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1、 基因表达分析技术基因表达分析技术METHODS FOR ANALYZING GENE EXPRESSION1A基因mRNAmRNA蛋白质多肽链蛋白质多肽链基因表达2A一、通过检测一、通过检测mRNA揭示基因转录水平的表达特征揭示基因转录水平的表达特征根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为:封闭性系统研究方法封闭性系统研究方法:例如例如DNA微阵列、微阵列、Northern印迹、实印迹、实时时RT-PCR等方法。只能研究已知的基因。等方法。只能研究已知的基因。开放性系统研究方法开放性系统研究方法:如差异显示如差异显示PCR、双向基因
2、表达指纹、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等，可以发现指纹分析等，可以发现和分析未知的基因。和分析未知的基因。这里主要针对已知基因的常用表达分析方法做一介绍。这里主要针对已知基因的常用表达分析方法做一介绍。3A（一）基于杂交原理检测（一）基于杂交原理检测mRNAmRNA的表达水平的表达水平1Northern 印迹印迹（Northern blot）是一种基于是一种基于RNA-DNA杂交原理建立的一种杂交原理建立的一种RNA分析技术分析技术指将指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来
3、鉴定其中特定交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。分子的含量及其大小。4A三三种种印印迹迹技技术术的的比比较较5ARNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳3kb0.4 kbNt36382604623Northern blot hybridization28S18S6A分子杂交实验分子杂交实验7A放放射射自自显显影影照照片片目目 录录8A2核糖核酸酶保护实验核糖核酸酶保护实验（ribonuclease protection assay，RPA）是灵敏度和特异性很高的是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法定量分析方法 基本原理基本原理 是是将将标标记记的的特特异异RNA探探针针（32P或或
4、生生物物素素）与与待待测测的的RNA样样品品液液相相杂杂交交，标标记记的的特特异异RNA探探针针与与目目的的RNA结结合合，形形成成双双链链RNA，免免受受RNA酶酶的的消消化化；而而未未结结合合的的单单链链RNA经经RNA酶酶A或或RNA酶酶T1消消化化形成寡核糖核酸。形成寡核糖核酸。9ARPA基本程序：基本程序：待测待测RNARNA的分离的分离体外转录标记体外转录标记RNARNA探针探针待测待测RNARNA与探针与探针RNARNA进行液相杂交进行液相杂交 RNA酶消化酶消化不同大小杂交片段凝胶电泳分离不同大小杂交片段凝胶电泳分离10A核糖核酸酶保护实验原理示意图核糖核酸酶保护实验原理示意图
5、32P标记的探针：杂交双链进行变性PAGE，用放射自显影或磷屏成像系统检测探针的信号；生物素标记的探针：杂交双链经过变性PAGE后，电转移至尼龙膜，用链霉亲和素辣根过氧化物酶和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。11ARPA比Northern Blot的优势：1.过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全 2.RPA比Northern Blot灵敏15150倍，适合检测各种表达水平之基因 3.RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达 4.一次RPA就能完成10 多次Northern Blot的工作，加快研
6、究速度12A可细胞或组织中原位表达的可细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位进行区域定位标标记记探探针针特特异异性性地地与与目目标标靶靶mRNA序序列列杂杂交交，检检测测标标记记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。可作为定量分析的补充。可作为定量分析的补充。3原位杂交（原位杂交（in situ hybridization，ISH）13A原位杂交技术主要步骤：原位杂交技术主要步骤：材料处理及细胞样品的固定；材料处理及细胞样品的固定；样品的制备和预处理；样品的制备和预处理；探针的制备和预杂交；探针的制备和预杂交；探针及样品的变性；探针及样品的
