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1、第二章酶与细胞的固定化第一页，本课件共有98页引引 言言 酶是一类由生物细胞产生的酶是一类由生物细胞产生的具有催化功能的蛋白质。具有催化功能的蛋白质。酶参与生物体内的各种代谢反酶参与生物体内的各种代谢反应应,而且反应后其数量和性质不而且反应后其数量和性质不发生变化。发生变化。第二页，本课件共有98页高效率高度专一性可调控性反应条件温和广泛应用于酿造、食品、医药等领域 第三页，本课件共有98页酶对环境十分敏感酶对环境十分敏感 物理因素：温度、压力、电磁场物理因素：温度、压力、电磁场 化学因素：氧化、还原、有机溶剂、金属化学因素：氧化、还原、有机溶剂、金属 离子、离子强度、离子、离子强度、pHpH
2、 生物因素：酶修饰和酶降解生物因素：酶修饰和酶降解 反应速度逐渐下降反应速度逐渐下降 反应后不能回收反应后不能回收 q对于现代工业来说对于现代工业来说,酶还不是一种理想的催化剂酶还不是一种理想的催化剂怎样才能获得理想的生物催化剂?第四页，本课件共有98页答案：答案：固定化酶固定化酶固定化细胞固定化细胞固定化酶与固定化细胞是酶工程研究固定化酶与固定化细胞是酶工程研究中的一个广阔领域，前景光明中的一个广阔领域，前景光明第五页，本课件共有98页第六页，本课件共有98页第一节第一节 酶的固定化酶的固定化第七页，本课件共有98页固固定定化化酶酶是是指指将将水水溶溶性性的的酶酶用用物物理理或或化化学学方方
3、法法处处理理，使使之之成成为为不不溶溶于于水水的的，但但仍仍具具有有酶酶活活性性的的酶酶。反反应应后后的的酶酶可可以以回收重复使用。回收重复使用。一、固定化酶的定义一、固定化酶的定义第八页，本课件共有98页固定化酶的优点固定化酶的优点极易将固定化酶与底物、产物分开极易将固定化酶与底物、产物分开;可可以以在在较较长长时时间间内内进进行行反反复复分分批批反反应应和和装装柱柱连续反应连续反应;在大多数情况下在大多数情况下,能够提高酶的稳定性能够提高酶的稳定性;酶反应过程能够加以严格控制酶反应过程能够加以严格控制;产物溶液中没有酶的残留产物溶液中没有酶的残留,简化了提纯工艺简化了提纯工艺;较游离酶更适
4、合于多酶反应较游离酶更适合于多酶反应;可以增加产物的收率可以增加产物的收率,提高产物的质量提高产物的质量;酶的使用效率提高酶的使用效率提高,成本降低。成本降低。第九页，本课件共有98页固定化酶存在的缺点固定化酶存在的缺点固定化时固定化时,酶活力有损失酶活力有损失;增加了生产的成本增加了生产的成本,工厂初始投资大工厂初始投资大;只能用于可溶性底物只能用于可溶性底物,而且较适用于而且较适用于小分子底物小分子底物,对大分子底物不适宜对大分子底物不适宜;与完整菌体相比不适宜于多酶反应与完整菌体相比不适宜于多酶反应,特特别是需要辅助因子的反应别是需要辅助因子的反应;胞内酶必须经过酶的分离手续。胞内酶必须
5、经过酶的分离手续。第十页，本课件共有98页二、固定化酶的制备原则二、固定化酶的制备原则根根据据应应用用目目的的、应应用用环环境境，选选择择固固定定化化的方法的方法，都要遵循以下基本原则，都要遵循以下基本原则：必须注意维持酶的催化活性及专一性。必须注意维持酶的催化活性及专一性。固定化应该有利于生产自动化、连续化。固定化应该有利于生产自动化、连续化。固定化酶应有最小的空间位阻固定化酶应有最小的空间位阻酶酶与与载载体体必必须须结结合合牢牢固固,从从而而使使固固定定化化酶酶能能回收贮藏回收贮藏,利于反复使用。利于反复使用。固固定定化化酶酶应应有有最最大大的的稳稳定定性性,所所选选载载体体不不与与废物、
6、产物或反应液发生化学反应。废物、产物或反应液发生化学反应。固定化酶成本要低固定化酶成本要低,以利于工业使用。以利于工业使用。第十一页，本课件共有98页三、固定化方法三、固定化方法 酶的固定化方法很多酶的固定化方法很多,但对任何酶都但对任何酶都适用的方法是没有的适用的方法是没有的,必须经过实验研究必须经过实验研究才能确定。才能确定。第十二页，本课件共有98页(一一)非共价结合法非共价结合法1.结晶法结晶法使酶结晶从而实现固定化的方法。使酶结晶从而实现固定化的方法。2.分散法分散法通过酶分散于水不溶相中从而实现固通过酶分散于水不溶相中从而实现固定化的方法。定化的方法。第十三页，本课件共有98页3.
