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1、第一章：食品检验检疫概论1.食品检验检疫是动植物检疫、卫生检疫和商品检验的重要组成部分，其依据的法律法规、标准和方法以及检验程序与动植物检疫基本相似。2.检疫的目的主要是防止危险性动物疫病和植物有害生物的传入、传出国境或在国内地区间的传播和流行，确保食品安全，保护人体健康与生态环境，保护农、林、牧、渔生产安全，促进国际和国内经济贸易的发展。3.在我国，食品检疫分为国境检疫（又称为进出境食品检疫）和境内检疫两大类。第一节：食品检疫的特点一、强制性n 政府行为n 以国家现行的相关法律为依据n 中华人民共和国产品质量法n 中华人民共和国食品卫生法n 中华人民共和国标准化法二、法定的检验检疫机构和人员
2、n 国家质量监督检验检疫总局及其相关机构和人员n 农业部动植物卫生检验检疫机构及其相关人员三、法定的检疫项目和检疫对象n 检疫人员在实施检疫行为时所检查的若干事项称为法定检疫项目n 如：是否来自疫区、是否索证验证等n 法定检疫对象：中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录 、中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录、全国农业植物检疫对象名单等等相关法律法规所规定。四、法定的检疫标准和方法五、法定的处理方法六、法定的检疫证明n 书面证明n 检疫印章n 检疫标志第二节：食品检疫对象和范围一、检疫对象1.动物性食品检疫对象2.植物性食品检疫对象3.污染食品的生物性病原物二、检疫范围
3、1.动植物及其产品2.装载容器、包装物、铺垫材料3.运输工具一、检疫对象食源性疾病包括：分为生物性、化学性、放射性，其中生物性危害有微生物、寄生虫和某些食品害虫。（一）动物性食品检疫对象：n 动物性食品检疫的对象是动物疫病，包括动物传染病和寄生虫病n 进出境性动物疫病 n 进境：中华人民共和国进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录规定n 出境：与出口国签订的协议n 国内检疫性动物疫病：n 中华人民共和国一、二、三类动物疫病名录规定（二）植物性食品检疫对象n 检疫性有害生物是指那些对其受到威胁的地区具有潜在的经济重要性，但尚未在该地区发生，或虽已发生但分部不广并正在进行官方控制的植物有害生物。n
4、包括：检疫性植物病原物、检疫性害虫、检疫性杂草n 进境：中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录n 国内：植物检疫条例（三）污染食品的生物性病原物n 细菌：沙门氏菌、大肠埃希氏菌等n 病毒：脊髓灰质炎病毒、FMD、HPAIV等等n 真菌及其毒素：黄曲霉等等n 寄生虫：绦虫、旋毛虫等等n 害虫：昆虫、螨等二、检疫范围：1.动植物及其产品n 动物产品：直接来源于动物未经加工或经加工但仍有可能传播疾病的产品，如：肉及其肉制品，乳及乳制品，蛋及蛋制品、动物油脂、蜂蜜、燕窝等等n 植物产品：是指来源于植物未经加工或经加工但仍可能传播病虫害的产品，如粮食、豆、干果、鲜果、蔬菜等2.装载容器、包装物
5、和铺垫材料3.运输工具第三节 食品国境检疫的分类进境检疫、出境检疫、过境检疫、运输工具检疫国境检疫检验的作用：国家主权的体现、国家管理职能的体现、对外经济贸易顺利进行和持续发展的保障。商品以质取胜，立足国际市场；建立国家技术保护屏障；提供公正权威凭证；保护农林牧渔业生产安全；保护人民健康的重要屏障。 国境检验检疫的管理体制与机构：国家质检总局、国家认监委、国家标准委流程：（1）申请 ：申请单位填写申请表，向直属检验检疫局（以下简称直属局）提出申请，并按照不同产品的要求提交相关随附单证。（2）受理 负责部门：直属局。 检验检疫法律 年限 进出境商品检验法1989年2月修改 2002年4月进出境动