7、变性；杂交温育；杂交温育；检测杂交信号，进行结果分析。检测杂交信号，进行结果分析。14A（二）（二）RT-PCR常用的常用的mRNA检测方法检测方法1反转录反转录PCR可用于可用于mRNA的半定量分析的半定量分析 反反转转录录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）它它以以mRNA为为模模板板，体体外外扩扩增增cDNA，再再以以cDNA为为模模板板进进行行特特定定基基因因转转录录产产物物的的PCR扩扩增增。RT-PCR技技术术一一般般用用于于RNA的的定定性性分分析析；如如果果设设置置阳阳性性参参照照，则则可可对对待测待测RNA样品进行半定量分析。样品进行半定
8、量分析。反转录实时定量反转录实时定量PCR 15A逆转录酶聚合酶mRNAmRNAcDNAcDNA杂化双链杂化双链PCR扩增16APCR技术原理17A5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA5 5 5 5 5 5 5 5 一、基本工作原理一、基本工作原理目目 录录18ACycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循环后，模板次循环后，模板DNA的含量的含量可以扩大可以扩大100万倍以上。万倍以上。目目 录录19An模板模板DNAn 特异性引物特异性引物n耐热耐热DNA聚合酶聚
9、合酶n dNTPsn Mg2+PCRPCR体系基本组成成分体系基本组成成分20APCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C21A实验仪器电泳仪电泳仪22A琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽琼脂糖凝胶电泳槽23APCR仪仪24APCR反应PCR反应条件PCR过程PCR的特点25A实验结果PCR结果。1、对照(无模板)；26、PCR产物（5ul样品）26A凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统凝胶成像系统27ATarget AmplificationNo.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target12243841653
10、2664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 Amplicon28A常规常规PCR方法的局限性分析：方法的局限性分析：无法对起始模板准确定量无法对起始模板准确定量,只能对终产物进只能对终产物进行分析行分析必须在扩增后用电泳方法分析必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而费时费力而且且EB有毒有毒无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测2
11、9A2、实时荧光定量、实时荧光定量PCR （real-time PCR）30A非特异性的嵌入荧光染料（Non-specific DNA binding dyes）SYBR Green ISYBR GoldEthidium Bromide 31AExtension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55RepeatDNA binding dyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll32A实时实时PCRPCR技术原理技术原理目目 录录33A非特异性的嵌入荧光染料评价优点：与
12、特异性的荧光探针相比价格便宜 只需要设计PCR引物缺点：由于它和模板的结合是非特异性 的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反映目 的基因的扩增情况。34ATaqMan探针 评价优点：荧光信号强 与其它探针相比设计简单 可用于多通道检测 可用于SNP的检测缺点：比DNA结合染料价格高35ACt value and Real-Time Quantitative PCR TheoryCtCt值值值值（Threshold Threshold CycleCycle）PCR扩增过扩增过程中，扩增产物程中，扩增产物荧光信号超过基荧光信号超过基线值（进入指数线值（进入指数增长期