7、吸附法吸附法（1）物物理理吸吸附附法法利利用用氢氢键键、疏疏水水键键等等作作用力将酶固定于不溶性载体上。用力将酶固定于不溶性载体上。l无机吸附剂：高岭土、皂土、硅酸、氧无机吸附剂：高岭土、皂土、硅酸、氧化铝等化铝等l吸附量小、有些酶发生吸附变性吸附量小、有些酶发生吸附变性有有机机吸吸附附剂剂：大大孔孔树树脂脂、葡葡聚聚糖糖凝凝胶胶、纤纤维素衍生物维素衍生物、胶原等、胶原等吸吸附附量量略略大大(50mg/g载载体体),不不产产生生变变性失活性失活。比较受重视比较受重视。第十四页，本课件共有98页（2）离子结合法离子结合法酶酶通通过过离离子子键键结结合合于于具具有有离离子子交交换换基基的水不溶性载
8、体的固定化方法。的水不溶性载体的固定化方法。CM-纤维素、纤维素、DEAE-纤维素纤维素吸附量吸附量50-150mg/g优点：优点：操作方便操作方便,条件温和条件温和,可再生后反复使用可再生后反复使用缺点：缺点：结结合合力力较较弱弱,不不适适宜宜的的pH,高高盐盐浓浓度度,高高底底物物浓浓度度,高高温温等等往往往往能能把把吸吸附附的的酶酶解解析析下下来。来。第十五页，本课件共有98页吸附法吸附法第十六页，本课件共有98页可以改善方法：可以改善方法：1.选择最佳条件操作（如温度、选择最佳条件操作（如温度、pH）2.选吸附量大的载体，控制酶和载体量，选吸附量大的载体，控制酶和载体量，3.采用高酶量
9、吸附采用高酶量吸附4.开发新载体开发新载体5.对酶进行修饰后再进行交换吸附对酶进行修饰后再进行交换吸附第十七页，本课件共有98页(二二)化学结合法化学结合法 1、共价结合法、共价结合法酶与载体以共价键结合的固定化方法。酶与载体以共价键结合的固定化方法。分为两类：分为两类：（1 1）将载体有关基团活化，然后与酶有）将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。关基团发生偶联反应。（2 2）在载体上接一个双功能试剂，然后将）在载体上接一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。酶偶联上去。第十八页，本课件共有98页共价结合法共价结合法第十九页，本课件共有98页偶联成功与否取决于：偶联成功与否取决于：载体
10、：功能基团，如羟基、芳香氨基，载体：功能基团，如羟基、芳香氨基，羧基，羧甲基等羧基，羧甲基等 酶分子酶分子:侧链非必需基团侧链非必需基团（游游 离离 的的-氨氨 基基，lysNH2,lysNH2,Arg-Arg-胍胍基基 C-COOH,C-COOH,Asp-Asp-羧羧基基，Glu-Glu-羧基，羧基，酚羧基，巯基，咪唑基酚羧基，巯基，咪唑基)但但是是，载载体体、酶酶分分子子上上的的基基团团不不会会直直接接反反应应，其功能基团要活化。其功能基团要活化。第二十页，本课件共有98页1)1)重氮化重氮化芳香氨基载体芳香氨基载体方法特点：方法特点：载载体体先先用用亚亚硝硝酸酸处处理理成成重重氮氮盐盐衍
11、衍生生物物，再再在在温温和和条条件件下下和和酶酶分分子子上上相相应应基基团团直直接偶联。接偶联。第二十一页，本课件共有98页如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶的固定化，如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶的固定化，偶联到重氮化的偶联到重氮化的苯胺苯胺-多孔玻璃多孔玻璃时，得到时，得到固化酶具很高酶活性固化酶具很高酶活性第二十二页，本课件共有98页2 2）溴化氰溴化氰-亚氨碳酸基反应亚氨碳酸基反应 带带羟羟基基的的载载体体在在碱碱性性条条件件下下，载载体体的的羟羟基基和和溴溴化化氰氰反反应应，生生成成活活泼泼的的亚亚氨氨碳碳酸酸酯酯衍衍生生物物，在在弱弱碱碱中中直直接接和和酶酶的的氨氨基基进行共价偶联。进行共价偶联。
12、最后一种是主要产物。最后一种是主要产物。第二十三页，本课件共有98页此方法固定化后此方法固定化后 相对酶活力比较高，相对酶活力比较高，且相当稳定，且相当稳定，同时操作也简便。同时操作也简便。是最受欢迎的一种方法是最受欢迎的一种方法第二十四页，本课件共有98页2.交联法交联法利利用用双双功功能能或或者者多多功功能能试试剂剂在在酶酶分分子子之之间间或或者者载载体体之之间间；酶酶分分子子与与载载体体之之间间进行交联反应而固定化。进行交联反应而固定化。第二十五页，本课件共有98页双功能试剂：双功能试剂：常用的是戊二醛常用的是戊二醛 O OH C CH2 CH2 CH2 C H第一篇报道是：戊二醛交联羧