6、植物检疫法1991年4月国境卫生检疫法1986年12月修改 2007年12月食品安全法2009年2月 直属局履行受理申请程序，审核随附单证的真实性和完整性，做出受理或不予受理的决定。申请材料不齐全或者不符合法定形式的，直属局应在收到随附单证当场或5日内，一次告知申请单位。直属局初审后向国家质检总局进出口食品安全局（以下简称食品局）传递申请。（3）终审 负责部门：食品局。 食品局根据国外动植物疫情、法律法规、公告禁令、预警通报、风险评估报告、安全评价报告等，对直属局提交的申请进行审核，做出许可或不予许可的决定，并在网上签发检疫许可证或未获准通知书。直属局负责打印检疫许可证或未获准通知书。全部审批
7、工作自直属局受理之日起20日内完成。一、进境检疫基本顺序包括：检疫审批和报检、输出国产地检疫、现场查验、抽样检查、隔离检疫、实验室检验、检疫处理等。 检验检疫行政法规 年限 进出境商品检验法实施条例2005年8月进出境动植物检疫法实施条例1996年12月国境卫生检疫法实施细则1989年2月修改 2010年4月食品安全法实施条例2009年7月二、出境检疫的目的：维护我国商品的地位和信誉、促进国内农牧业发展、杜绝被输入国退回或销毁现象。三、 出境检疫的进本程序：检疫审批和报检、现场查验、抽样检查、隔离检疫、实验室检验、检疫处理。四、过境检疫的目的：防止危险性有害生物传入我国；维护国家主权。基本顺序
8、：检疫审批和报检、检疫、检疫处理五、运输工具检疫由进境口岸动植物检疫机关负责实施。1.凡进境的车辆必须向口岸检疫机关报检，并进行消毒。2.装载动植物及其产品出境的回程空车辆，在进境口岸作防疫消毒处理。3.凡携带不允许进境食品的车辆在口岸进行如下处理：（1）来自境外动植物及其产品不准带离运输工具（2）带有危险性生物的动植物及其产品和其他检疫物，根据疫情做除害、封存处理，受污染的场地做消毒处理（3）来自动植物疫区的运输工具上的人员，下离运输工具时做鞋底消毒（4）动植物性废弃物、泔水不得擅自抛弃，须作无害化处理。第四节 食品境内检疫的分类产地检疫；净化检疫；运输检疫；屠宰检疫；市场检疫1、 产地检疫
9、具体地说就是动植物或动植物产品在国内省间或省内进行调动前，由检疫人员在动植物生长或动植物产品生产期间于原产地进行检验、检测，以防止管制性动物疫病或植物有害在国内传播或扩散的一项措施。2、 市场检验的检查内容：市场卫生条件是否卫生、动物产品证章是否齐全、产品有无异常、不合格的是否按规定处理等。第二章 食品检疫的程序、方法与监管第一节 食品国境检疫的程序上面是检验检疫法律下面是检验检疫行政法规一、检疫审批与报检（一）检疫审批（检疫许可）1.国家相关法律规定：对进境动植物及其产品必须事先办理检疫审批手续，获得中华人民共和国进境动植物检疫许可证2.检疫审批的目的避免盲目进境，减少经济损失提出检疫要求，
10、加强预防传入依据贸易合同，进行合理索赔3.检疫审批的范围 进境动植物检疫审批名录 国家质检总局2002年第2号公告动物检疫审批：动物、食用性动物产品、非食用性动物产品植物检疫审批：果蔬、烟草、粮谷、豆类、薯类、饲料类特许审批：动植物病原体、害虫及其他有害生物等国境审批：所有过境的动植物4.检疫审批的基本手续（1）符合下列条件的可办理进境检疫审批手续输出国或地区无重大动物疫情符合中国有关动植物检疫法律法规、规章的规定符合中国与输出国或地区签订的有关双边检疫协定（2）在贸易合同签订前办理检疫审批手续（3）进口单位进口符合国家规定的动植物产品，应到国家质量监督检验检疫总局办理进境检疫审批手续。（4）
11、检疫审批的基本手续：领取单证、报请批准、批准输入过境的动植物及其产品要经出入境检验检疫总局同意后，签发动植物过境许可证，并按规定路线运输。5.重新审批检疫许可证的有效期一般为3个月。发生以下情况需重新办理检疫许可手续：变更进口食品的品种或数量变更输出国或地区变更出境口岸超过检疫许可证审批有效期（二）报检注意事项：（1）报检由报检员凭报检员证向检疫机关办理手续（2）提供报检资料，如报检单、检疫许可证、产地检疫证书、贸易合同等（3）报检形式：窗口报检和电子报检相关凭证符合要求，检验检疫机构签发出境货物通关单，供海关验收。2.报检范围 在进出境食品检疫中，下列3类需进行报检（1）列入出入境检验检疫机