13、）时的循增长期）时的循环数。环数。36A 模板起始浓度越高，Ct值越小 Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系Ct值与模板起始浓度的关系值与模板起始浓度的关系 如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达37A绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。38A39A 3、原位、原位PCR技术技术40A原位 原位聚合酶链式反应（In Still PCR,IsPCR）是由Haase
14、等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列41A16块载玻片及24个0.2ml管的样品block 42A43A操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达44ADNA芯片芯片(DNA chip)cDNA芯片芯片(cDNA chi
15、p)是指将许多特定的是指将许多特定的DNA片段或片段或cDNA片片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上面积的支持物上 。4、基因芯片分析基因表达谱、基因芯片分析基因表达谱（高通量地分析基因表达高通量地分析基因表达）基因芯片基因芯片(gene chip)45A目目 录录46A二、通过蛋白质检测揭示基因二、通过蛋白质检测揭示基因 翻译水平的表达特征翻译水平的表达特征 Western印印迹迹（Western blot）是是一一种种免免疫疫印印迹迹技技术术，其其基基本本原原理理与与核核酸酸分分子子杂杂交交相相似似，只只是是以以偶偶联联标标记记物物的
16、的抗抗体体分分子子作作为为探探针针，检检测测转转移移到到固固相相支支持持物物上上的的蛋蛋白白质质/多多肽肽分分子子。当当在在蛋蛋白白质质水水平平上上检检测测特特定定基基因因的的表表达达活活性性时时，最最常常用用的的方方法法就就是是利利用用Western印印迹迹对对细细胞胞或或组组织织的的总总蛋蛋白白质质中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。（一）采用特异抗体经（一）采用特异抗体经Western印迹可直接印迹可直接 测定基因编码多肽测定基因编码多肽47A1.蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备2.SDS-PAGE分离分离3.蛋白质转膜蛋白质转膜4.特特异异抗抗体体（
17、即即第第一一抗抗体体）与与膜膜上上的的蛋蛋白白质质（抗抗原原）印印迹杂交迹杂交5.再再经经偶偶联联了了可可检检测测标标记记信信号号的的第第二二抗抗体体（即即抗抗抗抗体体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig）6.最最后后经经与与酶酶的的底底物物反反应应而而显显影影、成成像像，经经扫扫描描后后获获取取免疫印迹信息免疫印迹信息Western blot基本程序基本程序48A49A50A51AWest Blot 52A受检标本受检标本+固相载体表面的抗原或抗体起反应固相载体表面的抗原或抗体起反应结合特异抗结合特异抗体（一抗）体（一抗）-酶连接的第二抗体（也可
18、预先包被抗体，酶连接的第二抗体（也可预先包被抗体，“吸吸附附”抗原），再进行酶抗原），再进行酶-底物反应。反应后通过专门的酶标仪测底物反应。反应后通过专门的酶标仪测定、记录数据。定、记录数据。（二）酶联免疫吸附分析（二）酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）53A特点：特点：1、具有特异性；、具有特异性；2、灵敏度很高；、灵敏度很高；3、稳定、操作简便，标本用量少，适于大规模筛查，、稳定、操作简便，标本用量少，适于大规模筛查，尤尤 其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原；其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原；4、既可以做定性试验