13、肽酶得到一种分子间交联第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶的固定化酶第二十六页，本课件共有98页 戊二醛有两戊二醛有两个醛基，均可与个醛基，均可与酶或蛋白质的游酶或蛋白质的游离氨基反应离氨基反应,使酶使酶蛋白交联。蛋白交联。此法与共价结合法利用的均是共价键，此法与共价结合法利用的均是共价键，不同之处：不同之处：交联法不使用载体。交联法不使用载体。第二十七页，本课件共有98页（三）包埋法（三）包埋法（entrapmententrapment）将酶用物理的方法包将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）埋在各种载体（高聚物）内。分为：内。分为：网格型：将酶包埋在高网格型：将酶包
14、埋在高分子凝胶细微网格中。分子凝胶细微网格中。微囊型：将酶包埋在高分微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。子半透膜中。第二十八页，本课件共有98页将将聚聚合合物物单单体体和和酶酶溶溶液液混混合合后后，再再用用聚聚合合促促进进剂剂(包包括括交交联联剂剂)的的作作用用而而聚聚合合，酶酶就就包包埋埋在在载载体体中中达达到到固固定定化化。酶酶本本身身不不参参与反应，所以较安全。与反应，所以较安全。但但在在聚聚合合过过程程中中有有自自由由基基产产生生及及聚聚合合时时放放出出热热，酶酶与与试试剂剂间间可可能能发发生生化化学学反反应应，这这些些因因素素可可能能会会使使酶酶失失效效，或或者者降降低低酶酶活活性。性
15、。操作时注意条件的控制操作时注意条件的控制。第二十九页，本课件共有98页1、网格型、网格型常用的包埋剂如：聚丙烯酰胺凝胶。常用的包埋剂如：聚丙烯酰胺凝胶。先先把把酶酶与与丙丙烯烯酰酰胺胺单单体体分分散散于于疏疏水水介介质质,再再进进行聚合。行聚合。如如：葡葡萄萄糖糖-6-磷磷酸酸脱脱氢氢酶酶包包埋埋于于丙丙烯烯酰酰胺胺和和丙丙烯烯酸酸中中，然然后后再再用用羰羰二二亚亚胺胺活活化化载载体体上上的羧基而共价偶联固定。的羧基而共价偶联固定。第三十页，本课件共有98页优点优点:1.包埋容量包埋容量10-100毫克蛋白毫克蛋白/克单体。克单体。2.改改变变单单体体与与交交联联剂剂比比例例,控控制制凝凝胶
16、胶孔孔径径的的分分布布,改改善善酶酶的的持持留留与与底底物物和和产产物物扩扩散转移状况。散转移状况。3.改改变变单单体体性性质质,可可调调整整固固定定化化酶酶的的亲亲水和亲脂特性。水和亲脂特性。第三十一页，本课件共有98页2、微囊型、微囊型常常用用的的微微囊囊型型包包埋埋剂剂有有尼尼龙龙膜膜、火火棉棉胶胶、醋醋酸酸纤纤维素等。维素等。主主要要是是用用几几十十到到几几百百微微米米、厚厚度度有有250的的半半透透膜膜将将酶酶包包埋埋固固定定化化。半半透透膜膜容容许许小小分分子子底底物物和和产产物物自自由由出出入入囊囊的的内内外外，囊囊的的表表面面积积相相对对体体积积的的比比值值大大，底底物物和和产
17、产物物的交换进行迅速。的交换进行迅速。第三十二页，本课件共有98页制备方法：制备方法：(1)界面沉淀法界面沉淀法利用某些高聚物在水相和有机相的界利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成皮膜将酶面上溶解度极低而形成皮膜将酶包埋。包埋。A.酶溶液在水不互溶的有机相中乳化酶溶液在水不互溶的有机相中乳化B.加入一种加入一种不溶解高聚物的有机溶剂不溶解高聚物的有机溶剂 C.高聚物在油高聚物在油-水界面上沉淀、析出、形水界面上沉淀、析出、形 成膜成膜,将酶包埋将酶包埋,D.从有机相移入水相从有机相移入水相第三十三页，本课件共有98页例：硝酸纤维素固定化酶例：硝酸纤维素固定化酶酶水溶液酶水溶液+