12、构实施检验检疫的进出境商品目录内所涉及的进出口食品海关监管条件(类别)，有A、B、D三种类别A：须实施进境检验检疫B：须实施出境检验检疫D：表示海关与检验检疫联合监管检验检疫类别包括：M、N、P、Q、R、S、L M：进口商品检验 N：出口商品检验 P：进境动植物、动植物产品检疫 Q：出境动植物、动植物产品检疫 R：进口食品卫生监督检验 S：出口食品卫生监督检验 L：民用商品入境验证(2)对装运出口易腐烂变质食品、冷冻食品的船舱、集装箱等运载工具的检验。（3）对商品目录外的出境食品及入境的食品、食品添加剂、食品容器、包装材料、食品用工具及设备的卫生检验3.报检时间与地点4.重新报检凡有下列情况之
13、一的，应重新向检验检疫机关报检：超过检验检疫有效期限或逾期报关出口仍需要出口的更改不同输入国或地区而有不同检疫要求的出境改换包装或重新拼装的货物报检后在30d内未联系检验检疫事宜或自动撤销报检的。二、预检2.预检与产地检疫的区别：主管部门不同产地检疫属于国内检疫机关，预检属于输入国检疫机关针对原产地不同产地检疫针对的是本国的原产地，预检针对的是对方国家的原产地针对的疫情不同产地检疫针对的是本国动植物疫情，预检针对的是对方国家动植物疫情三、现场检验检疫2.现场检验检疫的内容及操作步骤（1）内容食品有无与农药、化肥及其他化学品混装；食品有无污染、腐败、虫蛀及其他感官性状异常冷冻食品是否解冻，包装是
14、否完整小批量定型包装食品检查商品标签、生产日期、品种、数量是否与报检一致所有检验检疫的过程和结论要有记录，同时进行采样用于实验室检验（2）现场检验检疫的操作步骤查验报关单，并对食品及运载工具实施卫生监督查看货物与报关单行否相符种类、数量、是否消毒开仓检查食品有无异常，无异常的开具检验检疫放行单检验检疫人员对货物检查的整个过程进行卫生监督3.现场处理 根据检验情况，采取不同的处理方法发现有害物质，应立即停止作业，保护现场，等待检验检疫机构进一步处理单证不符的应在规定期间内补办，否则按规定做退货或销毁处理可能携带有害生物的，退货或销毁对取得我国进口注册证书的国外生产厂家凭输入国检验检疫机构证明，并
15、符合我国食品卫生规定的，可只进行感官检查。四、抽样检查包括：抽样依据、抽样方法、抽样工具、抽样标签、有氧环境、抽样过程、样品保存、样品送检等。2.抽样依据与方案抽样依据： 进出口合同中规定的方法 没有合同的按国家相关标准进行 抽样必须具有代表性、准确性、科学性 采集的样品要及时送检抽样方案：按国家有关法律进行五、隔离检疫隔离检疫物主要是活的动植物。对动植物产品也要调离到口岸动植物检验机构认可的仓库封存、待检。六、实验室检验1.主要是通过感官、理化、微生物的方法进行检验检疫，来判定所检食品的各项指标是否符合我国法律或合同中规定。2.实验室检验的一般步骤和要求收样人核对样品，并签字。按国家规定的方
16、法及时准确进行检验。一般情况下6个工作日内给出检验结果，结果必须经检验人员、核校人员、实验室负责人签字。检验报告、检验记录单一并交现场检疫人员七、检疫处理处理：符合我国食品卫生标准和要求的签发进出口食品卫生证书；不符合卫生要求的，按有关规定做退货、销毁、改作他用、加工处理后食用等意见八、检疫出证放行第二节 食品境内检疫报检、检疫、检疫处理第三节 食品检疫的方法选用检验技术的原则：准确可靠、灵敏度高快速、简便标准化操作，重复性好安全，不扩散病原检验检疫的方法：现场检查和实验室检查现场检查：动物寄生虫（蠕虫、节肢动物）；植物的昆虫、螨类、线充、杂草种子实验室检查：真菌、细菌、病毒一、动物性食品检验
17、检疫常用方法动物性食品包括：各种动物、肉及其制品、乳及其制品、蛋及其制品、水产品、蜂蜜等。动物性食品检查主要是检验是否携带动物疫病或食源性病原体1.病原检验主要是对病原进行分离、培养及种类鉴定病毒的培养：单层细胞培养、鸡胚接种分离、实验动物分离接种细菌、霉菌的培养：普通培养基或选择性培养基显微镜进行形态学鉴定，生化试验进行特性鉴定2.血清学试验原理：依据机体的免疫应答机制，利用抗原抗体之间特异性结合现象而研制的各种血清学试验试剂和方法，来诊断机体内是否有病原体或相对应抗体的存在。常用方法：中和试验、免疫琼扩试验、血球凝集抑制试验、试管凝集反应试验、平板凝集试验、免疫电泳、免疫荧光染色等3.病理