19、也可以做定量分析。、既可以做定性试验也可以做定量分析。酶联免疫吸附分析酶联免疫吸附分析54A 免免疫疫组组织织化化学学（immunohistochemistry）是是利利用用标标记记的的特特异异性性抗抗体体通通过过抗抗原原-抗抗体体反反应应和和显显色色反反应应，在在组组织织或或细细胞胞原原位位检检测测特特定定抗抗原原（即即目目标标蛋蛋白白质质）的的方方法法，简简称称为为免免疫疫组组化化实实验验。近近年年来来由由于于荧荧光光标标记记抗抗体体的广泛应用，这两种方法又被统称为的广泛应用，这两种方法又被统称为免疫荧光法免疫荧光法。（三）免疫组化实验对组织（三）免疫组化实验对组织/细胞细胞 表达的蛋白质
20、进行原位检测表达的蛋白质进行原位检测55A56A人皮肤角化细胞免疫荧光染色人皮肤角化细胞免疫荧光染色57A（immunofluorescence），可可应应用用荧荧光光（倒倒置置）显显微微镜镜或或激激光光共共聚聚焦焦显显微微镜镜（confocal microscopy）对对靶靶分分子子进进行行定定性性、定定量量和和定定位位分分析析，激激光光共共聚聚焦焦显显微微镜镜还还可可进进行行断断层层成像，是在蛋白质水平分析基因表达的直观方法。成像，是在蛋白质水平分析基因表达的直观方法。其其中中抗抗体体对对于于蛋蛋白白质质靶靶点点的的特特异异性性、种种间间交交叉叉反反应应、检检测测系系统统的的灵灵敏敏性性以
21、以及及细细胞胞或或组组织织的的固固定定类类型型是是该该方方法法的的关关键键因素。因素。运运用用双双重重着着色色或或多多重重着着色色程程序序同同时时对对多多个个感感兴兴趣趣的的靶靶分分子子进进行行检检测测，是是一一种种揭揭示示更更多多有有关关细细胞胞群群的的功功能能和和它它们们之之间间相互作用信息的有效方法。相互作用信息的有效方法。免免疫疫组组化化主主要要是是作作为为定定性性、定定位位的的技技术术，若若结结合合密密度度计计量量系统、图像分析系统等测量工具也可以得到定量的数据。系统、图像分析系统等测量工具也可以得到定量的数据。58A 流流式式细细胞胞术术（flow cytometry）在在细细胞胞
22、水水平平分分析析特特定定蛋蛋白白质质的的基基本本原原理理也也是是抗抗原原-抗抗体体反反应应，它它利利用用荧荧光光标标记记抗抗体体与与抗抗原原的的特特异异性性结结合合，经经过过流流式式细细胞胞仪仪分分析析荧荧光光信信号号，从从而而根根据据细细胞胞表表达达特特定定蛋蛋白白质质的的水水平平对对某某种种蛋蛋白白质质阳阳性性细细胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。（四）流式细胞术用于分析细胞（四）流式细胞术用于分析细胞 特异表达的蛋白质特异表达的蛋白质59A流流式式细细胞胞术术可可以以检检测测活活细细胞胞，也也可可以以检检测测用用甲甲醛醛固固定定的的细胞。细胞。广广泛
23、泛应应用用于于细细胞胞表表面面和和细细胞胞内内分分子子表表达达水水平平的的定定量量分分析析，并能够根据各种蛋白质的表达模式区分细胞亚群。并能够根据各种蛋白质的表达模式区分细胞亚群。此此外外，流流式式细细胞胞术术可可以以使使用用多多个个荧荧光光标标记记的的抗抗体体同同时时对对多多个个基基因因产产物物进进行行标标记记和和监监测测，是是对对细细胞胞进进行行快快速速分分析析、分选、特征鉴定的一种有效方法。分选、特征鉴定的一种有效方法。60A是是将将具具有有高高度度亲亲和和特特异异性性的的探探针针分分子子（如如单单克克隆隆抗抗体体）固固定定在在基基片片上上，用用以以识识别别复复杂杂生生物物样样品品溶溶液
24、液中中的目标多肽；的目标多肽；蛋蛋白白质质功功能能芯芯片片可可用用来来研研究究蛋蛋白白质质修修饰饰、蛋蛋白白质质-蛋蛋白白质质/DNA-蛋蛋白白质质/RNA-蛋蛋白白质质，以以及及蛋蛋白白质质与与脂脂质质、蛋蛋白白质质与与药药物物、酶酶与与底底物物、小小分子分子-蛋白质等的相互作用蛋白质等的相互作用（五）蛋白质芯片分析蛋白质表达谱（五）蛋白质芯片分析蛋白质表达谱（高通量地分析基因表达高通量地分析基因表达）蛋白质芯片蛋白质芯片(protein chip)61A蛋白质检测芯片包括蛋白质检测芯片包括:1.1.抗体芯片抗体芯片2.2.抗原芯片抗原芯片3.3.配体芯片等配体芯片等62A 目前比较和鉴定蛋
25、白质表达谱更多采用双向电泳目前比较和鉴定蛋白质表达谱更多采用双向电泳（two-dimensional electrophoresis,简称简称2-D电泳）结合质谱技术。电泳）结合质谱技术。原理原理:根据蛋白质分子的两个属性根据蛋白质分子的两个属性等电点和分子质量等电点和分子质量将蛋白质混合物进行分离。电泳结果经染色后，即可对将蛋白质混合物进行分离。电泳结果经染色后，即可对不同样品中蛋白质的表达谱进行比较；还可从凝胶中将特不同样品中蛋白质的表达谱进行比较；还可从凝胶中将特定的蛋白质点切下，经胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利定的蛋白质点切下，经胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用用质谱（质谱（mass