18、硝酸纤维素硝酸纤维素乳化分散乳化分散加苯甲酸丁酯加苯甲酸丁酯纤维素在酶周围凝聚纤维素在酶周围凝聚加加Tween20（乳化剂）（乳化剂）由有机相移入水相由有机相移入水相得到火棉胶微囊。得到火棉胶微囊。优点：优点：1）纤维表面积和重量比值高）纤维表面积和重量比值高2)凝聚后酶稳定性好凝聚后酶稳定性好3)包埋量大包埋量大第三十四页，本课件共有98页(2)界面聚合法界面聚合法 利用亲水性单体和疏水性单体在界面利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶。发生聚合的原理包埋酶。例子：尼龙膜界面聚合包埋例子：尼龙膜界面聚合包埋(酶酶+己二胺水溶液）己二胺水溶液）+（庚二酰氯氯仿溶剂）（庚二酰氯氯仿
19、溶剂）混合乳化混合乳化二二种种单单体体(己己二二胺胺和和庚庚二二酰酰氯氯)在在水水相相、有有机机相交界处聚合形成包埋酶的尼龙膜珠粒相交界处聚合形成包埋酶的尼龙膜珠粒Tween20乳化乳化,得到微囊包埋酶得到微囊包埋酶第三十五页，本课件共有98页(3)二级乳化法二级乳化法酶酶溶溶液液先先在在离离聚聚物物(常常用用乙乙基基纤纤维维素素、聚聚苯苯乙乙烯烯等等)有有机机相相中中乳乳化化分分散散,乳乳化化液液再再在在水水相相中中分分散散形形成成次次级级乳乳化化液液,当当有有机机高高聚聚物物溶溶液液固固化化后后,每每个个固固体体球球内内包包含含着着多多滴酶液。滴酶液。第三十六页，本课件共有98页固定化方法
20、吸附法包埋法共价结合法交联法物理吸附法离子吸附法制备难易易易较难难较难结合程度弱中等强强强活力回收高，酶易流失高高低中等再生可能可能不能不能不能费用低低低高中等底物专一性不变不变不变可变可变各种固定化方法的优缺点比较各种固定化方法的优缺点比较第三十七页，本课件共有98页四、固定化酶的性质 由于固定化也是一种化学修饰,酶本身的结构必然受到扰动,同时酶固定化后,其催化作用由均相移到异相,由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质造成的分配效应等因素必然对酶的性质产生影响。第三十八页，本课件共有98页(一一)固定化后酶活性的变化固定化后酶活性的变化固定化酶的活力在多数情况下比天然固定化酶的活力在多数
21、情况下比天然酶小酶小,其专一性也能发生改变。其专一性也能发生改变。固定化酶的活力要低于等摩尔原酶的活固定化酶的活力要低于等摩尔原酶的活力的原因可能是力的原因可能是：1.构象改变 主要指活性中心构象改变，导致活性降低，从实验可以知道这些情况在吸附和共价偶联方法中出现。与固定化过程有关，与载体性质有关，或者两者都有关。第三十九页，本课件共有98页第四十页，本课件共有98页2立体屏障：指载体孔径太小，或者固定化方法引起位置不当，使酶活性中心或者调节中心造成空间障碍，酶和底物无法结合。这种情况定量测定十分困难，也无法预测。但是当用大孔径胶，或者用吸附和共价偶联法把酶固定于纤维素一类载体上，或者在酶和载
22、体之间加一个“臂”，情况可以改变。第四十一页，本课件共有98页3.见P434.见P43第四十二页，本课件共有98页(二二)固定化对酶稳定性的影响固定化对酶稳定性的影响 在大多数情况下酶经过固定化后其稳在大多数情况下酶经过固定化后其稳定性都有所增加定性都有所增加 MerloseMerlose选选择择5050种种固固定定化化酶酶,就就其其稳稳定定性性与与固定化前的酶进行比较固定化前的酶进行比较 30 30种酶经固定化后稳定性提高种酶经固定化后稳定性提高,12 12种酶无变化种酶无变化,8 8种酶稳定性降低。种酶稳定性降低。第四十三页，本课件共有98页酶稳定性：酶稳定性：总体来讲 1）酶固定化后，酶
23、活性构型更牢固，增加酶的稳定性 2）酶固定化后，更加有利于阻止不利因素对酶的侵袭，如变性剂、抑制剂的抵抗力。3）限制了酶分子之间的相互作用，和减少蛋白酶的破坏作用。4）固定化后可延长酶的操纵和保存的有效期限。第四十四页，本课件共有98页1 1、热稳定性和最适温度上升、热稳定性和最适温度上升 最适温度与酶稳定性有关。最适温度与酶稳定性有关。多多数数酶酶固固定定化化后后热热稳稳定定性性上上升升，最最适适温温度度也上升也上升第四十五页，本课件共有98页如：氨基酰化酶，如：氨基酰化酶，7070，1515分钟，酶没有了活性。分钟，酶没有了活性。固定化后，固定化后，7070，1515分钟，分钟，有有80%
