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1、关于蛋白质工程关于蛋白质工程PPT课件课件第一页，本课件共有40页本章目录本章目录l蛋白质工程的理论基础蛋白质工程的理论基础l蛋白质工程的理论基础蛋白质工程的理论基础l蛋白质结构测定与结构预测蛋白质结构测定与结构预测l蛋白质工程的关键技术蛋白质工程的关键技术l定点突变定点突变l定向进化定向进化l其他技术其他技术l蛋白质工程的应用及实例蛋白质工程的应用及实例l定点突变与蛋白质药物工程：胰岛素定点突变与蛋白质药物工程：胰岛素l定点突变、定向进化与工业用酶：枯草杆菌蛋白酶等定点突变、定向进化与工业用酶：枯草杆菌蛋白酶等l结构域的拼接与金属硫蛋白工程结构域的拼接与金属硫蛋白工程l抗体工程抗体工程 第二
2、页，本课件共有40页第一节第一节 蛋白质工程的理论基础蛋白质工程的理论基础l蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念l蛋白质的结构蛋白质的结构l蛋白质结构预测蛋白质结构预测第三页，本课件共有40页一一 蛋白质工程的概念蛋白质工程的概念l基于对蛋白质结构和功能的认识，进行分子设计，通过基因基于对蛋白质结构和功能的认识，进行分子设计，通过基因工程途径定向地改造蛋白质或创造合乎人类需要的新的突变工程途径定向地改造蛋白质或创造合乎人类需要的新的突变蛋白质的理论或实践活动。蛋白质的理论或实践活动。（1 1）确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关）确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；系；（2
3、 2）通过定点突变、定向进化等技术，合成具有特定氨基酸序）通过定点突变、定向进化等技术，合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质。列和空间结构的蛋白质。第四页，本课件共有40页二二 蛋白质的结构蛋白质的结构l一级结构一级结构：多肽链的氨基酸残基的排列顺序：多肽链的氨基酸残基的排列顺序 l二级结构二级结构：多肽链借助于氢键或离子键沿一维方向排列成具有：多肽链借助于氢键或离子键沿一维方向排列成具有周期性结构的图象。周期性结构的图象。l三级结构：三级结构：指整个蛋白质多肽链在二级结构的基础上，侧链基团指整个蛋白质多肽链在二级结构的基础上，侧链基团通过次级键或疏水键的相互作用进一步盘曲折叠，形成具有一
4、定通过次级键或疏水键的相互作用进一步盘曲折叠，形成具有一定规则的空间结构规则的空间结构 。l四级结构四级结构：由两条以上的多肽链组成的蛋白质，多肽链之间没：由两条以上的多肽链组成的蛋白质，多肽链之间没有共价键连接而是借疏水作用等次级键缔合在一起形成的高级有共价键连接而是借疏水作用等次级键缔合在一起形成的高级空间结构空间结构 。第五页，本课件共有40页第六页，本课件共有40页氨基酸的聚合形成肽链氨基酸的聚合形成肽链氨基酸的聚合形成肽链氨基酸的聚合形成肽链第七页，本课件共有40页肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元:二硫键的折叠二硫键的折叠二硫键的折叠二硫键的折
5、叠第八页，本课件共有40页肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元 :氢键的折叠氢键的折叠氢键的折叠氢键的折叠第九页，本课件共有40页肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元 :离子键的折叠离子键的折叠离子键的折叠离子键的折叠第十页，本课件共有40页肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元ll每四个氨基酸每四个氨基酸每四个氨基酸每四个氨基酸残基间的残基间的残基间的残基间的ll氢键构成多肽氢键构成多肽氢键构成多肽氢键构成多肽链链链链 a a a a 螺旋螺旋螺旋螺旋第十一页，本课件共有40页肽链的空间
6、结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元肽链的空间结构单元ll由不同多肽链上由不同多肽链上由不同多肽链上由不同多肽链上氨基酸残基间的氨基酸残基间的氨基酸残基间的氨基酸残基间的氢键构成多肽链氢键构成多肽链氢键构成多肽链氢键构成多肽链 b b b b 折叠折叠折叠折叠第十二页，本课件共有40页肽链的完整空间构象肽链的完整空间构象肽链的完整空间构象肽链的完整空间构象第十三页，本课件共有40页第十四页，本课件共有40页蛋白质结构与功能的关系蛋白质结构与功能的关系l蛋白质一级结构是空间结构的基础，而空间结构决定了蛋白蛋白质一级结构是空间结构的基础，而空间结构决定了蛋白质的功能。质的功能。l结构域：结