18、学检验对患病或死亡动物进行剖检、病理组织学检查。二、植物性食品植物性食品包括：粮谷、大米、豆类、茶叶、水果、蔬菜等。植物性食品检查主要是检验是否携带检疫性植物有害生物或食源性病原体。1.密度检测一般用于检验粮谷、豆类中的钻蛀性害虫也可检验菌瘿、菌核、秕子、杂草籽。原理是：有害虫的籽粒、菌瘿、菌核、病秕子、草籽比健康籽粒轻，浸入一定浓度的食盐水或其他溶液中，前者会浮于表面。摄取漂浮物，再结合解剖、镜检，即可鉴定种类。2.染色检测原理：某些植物或植物器官，被害虫危害或病原物感染后、某些病原物本身，常可用特殊的化学药品处理，使其染上特有的颜色，以帮助检出病虫和区分病虫的种类。3.洗剂检测：用途：检测
19、附着在种子表面的各种真菌孢子、细菌或颖壳上的病原线虫。主要步骤：取适量样品两份，分别放入三角瓶内，各注入无菌水并震荡，使附着在种子表面的病菌孢子洗下来，将悬浮液分别倒入洁净的离心管内，离心，使病原物完全沉于罐底；弃去上清液，摇动离心管，让孢子重新悬浮，将两管合并，用干净的洗玻璃棒将悬浮液滴于载玻片上，显微镜观察。4.鉴别寄主检测对特定病原物有特殊反应或表现特定症状的植物称为鉴别寄主。原理：不同种类的病毒和细菌，接种到某些特定的敏感植物上可以产生特定的症状。根据这些症状的特点，判定某种病原物是否存在。第四节 食品检疫的监管一.检疫监管的作用提高工作效率和通关速度，降低生产成本解决潜伏期的动物疫病
20、和植物有害生物的检验问题为实行食品溯源管理制度创造必要条件二、检疫监管的范围进境动植物及其产品的除虫、灭菌过程进境动植物由进境口岸到隔离检疫场所的运输及检疫过程运往保税区的进境动植物、动植物产品和其他检疫物，装载容器、包装物的检疫进出境水果、蔬菜、肉类制品、奶制品的加工、存放出境动植物及其产品的生产、加工、存放过程的检疫监督。对重点食品实施疫情、疫病监控三、检疫监管的基本方法1.实行注册登记制度进口食品国外生产企业注册管理规定向中华人民共和国认证认可监督管理局申请注册预包装的进出口食品必须贴进出口食品标签（CIQ标志）2.实行食品质量安全市场准入制度 实施食品生产许可制度 对食品生产企业实行强
21、制检验制度 检验合格的食品加贴QS标志3.进行疫情监测及时掌握危险性动植物疫情的传播情况，掌握食源性疾病的流行态势4.建立风险分析、风险预警和快速反应机制收集国内外相关疫情并进行分析，及时发布警示通告，并采取有效措施控制风险5.建立监管库区经口岸动植物检疫机关同意并批准建立的存放进出境动植物、动植物产品的监督管理场所。第三章 食品检验检疫新技术第一节 免疫学检测技术一、免疫学检测方法的原理抗原的两种基本特性：免疫原性、抗原性 完全抗原与半抗原完全抗原：完全抗原（complete antigen) 具有免疫原性和抗原性的物质。不完全抗原：又称半抗原，无免疫原性，只有抗原性的物质。 载体：载体（c
22、arrier）赋予半抗原以免疫原性的蛋白质。 半抗原 + 蛋白质（载体） 完全抗原。抗体是由B细胞产生的，存在于组织液、淋巴液、血液、脑脊髓液等体液中。（3）血清学试验抗原抗体在体外发生的特异性结合反应、抗原抗体的反应一般都要用血清，故称为血清学试验或血清学反应血清学反应的特点：具有特异性与交叉性；具有敏感性；具有生理特性；反应的两个阶段性；反应的稳定性与可逆性的。影响血清学试验的的因素：抗体、抗原、电解质:常用:0.85氯化钠或各种缓冲液(作用:中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降，促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物)、酸碱度: pH为68进行、温度:一般以154
23、0为宜，最适为37。血清学反应的应用：用已知的抗原检测未知的抗体；用已知的抗体检测未知的抗原。血清学检测常用方法：凝集反应、沉淀反应、标记抗体（或抗原）技术ELISA、RIA2.免疫学检测方法的原理原理：借助抗原和抗体在体外特异性就结合后出现的各种现象，对标本中的抗原或抗体进行定性或定量的检测。定性检测：用已知的抗体（或抗原）和待检样品混合，经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生，就说明待检样品中有相应的抗原（或抗体）存在，若无预期的现象发生，则说明样品中无相应的抗原（或抗体）存在。定量检测：反应中加入抗原和抗体的浓度与形成免疫复合物的浓度成函数关系，根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗
24、原（或抗体）的浓度。即在一定的反应条件下，加入的已知抗体（或抗原）的浓度一定，反应产生的免疫复合物多少与待测样品中含有相应的抗原（或抗体）量成正比。二、ELISA快速检测方法（一）基本原理酶联免疫吸附剂测定（ELISA）。抗体（抗原）与酶结合后，仍能和相应的抗原（抗体）发生特异性结合反应，将待检样品事先吸附在固相载体表面（包被），加入酶标抗体（抗原），酶标抗体（抗原）与吸附在固相载体上的相应的抗原（抗体）发生特异性结合反应，形成酶标记的免疫复合物，不能被缓冲液洗掉；当加入酶的底物时，底物发生化学反应，呈现颜色变化，颜色深浅与待测抗原或抗体的量相关，借助分光光度计的吸光度计算抗原（抗体）的量，也
25、可用肉眼定性观察。基于抗原抗体反应的特异性和等比例性以96孔的聚苯乙烯塑料微孔板（又称酶标板）为载体没有被吸附（游离）的抗原或抗体通过洗涤除去复合物上的酶催化底物使其水解、氧化或还原成为有色的底物。（二）ELISA的种类1.直接法：是指酶标抗原或抗体直接与包被在酶标板上的抗体或抗原结合形成酶标抗原抗体复合物，加入酶反应底物，测定产物的吸光值，计算出包被在酶标上的抗体或抗原的量。2间接法：是将酶标记在二抗上，当抗体（一抗）和包被在酶标板的抗原结合形成复合后，再以酶标二抗和复合物结合，通过测定酶反应产物的颜色可以（间接）反应一抗和抗原的结合情况，进而计算出抗原或抗体的量。3.夹心法：是先将未标记的
26、抗体包被在酶标板上，用于捕获抗原，在用酶标的抗体与抗原反应形成抗体-抗原-酶标抗体复合物；也可以象间接法一样应用酶标二抗和抗体-抗原-抗体复合物结合，形成抗体-抗原-抗体-酶标二抗复合物。4.竞争法：在进行测定时首先将包被了抗体的酶标板的微孔分为测定孔和对照孔，在对照孔中加入已知浓度的系列标准品溶液和酶标记物；在测定孔中同时加入酶标记物和待检样本（抗原），酶标记物和样品互相竞争包被抗体的结合点，形成酶标记的抗原抗体复合物固定在微孔内，没有吸附的酶标记物通过洗涤去除，加入底物溶液于微孔中，复合物上的酶催化底物使其水解、氧化还原成为有色的产物。当测定孔内的样本不含抗原时，固相上的抗体将和酶标记物结
27、合加入底物后呈色较深，当样本含有抗原时，样本中的抗原和酶标记物共同竞争抗体的结合位点，酶标抗原的比例越高，结合在固相抗体上的酶标抗原就越多，酶标抗原的比例越低，结合在固相上的抗体就越少，而在一定的条件下，复合物上酶的量（也反映了固定化的抗原抗体复合物的量）和酶产物呈现的色泽成正比，因此可以用分光光度计进行测定，从而计算出参与反应的抗原和抗体的量，从而进一步得知样本中抗原的多少。（三）抗体的酶标记用于ELISA的酶有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。（四）酶与底物不同的酶适宜不同的底物（见表4-1）辣根过氧化物酶的底物常用3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）碱性磷酸酶的底物常用对硝
28、基苯磷酸酯(p-NPP) （五）固相载体基本要求：结合容量高，结合稳定；可与抗原抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法简便易行、快捷经济。固相载体的种类与选择塑料制品。材料经济，操作简便，易于自动化，最常用。如聚苯乙烯等。微颗粒。结合容量大，反应迅速，普遍用于自动化分析。膜载体。如：硝酸纤维素膜（NC）等（六）ELISA测定方法加样、保温、洗涤、比色、结果判定完整的ELISA试剂盒应包含以下各组分： 已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂，俗称酶标板）； 酶标记的抗原或抗体（酶标记物）； 酶的底物； 系列参考标准品（定量测定）； 酶标记物及样本的稀释液； 洗涤液； 反
29、应终止液。 （七）ELISA在食品检验中的应用药物残留的检测、农药残留的检测、微生物的检测、毒素的检测、转基因产品的检测三、免疫层析条检测方法其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素膜一端浸入样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。免疫层析法的特点： 快速：全部检测过程仅需 5-20分钟。 简便：不需其它任何仪器设备，操作也极其简单，可随时随地进行。 可单份检测：对标本既能成批检测，又可单份检测可立刻拿到结果，不必等待。