24、80%第四十六页，本课件共有98页2 2、对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高、对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高第四十七页，本课件共有98页固定化酶的最适固定化酶的最适pHpH变化变化 酶酶由由蛋蛋白白质质组组成成,其其催催化化能能力力对对外外部部环环境境特特别别是是pHpH非非常常敏敏感感。酶酶固固定定化化后后,对对底底物物作作用用的的最最适适pHpH和和酶酶活活力力-pH-pH曲曲线线常常常发生偏移。常发生偏移。第四十八页，本课件共有98页 第三节第三节 细胞的固定化细胞的固定化目前的情况有超过固定化酶的趋势。目前的情况有超过固定化酶的趋势。原因原因:1.:1.降低成本降低成本;2.2
25、.固定化细胞比固定化酶简便固定化细胞比固定化酶简便;3.3.可可作作为为单单一一酶酶使使用用，也也可可作作复复合合酶酶系完成部分代谢和发酵过程。系完成部分代谢和发酵过程。第四十九页，本课件共有98页分类方式固定化细胞分类方式固定化细胞细胞类型 微生物 植物 动物生理状态死细胞:完整细胞,细胞碎片,细胞器活细胞:增殖细胞,静止细胞,饥饿细胞一、固定化细胞的分类一、固定化细胞的分类第五十页，本课件共有98页二、固定化细胞的制备方法二、固定化细胞的制备方法第五十一页，本课件共有98页a)直接固定法直接固定法l不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸
26、、各种絮凝剂）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。将细胞直接固定。l一般只用于单酶或少数几种酶催化的反一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。应。第五十二页，本课件共有98页 例如：葡萄糖异构酶例如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌白色链霉菌)，是一，是一种胞内酶。在种胞内酶。在50-8050-80加热加热1010分钟，使菌体分钟，使菌体自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然保自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然保持活性，长期使用酶活力不减少。持活性，长期使用酶活力不减少。第五十三页，本课件共有98页b)b)吸附方法吸附方法c)c)包埋方法包埋方法第五十四页，本课件共有98页 微生物细胞植物
27、细胞动物细胞吸附法吸附力较弱，细胞易脱落包埋法第五十五页，本课件共有98页实实验：验：2.4%左右的卡拉胶左右的卡拉胶，70溶解溶解,再冷却到再冷却到42,+10%左右的细菌菌体左右的细菌菌体(预热到预热到42）迅速混合均匀迅速混合均匀4冰箱放置大约冰箱放置大约30min取出后切成取出后切成33mm的小颗粒的小颗粒第五十六页，本课件共有98页作作用用：固固定定顺顺式式环环氧氧琥琥珀珀酸酸水水解解酶酶产产生生菌菌细细胞胞，利利用用固固定定化化细细胞胞的的胞胞内内酶酶转转化化顺顺式式环环氧氧琥琥珀珀酸酸盐生产盐生产L(+)酒石酸酒石酸第五十七页，本课件共有98页COOHCOOH|CEHCOH|O+
28、H2O|COHCH|COONaCOOH顺式环氧琥珀酸盐顺式环氧琥珀酸盐L(+)酒石酸酒石酸有生产厂用有生产厂用1吨固定化细菌体吨固定化细菌体,生产生产10吨吨L(+)酒石酸酒石酸第五十八页，本课件共有98页第四节第四节 固定化酶与固定化细胞固定化酶与固定化细胞 的应用研究进展的应用研究进展第五十九页，本课件共有98页乙酰乙酰-DL Ala L Ala+乙酸乙酸乙酰乙酰-D Ala 一、在工业生产上的应用一、在工业生产上的应用 1.氨基酰化酶（氨基酰化酶（Aminoacylase）世界上第一种工业化生产的固定化酶世界上第一种工业化生产的固定化酶第六十页，本课件共有98页 2.2.葡萄糖异构酶葡萄