7、构域：蛋白质多肽链上一段在三维结构上可以明显区分蛋白质多肽链上一段在三维结构上可以明显区分和相对独立并具有一定生物学功能的基本单位。和相对独立并具有一定生物学功能的基本单位。l模体（基序）：模体（基序）：组成结构域的基本二级结构单位组成结构域的基本二级结构单位 第十五页，本课件共有40页蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰 :磷酸化修饰磷酸化修饰磷酸化修饰磷酸化修饰第十六页，本课件共有40页蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰:羧基化修饰羧基化修饰羧基化修饰羧基化修饰几种参与凝血的蛋几种参与凝血的蛋白因子（如白因子（如 VIII VIII
8、 和和IVIV因子）需要在其因子）需要在其谷酰胺侧链上的谷酰胺侧链上的g-g-羧基化修饰羧基化修饰后，才后，才能拥有蛋白酶的活性，能拥有蛋白酶的活性，这一修饰过程依赖与这一修饰过程依赖与维生素维生素K K 的存在的存在。第十七页，本课件共有40页蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰:甲基化修饰甲基化修饰甲基化修饰甲基化修饰肌肌肉肉中中的的一一些些蛋蛋白白质质以以及及细细胞胞色色素素C C中中的的L Ly ys s会会受受到到单单甲甲基基和和二二甲甲基基化化修修饰饰；钙钙调调蛋蛋白白会会受受到到三三甲甲基基化化修修饰饰；所所有有C C末末端端以以G Gl lu u结结
9、尾尾的的蛋蛋白白质质，其其G Gl lu u会会受到甲基化修饰。受到甲基化修饰。第十八页，本课件共有40页蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰:N-N-糖基化糖基化糖基化糖基化O-O-糖基化糖基化糖基化糖基化糖基化修饰糖基化修饰糖基化修饰糖基化修饰第十九页，本课件共有40页蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰蛋白质的加工修饰:其它类型的修饰其它类型的修饰其它类型的修饰其它类型的修饰第二十页，本课件共有40页三三 蛋白质的结构预测蛋白质的结构预测l一级结构：测序仪与数据库一级结构：测序仪与数据库l高级结构预测：高级结构预测：X X射线晶体衍射法射线晶体衍射
10、法 核磁共振法（核磁共振法（NMRNMR）第二十一页，本课件共有40页蛋白质一级序列数据库蛋白质一级序列数据库lPIR PIR：由国家生物医学研究基金会（由国家生物医学研究基金会（NBRFNBRF）建立）建立lMIPSMIPS：MartinsriedMartinsried的蛋白质序列研究所收集和处理的蛋白的蛋白质序列研究所收集和处理的蛋白质序列数据质序列数据lSWISS-PROTSWISS-PROT：蛋白质序列数据库，由蛋白质序列数据库，由GenevaGeneva大学和大学和EMBLEMBL共共同合作开发同合作开发 lTrEMBLTrEMBL：翻译的翻译的EMBL EMBL lNRL-3DNR
11、L-3D：除序列信息外，也包括对二级结构，活性位点，除序列信息外，也包括对二级结构，活性位点，结合位点和修饰位点等信息。结合位点和修饰位点等信息。第二十二页，本课件共有40页第二节第二节 蛋白质工程关键技术蛋白质工程关键技术l定点突变定点突变 l定向进化定向进化l其他技术其他技术第二十三页，本课件共有40页一一 定点突变定点突变l寡核苷酸引物介导的定点突变寡核苷酸引物介导的定点突变 lPCRPCR介导的定点突变介导的定点突变 l盒式突变盒式突变第二十四页，本课件共有40页遗传信息传递的中心法则DNA（基因）DNA（基因）mRNA蛋白质生物代谢物质复制转录翻译代谢基因组学转录组学蛋白组学代谢组学
12、逆转录中心法则中心法则第二十五页，本课件共有40页1.1.寡核苷酸引物介导的定点突变寡核苷酸引物介导的定点突变l用含有用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启，在聚合酶的作用下启动动DNADNA分子进行复制的过程分子进行复制的过程 l寡核苷酸引物介导的定点突变的寡核苷酸引物介导的定点突变的KunkelKunkel改进改进 ：载体：载体：RFRFM13DNAM13DNA载体载体 菌株：菌株：dUTPdUTP酶和酶和N N尿嘧啶脱核苷酶双缺陷的菌株。尿嘧啶脱核苷酶双缺陷的菌株。原理：原理：dUTPdUTP酶缺陷导致胞内酶缺陷导致胞内dUTPdUTP上升，部
13、分取代上升，部分取代dTTPdTTP进入新进入新生生DNADNA链中，使得链中，使得M13M13单链单链DNADNA大约大约1 1的的T T被被U U取代。另一链合成取代。另一链合成后，将双链后，将双链DNADNA导入正常大肠杆菌，导入正常大肠杆菌，N N尿嘧啶糖基化酶除去尿嘧啶糖基化酶除去DNADNA链上的尿嘧啶碱基，原链上的尿嘧啶碱基，原M13M13模板链被降解，突变链因不含模板链被降解，突变链因不含U U被保被保留下来。留下来。第二十六页，本课件共有40页第二十七页，本课件共有40页 2.PCRPCR介导的定点突变介导的定点突变 第二十八页，本课件共有40页第二十九页，本课件共有40页3