26、spectrum）技术进行定性分析，对差异表达）技术进行定性分析，对差异表达的蛋白质进行鉴定。的蛋白质进行鉴定。可同时分离数成百上千的蛋白质。可同时分离数成百上千的蛋白质。（六）双向电泳结合质谱普遍用于蛋白质（六）双向电泳结合质谱普遍用于蛋白质表达谱的分析和鉴定表达谱的分析和鉴定63A 双双 向向 电电 泳泳 技技 术术Two-dimemsional gel electrophoresis,2DE技术构成：第一相：IEF 采用丙烯酰胺与不同PH的两性 电介质形成的固定的PH梯度 IEF-PAGE第二相：分子筛凝胶 SDS-PAGE特点：1.一次分离细胞中几乎所有的蛋白质（以spot形式出现）2
27、.高灵敏度和高分辨率 用银染条件下，可达10-1510-18 mol水平3.便于计算机分析处理 电泳分离图谱经扫描输入计算机，可以进行蛋白质定位,等电点,分子量定量不同条件下的图谱进行比较,建立蛋白质组数据库64A65A66A67A68A质质 谱谱 技技 术术 质谱仪质谱仪 进样系统进样系统 离子源离子源 质量分析器质量分析器 离子探测器系统离子探测器系统69A在蛋白质组学研究中常用的质谱仪电喷雾离子化质谱仪（ESI-MS）基质辅助的激光解吸离子化飞行时间质谱仪（MALDI-TOF-MS）四极杆-TOF质谱仪（Q-TOF）70A质谱技术在蛋白质组研究中的作用1.肽质谱和肽的序列分析2.翻译后修
28、筛的蛋白质鉴定 N端封闭，磷酸化，糖基化3.其它：蛋白质二硫键的定量和定位蛋白质蛋白质相互作用的分析蛋白质其它分子相互作用的分析蛋白质二级结构的分析比较不同条件（正常细胞与异常细胞，不同发育阶段从中获得单个有价值的蛋白质结构与功能71A标签融合标签融合蛋白沉淀蛋白沉淀实验流程实验流程示意图示意图72A 白质相互作用研究领域里得到极大的推广。GST融合蛋白在经过固定有GST(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST 与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面：一是鉴定与已知融
29、合蛋白相互作用的未知蛋白质 二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用73A（二）酵母双杂交技术的基本原理（二）酵母双杂交技术的基本原理和用途和用途74A75A电电泳泳迁迁移移率率变变动动测测定定(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或或称称凝凝胶胶迁迁移移变变动动实实验验(gel shift assay)最最初初用用于于研研究究DNA结结合合蛋蛋白白与与相相应应DNA序序列列间间的的相相互互作作用用，可可用用于于定定性性和和定定量量分分析析，已已经经成成为为转转录录因因子子研研究究的的经经典典方方法法。目目前前这这一一技技术术也也被被用用于于研
30、研究究RNA结结合合蛋蛋白白和和特特定定RNA序序列列间间的的相互作用。相互作用。DNA-蛋白质相互作用分子分析技术蛋白质相互作用分子分析技术（一）电泳迁移率变动测定（一）电泳迁移率变动测定76A放放射射自自显显影影未结合探针未结合探针结合有蛋白的探针结合有蛋白的探针标记探针标记探针1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未标记探针未标记探针10Xn凝胶迁移实验结果示意图凝胶迁移实验结果示意图77A染染色色质质免免疫疫沉沉淀淀技技术术(chromatin immunoprecipitation assay,ChIP)是是目目前前可可以以研研究究体体内内DNA与与蛋蛋白白质质相相互互作作用用的的主要方法。主要方法。（二）染色质免疫沉淀法（二）染色质免疫沉淀法78An染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图染色质免疫沉淀实验流程及结果示意图79AAnalysis of DNA:Protein Interactions Antibody-Based ChIP80AChromatin immunoprecipitation(ChIP)HaloCHIP Systeman Antibody-Free Approach HaloCHIP Systeman Antibody-Free Approach 81A