30、稳定性好：金标试剂稳定，可长期保存。第二节 PCR检测方法PCR技术的特点：1）高度的灵敏性皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU细菌检测的最小检出率为3个细菌2）特异性引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反 应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。引物设计（对标本的纯度要求低）：（1)序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。（2）引物长度以15-40 bp为宜。（3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。（4）引物内部避免形成二级结构。
31、（5）两引物间避免有互补序列。（6）引物3端为关键碱基；5端无严格限制。3）操作简便易行利用PCR扩增,只需要数小时,就可以扩增出 可用电泳法检出的DNA，可用于检测基因组中仅含数个拷贝的模板序列。 三、PCR的类型1.多重PCR：用于检测特定基因序列的存在或缺失。2. 反转录PCR（RT-PCR）3、免疫-PCR(immuno-PCR)利用抗原-抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性来检测抗原，适用于极微量抗原的检测。免疫PCR优点为：特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础上敏感度高，PCR具有惊人的扩增能力，免疫PCR比ELISA敏感度高105倍以上，可用于单个抗原的检测操
32、作简便，PCR扩增质粒DNA比扩增靶基因容易得多，一般实验室均能进行。免疫-PCR试验的主要步骤有三个：抗原-抗体反应，与嵌合连接分子结合，PCR扩增嵌合连接分子中的DNA(一般为质粒DNA)。该技术的关键环节是嵌合连接分子的制备。四、PCR检测技术的应用1.微生物菌体的检测：细菌、霉菌、病毒2.微生物毒素的检测：葡萄球菌肠毒素3.寄生虫的检测4.转基因食品的检测5.食品掺假的检测第三节 核酸探针技术一、核酸探针的原理原理：基因探针或DNA探针技术检测微生物的依据是核酸杂交，其工作原理是2条碱基互补的DNA链在适当条件下可以按碱基配对原则,形成杂交DNA分子。食品卫生检验中的一个十分重要的内容
33、准确地检测出食品中的病原性微生物。通过考查待测样品与标记性DNA探针（如用32P同位素标记）能否形成杂交分子,即可判断样品中是否含有此种微生物,并且还可以通过测定放射性强度考查样品中微生物数量。核酸分子杂交的3种形式：DNA-DNA之间；RNA-RNA之间；DNA-RNA之间二、探针的标记物分类同位素： 32P、35S、3H、125I等标记探针非同位素： 生物素、地高辛配体、荧光素等作为标记物两者比较：后者不及前者敏感，但后者保存时间较长，无同位素污染。据来源及性质不同可分为： (1) 基因组DNA探针 (2) cDNA探针 (3) RNA探针 (4) 寡核苷酸探针三、探针的标记方法:1.缺口
34、平移法2 .随机引物标记法3.末端标记法4 .生物素光照标记法1.缺口平移法的原理将DNAase I 的水解活性与大肠杆菌DNA polymerase I 的53的聚合酶活性和5 3的外切酶活性相结合。首先用E.coli的DNAse I 在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA pol I的53外切酶活性，切去带有5-磷酸的核苷酸；同时利用该酶53聚合酶活性，使生物素或同位素标记的互补核苷酸补入缺口。 这两种活性同时作用，缺口不断向3方向移动，DNA链上的核苷酸不断为标记的核苷酸取代，成为带有标记的DNA，纯化除去游离脱氧核苷酸后成为标记DNA探针。 要点：1）DNAase I在探针DN
