，无格式限制。 7. 氨基酸的理化性质 功能：此软件主要对氨基酸的一些理化性质做了功能分析，如亲/疏水性，跨膜片段等。分析蛋白质序列的亲疏水性模式可揭示某些蛋白质的结构和折叠信息。 输入：氨基酸序列。 参数：1Eisenberg疏水性2Kyte-Doolittle 疏水性3跨膜疏水性 膜蛋白质的跨膜部分也是疏水性的。许多膜蛋白的N端也有一段信 号肽序列，由于它不被信号肽酶所水解因而使蛋白质定位在细胞 膜上而不分泌到细胞外。有些蛋白质的信号肽序列后面还有一段 或几段信号肽样疏水区域，当信号肽被水解除去后，这些疏水序 列与膜脂质双层结合而使蛋白质定位于细胞膜上
30、。不被切除的信 号肽或信号肽样疏水区域即成为膜蛋白质的跨膜片段。确定信号 肽和跨膜片段的最常用的方法是计算残基的疏水性关于残基在序 列中位置的函数。4表面溶解区域5柔韧性6GOR二级结构预测 GOR方法也是建立在对已知结构的氨基酸构象统计分析的基础之 上，计算被预测结构的位置特异的概率。它预测4种二级结构状 态，即-螺旋，-折叠，转角和螺旋卷曲，对于每一种结构， 它所出现的概率是根据被预测位置前后各8个残基的构象状态来计 算的。 输出：所有输出结果均由峰图表示，可用Gsview工具查看。8. DAS 功能：识别跨膜螺旋区，分析氨基酸的组成。 描述：结构膜蛋白的跨膜螺旋区由15-30个主要疏水性
31、残基的延伸部分组成，并被极性氨基酸残基连成的环状结构所分割。目前，识别主要氨基酸序列跨膜螺旋区的算法可达到90-95%的正确率。但主要用于单序列的分析，对于对准的多序列还无法达到很好的效果，。近来，该方法还被用于改进跨膜蛋白中G-蛋白一对受体的序列对准。现在，我们把这种方法推广 到预测任何结构膜蛋白的跨膜区。DAS采用被分析蛋白序列的低严格性点作图。 输入：一条蛋白序列。 输出：1）预测得到的跨膜区文字说明； 2）fig或postscrip格式(DAS curve)：表示预测的精确度。9. 引物设计 功能：为DNA模版建立引物，用于PCR或其他 描述：输入一条DNA序列，程序为其设计一条引物序
32、列。此DNA序列必须由 5 3，引物序列一般不多于30bp，避 免发夹结构，5端有酶切位点。 输入：一条DNA序列，大小写都可以。空格处被忽略，ATGC以外标记被视作N。 输出： 1序列ID 2简单描述 3最匹配引物描述 4最匹配引物在整个序列中详细描述（用GCG格式） 5其他匹配引物描述，按返回值由低到高排列 6引物数据统计参数：Per-Sequence InputsSequence Id: 序列号，定义输出文件中序列标志Included Region: 定义引物寻找区，去除重复序列和载体序列等。格式为起点位置，长度Target: PCR目的序列。格式为起点位置，长度Excluded Reg
33、ion: 引物不覆盖的区域。格式为起点位置，长度 起点位置，长度 起点位置，长度排除低质量序列区或高度重复区作为引物的可能。Sequence Quality: 序列质量参数(为一整数)，高表示可信度高，低表示可信度低。Left Input : 输入左引物，使其能检出相应的右引物。该序列必须为输入序列的子串Right Input: 输入右引物，使其能检出相应的左引物。该序列必须为输入序列的子串Global ParametersPick Internal Oligo: 若非0，则选择一个内部的寡聚序列作为扩增后的PCR产物的杂交探针。Liberal Base: 特殊碱基数,与N值一样处理， 为接受
34、IUB/IUPAC密码提供一个便捷的方式。Mispriming Library: 错配引物文库Max Mispriming: 与错配引物文库序列的相似性，默认值12。Product Size Range: PCR产物长度范围。CG Clamp: 在左右引物的3末端连续的G, C核苷酸（GC夹），要尽量避免（对杂交序列没有影响）。Optimum Primer Size: 引物序列最适当的长度。Minimum Primer Size: 引物序列最小的长度。Maximum Primer Size: 引物序列最大的长度。（不超过36）Primer Size与解链温度及特异性相关。Optimum Tm:
35、 最适当的Tm（解链温度）值。Minimum Tm: 最小的Tm值。Maximum Tm: 最大的Tm值。Maximum Tm Difference: 左右引物解链温度的最大差距，越小越好。Minimum GC Content: 包含GC的最小百分比。Maximum GC Content: 包含GC的最大百分比。GC Content 一般50%较好。Salt Comcentration: PCR中盐（通常是KCL）的浓度。用来计算Tm。默认值为50.0mM。PCR的缓冲液中已优化,默认即可。Annealing Oligo Concentration: 退火低聚物浓度，即引物浓度，用来计算寡聚链