29、糖异构酶 世界上生产规模世界上生产规模最大，应用最为成功最大，应用最为成功的一种固定化酶。的一种固定化酶。第六十一页，本课件共有98页二、固定化酶在医学上的应用二、固定化酶在医学上的应用 1.消血栓消血栓n纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。无法长期使用。n酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。用包埋法制备的酶固定化技术可克服上用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。自由进出。第六十二页，本课件共有98页2.2.人工肾人
30、工肾原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。囊活性炭组成人工肾。第六十三页，本课件共有98页第六十四页，本课件共有98页1.1.酶传感器酶传感器 固定化酶和电化学传感器的结合。固定化酶和电化学传感器的结合。优点：优点：既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；极的高灵敏度；酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定能够直接在复杂试样中进行测定。三、在分
31、析检测中的应用三、在分析检测中的应用第六十五页，本课件共有98页 SensitiveandspecificSensitiveandspecific RapidRapid SimpleSimpleBiosensorBiosensor第六十六页，本课件共有98页 19671967年年UpdikeUpdike等采用酶的固定化等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器世界上第一个生物传感器葡萄糖葡萄糖氧化酶电极氧化酶电极。第六十七页，本课件共有98页 葡萄糖酶电极 酶电极示意图D
32、葡萄糖葡萄糖O2 D葡萄糖酸葡萄糖酸1，5内酯内酯H2O2半透膜酶胶层感应电极第六十八页，本课件共有98页GlucoseGluconicacidGlucoseoxidaseOxygenHydrogenperoxideMembraneElectrode 根据反应中消耗的根据反应中消耗的O O2 2、生成的葡萄糖酸和、生成的葡萄糖酸和H H2 2O O2 2的量，可的量，可以用氧电极、以用氧电极、pHpH电极和电极和H H2 2O O2 2电极来测定葡萄糖的含量。电极来测定葡萄糖的含量。第六十九页，本课件共有98页1）酶传感器的原理）酶传感器的原理l生物传感器生物传感器由生物识别单元（如酶、微生物
33、、抗由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。析仪器。第七十页，本课件共有98页第七十一页，本课件共有98页生物识别元件生物识别元件(Biological recognition element)(Biological recognition element)l 是酶、抗原是酶、抗原(体体)、细胞器、组织切、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定化后片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。选择性的分子识别能力。第七十二页，本课件共有98页
34、换能器换能器(Transducer)(Transducer)将识别元件上进行的生化反应中将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系比例关系。第七十三页，本课件共有98页第七十四页，本课件共有98页酶传感器工作原理示意图酶传感器工作原理示意图酶传感器酶传感器主要由主要由固定化酶膜和变换器固定化酶膜和变换器组成：组成：固定化酶膜：固定化酶膜：选择性地选择性地“识别识别”并催化被检测物质发并催化被检测物质发生化学反应；生化学反应；变换器：变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成