35、A打开缺口2）DNApol-I在缺口处按53方向切除单核苷酸3） DNApol-I的53聚合：在缺口3端随机掺入dNTP与32P-dNTP ，探针即被标记随着反应的进行底物中被标记单核苷酸，并被随机掺入。DNA聚合酶I的两种作用交替进行，探针即被标记。 实质：用-32PdNTP取代原来DNA链中不带同位素的同种核苷酸，生成的两条链均被同位素标记2.随机引物标记法原理用一些六核苷酸作为随机引物，将这些引物和探针DNA片段一起热变性，退火后，引物与单链DNA互补结合，再在DNA聚合酶的作用下，按碱基互补配对原则不断在其3- OH端添加标记的单核苷酸修补缺口，合成新的标记的探针片段。要点：人工合成的
36、6个核苷酸长的不同引物，可随机地与DNA探针互补作为引物， 在E.coli DNA pol-I的Klenow片段53聚合作用下，合成与探针DNA互补的长短不等的DNA探针。3.末端标记法原理（1）一种是在5末端加成标记法：先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5-磷酸，再用T4多核苷酸激酶催化标记的ATP 的-磷酸转移加到DNA片段5-OH上。（2）在探针3-末端用末端转移酶掺入一个单标记的-32PdNTP。4.生物素光照标记法光敏生物素在紫外线照射下与DNA或RNA的碱基发生化学加成反应，获得生物素标记的DNA探针。四、核酸探针的杂交技术目前使用的DNA探针杂交方法可分为两类：异相杂交固相杂
37、交技术;同相杂交液相杂交技术1.异相杂交Southern 印迹被检测对象为DNA。 2.同相杂交分子信标是一种荧光探针。探针的5端及3端分别连接荧光素分子及淬灭剂分子。自由状态时，发夹结构的两个末端靠近，使荧光分子与淬灭分子靠近。此时发生荧光共振能量转移,使荧光分子发出的荧光被猝灭分子吸收并以热的形式散发，荧光几乎完全被猝灭，荧光本底极低。当分子信标与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时，信标茎杆互补区被拉开，荧光分子和淬灭分子距离增大。根据Foerster 理论, 中心荧光能量转移效率与两者距离的6 次方成反比。杂交后，信标分子的荧光几乎100%恢复。且所检测到的荧光强度与溶液中靶标的
38、量成正比。核酸探针技术在食品微生物检测中的应用:目前可以用DNA探针检测食品中的大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、耶希氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌等。关键DNA探针的构建原则以待检微生物中的特异性保守基因序列为目标 DNA,以该序列的互补DNA作为杂交探针。对一般微生物而言,可以用决定该微生物特有的生理、生化特性的基因序列构建特异性的DNA探针。一 传统的微生物检测方法（一般都涉及到对病原性微生物的培养、形态及生理生化特性的分析等程序）优点：比较有效，特异性也比较高缺点：检测成本高、速度慢、效率低二基因探针技术:不仅能克服传统食品微生物检验方法的不足,而且还具有特异性强、灵敏度高和操作简便、省时
39、等优点例如：与其它微生物相比,大肠杆菌具有葡糖苷酸酶的特性,Cleuziat 等用大肠杆菌中编码该酶的基因序列作为目标DNA,并制成DNA探针, 用以检测食品中的总大肠杆菌。而对不同种类的大肠杆菌,如产肠毒素的大肠杆菌(ETEC) 、致肠出血大肠杆菌(EHEC)以及致肠病的大肠杆菌(EPEC)等的检测鉴别,已分别使用产肠毒素基因序列、致肠出血的基因序列及致肠病的基因序列作为目标DNA,构造出相应的DNA探针,用以鉴别上述不同种类的大肠杆菌。应用成果:美国的Gene-Trak公司已开发出检测大肠杆菌的商品化DNA探针系统.以PCR扩增大肠杆菌的目标DNA,再用DNA探针杂交检测,不需要进行微生物
40、分离培养,最快可以在1h内完成检测操作,检测灵敏度为103个大肠杆菌细胞每g或每mL食品样品。美国环保署早在1990年就已正式使用DNA探针杂交技术检测饮用水中大肠杆菌总数国外Moseley等利用生物素标记的克隆沙门氏菌DNA片段作为基因探针,检测临床样品、食品及饲料样品中的沙门氏菌,敏感性为80个细菌/克Hill等人曾用a-32P标记的DNA探针检测污染食品中的产热敏性肠毒素(LT)的大肠杆菌,其敏感性达100个细菌/克存在问题:一是放射性同位素标记的DNA探针具有半衰期短,对人体有危害,作为常规诊断、特别是在食品检测实验室中不太适用。二是生物素标记的DNA探针虽然对人畜无害,但生物素标记的