36、熔点。默认即可。默认值为50nM，这是一个经验值：20ml的反应中包括20mmol/0.5ml的引物，10微毫克模板，0.025单位/ml Taq多聚酶，每个dNTP 0.1mM,1.5mM MgCl2, , 50mM KCl, 10mM Tris-HCL (pH 9.3), 56摄氏度的退火温度。Maximum Ns Accepted: 任意引物中最大的不确定（N）碱基数，最好无。Maximum Complementarity: 最大互补数。允许左右引物的最大对准数。每个碱基为配对1.00，一个任意碱基-0.25，一个未匹配-1.00，一个空位-2.00。只允许单碱基空位。没有负数。引物自身
37、基因工程物间互补之和,要尽量小。Maximum 3Complementarity:左右引物的3端匹配度，或一个引物的自身匹配度。没有负数。Maximum Poly-X: 最大的多聚单核苷酸数，应尽量小。Number To Return: 引物链的最大返回数。引物链按“质量”返回排序，换言之，即客观运行值，越低引物链越好。注意：过大的参数值会增加运行时间。First Base Index: 第一碱基输出,默认即可。若输入输出用1-碱基索引（类似GenBank和使用者通常所用的），设置参数为1。若输入输出用0-碱基索引，设置参数为0。在3W界面，默认值是1。Min Quality: 引物的最小质量
38、。Min End Quality: 引物5端五聚物允许的最大质量。Quality Range Min: 合法序列最小质量。Quality Range Max: 合法序列最大质量。Inside Penalty: 如有多段目的片段,且须重叠,则注明几个,以保证各序列可重叠。 非默认值只作用于目的片段为0或1 的序列。若引物跨越目标（target）并覆盖目标，将此值乘以覆盖的目标序列核酸数，作为“位置罚分”。此参数允许Primer3包括target为objective运行。Outside Penalty: 如有多段目的片段,且须紧接,则注明几个,以保证各序列可紧接着。非默认值只作用于目的片段为0或1
39、 的序列。若引物跨越目标（target）,但不覆盖目标，将此值乘以从3端到target的核酸数，作为“位置罚分”。Max End Stability: 左右引物3端五碱基稳定性。数字越大，表示3端稳定性越高。推荐值9。Internal Oligo Per-Sequence InputsInternal Oligo Excluded Region: 不包括在内部探针中的区域。Internal Oligo Inprt: 输入内部探针序列。Internal Oligo Global ParametersInternal Oligo Optimum Size: 内部探针最适合大小。Internal O
40、ligo Minimum Size: 内部探针最小尺寸。Internal Oligo Maximum Size: 内部探针最大尺寸。Internal Oligo Optimum Tm: 内部探针最适合Tm值。Internal Oligo Minimum Tm: 内部探针最小Tm值。Internal Oligo Maximum Tm: 内部探针最大Tm值。Internal Oligo Minimum GC Content: 内部探针最小GC含量。Internal Oligo Maximum GC Content: 内部探针最大GC含量。Internal Oligo salt Concentrat
41、ion: 内部探针盐浓度。Internal Oligo DNA Concentration: 内部探针DNA浓度。Internal Oligo Self Complementarity: 内部探针自身互补度。Internal Oligo Maximum Poly-X: 内部探针最大多聚核苷酸数Internal Oligo Maximum 3Self Complementarity: 内部探针最大3端自身互补度。Internal Oligo Mishyb Library: 内部探针错配文库。Internal Oligo Max Mishyb: 内部探针最大错配值。Internal Oligo Min Quality: 内部探针最小质量。