14、.3.盒式突变盒式突变l利用一段利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代，取代野生型基因中的相应序列。突变的寡核苷酸链成对存在，不会野生型基因中的相应序列。突变的寡核苷酸链成对存在，不会出现异源双链的情况。全部转化质粒都是突变体。出现异源双链的情况。全部转化质粒都是突变体。第三十页，本课件共有40页二、二、定向进化定向进化l先随机突变，再定向选择。先随机突变，再定向选择。如在待进化酶基因的如在待进化酶基因的PCRPCR扩增反扩增反应中，利用应中，利用TaqTaq酶不具有酶不具有3 35 5端纠错的功能，配合适当条件，端纠错的功能，配合适当条件，
15、以很低的比率向目的基因引入突变，构建突变序列库，再凭以很低的比率向目的基因引入突变，构建突变序列库，再凭借定向的选择方法，定向选出所需性质的突变酶。借定向的选择方法，定向选出所需性质的突变酶。第三十一页，本课件共有40页1.1.易错易错PCRPCRl在在PCRPCR反应中，降低反应中，降低一种一种dNTPdNTP的含量的含量，使，使PCRPCR容易出错，达到容易出错，达到随机突变的目的。随机突变的目的。第三十二页，本课件共有40页2.DNA2.DNA改组改组l用用DNAaseIDNAaseI 先将一个先将一个DNADNA片段消化成许多小片段，然后片段消化成许多小片段，然后不加不加引物进行引物进
16、行PCRPCR，使得消化后，使得消化后DNADNA小段之间重新按多种组合方小段之间重新按多种组合方式连接重组，然后利用原来整片段式连接重组，然后利用原来整片段DNADNA两端的引物进行两端的引物进行加引加引物的物的PCRPCR扩增扩增，以便得到一系列改组后的突变，以便得到一系列改组后的突变DNADNA序列。序列。第三十三页，本课件共有40页3.3.体外随机引发重组体外随机引发重组l以以单链单链DNADNA为模板为模板，随机引物扩增，随机引物扩增，将产生大量与模板不同位将产生大量与模板不同位点互补的短的点互补的短的DNADNA片段，由于碱基的错配和错误引发，这些短片段，由于碱基的错配和错误引发，
17、这些短DNADNA片段中会存在一些点突变。片段中会存在一些点突变。第三十四页，本课件共有40页第三节第三节 蛋白质工程的应用实例蛋白质工程的应用实例l胰岛素胰岛素l枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶 l金属硫蛋白金属硫蛋白 l抗体抗体第三十五页，本课件共有40页1.1.1.1.胰岛素的结构及其生物合成胰岛素的结构及其生物合成胰岛素的结构及其生物合成胰岛素的结构及其生物合成SSS SSSSSCCNNSSSSBB肽（肽（肽（肽（3030）CC肽（肽（肽（肽（3131）AA肽（肽（肽（肽（2121）RRRRRRKKSSSSSSSSCCNNSSSSNNCC高尔基体内的特异性肽酶高尔基体内的特异性肽酶高尔基体
18、内的特异性肽酶高尔基体内的特异性肽酶NNllCCBB肽肽肽肽CC肽肽肽肽AA肽肽肽肽信号肽酶信号肽酶信号肽酶信号肽酶信号肽信号肽第三十六页，本课件共有40页胰岛素的改建工程胰岛素的改建工程l速效胰岛素：速效胰岛素：Ser B9 Asp/Thr B27 GluSer B9 Asp/Thr B27 Glu，有利于降低胰岛素，有利于降低胰岛素的缔合作用，进入血液的吸收率比天然胰岛素提高了的缔合作用，进入血液的吸收率比天然胰岛素提高了3 3倍。倍。l长效胰岛素：长效胰岛素：Asn A21 Gly/Thr B27 Arg/Thr B30 ThrAsn A21 Gly/Thr B27 Arg/Thr B3
19、0 Thr酰胺，半衰期最长，达到酰胺，半衰期最长，达到35.535.5小时。小时。l高效胰岛素高效胰岛素：His B10 Asp,His B10 Asp,活力是天然胰岛素的活力是天然胰岛素的11.711.7倍。倍。第三十七页，本课件共有40页抗体抗体l抗体是一类免疫球蛋白抗体是一类免疫球蛋白第三十八页，本课件共有40页IgG基本结构重链重链（heavy chainheavy chain，H H）轻链轻链（light chainlight chain，L L）可变区（可变区（variable region,Vvariable region,V区）区）恒定区恒定区（constant region,Cconstant region,C区）区）骨架区骨架区（framework region,framework region,FRFR）铰链区铰链区（hinge regionhinge region）第三十九页，本课件共有40页感谢大家观看第四十页，本课件共有40页