41、DNA探针在紫外线照射下易分解,同时食品中的内源性生物素化蛋白质和其他糖蛋白类物质常引起背景加深和非特异性反应。三是菌落杂交的敏感性也受其他因素的影响。五、生物芯片1.生物芯片的分类:DNA芯片(Gene chip, DNA chip, DNA microarray)、蛋白质芯片(Protein chip)、芯片实验室(Lab-on-a-chip)基因芯片：它以其可同时、快速、准确地分析数以千计的基因组信息而显示巨大威力。目前，基因芯片已经应用于基因表达检测、寻找新基因、杂交测序、基因突变等许多方面。2.DNA芯片技术的基本原理DNA芯片技术的基本原理是分子识别，与Southern杂交和Nor
42、thern杂交同出一理，即DNA的碱基互补配对和序列互补原理。3.DNA芯片技术流程芯片方阵的构建；样品制备；生物分子反应；信号的检测及分析 第四章 动物性食品中致病性微生物的检验第一节 概述微生物危害是我国食品质量安全的主要问题。一、食品的微生物质量主要包括三个方面：安全性：食品必须不含病原菌及其毒素；货架寿命：不能含有较多数量的微生物；稳定性：必须有稳定的质量同时具有可靠的安全性和货架寿命。二、食品微生物质量指标 2、应用特定微生物的数量作为食品微生物质量指标：食品的腐败与食品中某一特定微生物的生长数量有关，故可用适当的选择性培养基，来监控微生物的数量，食品中腐败菌数量的增加，则意味着该食
43、品的微生物质量下降了。3、应用微生物的代谢产物作为食品微生物质量指标：食品中微生物的代谢产物可使食品的化学组成发生变化，故也可用来评价和预测食品的微生物质量。如组胺，三甲胺，总挥发氮，丁二酮，乙醇，乳酸，总挥发酸，等。4、应用微生物的总活菌数量作为食品微生物质量指标：由于很难确定食品最终腐败产物中特定微生物的数量，因此测定总活菌数作为食品微生物质量指标比预测食品的有效保质期更有价值。三、食品微生物学指标 1.食品微生物学指标意义:可以反映食品的微生物质量;与食品的有效保质期有关;与由食品传播的病原菌引起的食物中毒或传染病的安全性密切相关。食品微生物学指标用途:用来评价食品质量;作为食品安全性综
44、合评价的一部分;也常用于评价食品加工场所环境卫生状况。2.指标项目：目前，我国食品卫生标准中的微生物指标一般是五项:细菌总数、大肠菌群、致病菌、霉菌、酵母菌。3. 致病菌 食品中不允许有致病性病原菌存在，所以在食品卫生标准中规定，所有食品均不得检出致病菌。病源菌种类繁多，在国家食品卫生标准中要求检验的病源菌至少有15种(GB/T4789)，因此一般食品卫生检验，只能根据不同食品可能污染情况针对性的重点检查，并以此来判断某种食品中有无致病菌的存在。冷冻食品新国标允许致病菌规定每批产品抽检5个样品中，至多只能有1个样品每克生制品中检出的金黄色葡萄球菌含量在1000至10000个之间。例如：禽、蛋、
45、肉类食品必须作沙门氏菌的检查；低酸性罐头必须作肉毒梭菌及其毒素的检查；多种发酵食品等规定肠道致病菌和致病性球菌是检测重点；发生食物中毒时要结合流行病学，对食品进行有关病原菌的检查，如沙门氏菌、志贺氏菌、变形杆菌、肠道出血性大肠杆菌（O157H7）、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、副溶血性弧菌等。另外，细菌毒素也是检测致病菌的重要方面，因为许多食品经加热、辐射等方法杀菌处理后，其中的致病菌被杀死，但细菌性外毒素、内毒素等抗性较强，并未完全破坏，由此发生的食物中毒事件屡屡发生。第三节 动物性食品中致病菌的检验传统培养检测方法金标准预增菌选择性增菌分离培养生化或血清学鉴定其它检测方法：微量生化法；快速酶触反应及代谢产物的鉴定；分子生物学技术；免疫学方法检测细菌抗原和抗体的技术。一.结核分支杆菌结合分支杆菌分主要有人型、牛型、禽型三型。牛型主要侵害牛，也可侵害人；人型侵害人和牛；禽型主要侵害禽类；猪对三种结核杆菌都易感。结核杆菌主要通过消化道和呼吸道感染。当细菌侵入机体后，机体抵抗力强时，在