35、电信号，把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。通过仪表显示出来。第七十五页，本课件共有98页第七十六页，本课件共有98页2）酶传感器的应用）酶传感器的应用 l水质监测水质监测 用化学法测定酚时，硫化物、油类等用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。可干扰其测定。从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的从马铃薯中提纯、经吸附交联得到的固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，固定化多酚氧化酶与氧电极构成酚传感器，可检测大多数酚类化合物可检测大多数酚类化合物。第七十七页，本课件共有98页德国研发的环境废水德国研发的环境废水BODBOD分析仪分析仪第七十八页，本课件共有98页医疗方面
36、医疗方面葡萄糖传感器和血糖测定仪葡萄糖传感器和血糖测定仪 用葡萄糖氧化酶（用葡萄糖氧化酶（glucose glucose oxidase,GODoxidase,GOD）制成葡萄糖传感器，）制成葡萄糖传感器，可测定血液中葡萄糖浓度。可测定血液中葡萄糖浓度。第七十九页，本课件共有98页手掌型葡萄糖手掌型葡萄糖(glucose)(glucose)分析仪分析仪第八十页，本课件共有98页SBA-50SBA-50型单电极生物传感分析仪型单电极生物传感分析仪第八十一页，本课件共有98页SBA-70型血糖乳酸自动分析仪型血糖乳酸自动分析仪第八十二页，本课件共有98页n食品鲜度食品鲜度鱼鲜度传感器鱼鲜度传感器
37、在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的在日本、加拿大等国广泛用于鱼类鲜度的测定。鱼死后体内测定。鱼死后体内ATPATP经酶解依次形成经酶解依次形成ADPADP、AMPAMP、IMPIMP、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用、肌苷、次黄嘌呤和尿酸。鲜度可用K K值表示：值表示：K=K=肌苷肌苷+次黄嘌呤次黄嘌呤/ATP+ADP+AMP+IMP+/ATP+ADP+AMP+IMP+肌苷肌苷+次黄嘌呤次黄嘌呤+尿酸尿酸第八十三页，本课件共有98页 大多数鱼死后大多数鱼死后5 520h20h，ATPATP，ADPADP和和AMPAMP已分解尽，超过已分解尽，超过24h24h，鲜度主要取决于，鲜度主要取决于IM
38、P-IMP-肌苷肌苷-次黄嘌呤次黄嘌呤-尿酸。尿酸。将这三个步骤的三种酶（将这三个步骤的三种酶（55核苷酸核苷酸酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定酶、核苷磷酸化酶、黄嘌呤氧化酶）固定在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。在氧电极上，制成鱼鲜度测定仪。l 当当K K2020时，鱼极新鲜，可供生食。时，鱼极新鲜，可供生食。l K K在在20204040之间为新鲜，必须熟食。之间为新鲜，必须熟食。l K K大于大于4040，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检，不新鲜，不宜食用，这与嗅觉检验结果相一致。验结果相一致。第八十四页，本课件共有98页肉鲜度传感器肉鲜度传感器l肉类在腐败过程中会产生各种胺类，故胺肉类在腐
39、败过程中会产生各种胺类，故胺类测定能反映肉类的新鲜程度。类测定能反映肉类的新鲜程度。l用用腐胺氧化酶腐胺氧化酶与与过氧化氢电极过氧化氢电极构成多胺生构成多胺生物传感器，或用物传感器，或用单胺氧化酶膜单胺氧化酶膜和和氧电极氧电极组组成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。成的酶传感器测定肉在贮藏过程中的鲜度。第八十五页，本课件共有98页污染微生物及病原菌的检测污染微生物及病原菌的检测l1通通过过免免疫疫学学方方法法，即即获获得得相相应应的的特特异异性性抗原和抗体进行分析和检测。抗原和抗体进行分析和检测。第八十六页，本课件共有98页第五节第五节 固定化酶反应器固定化酶反应器第八十七页，本课件共有98
40、页连续流搅拌桶式反应器连续流搅拌桶式反应器ContinuousStirredtankreactor,CSTR催化剂采用颗粒状的固催化剂采用颗粒状的固定化酶，少数应用片状定化酶，少数应用片状固定化酶。运转过程中固定化酶。运转过程中要不断分出部分反应液，要不断分出部分反应液，同时补充等量的新鲜底同时补充等量的新鲜底物溶液，为不致使酶随物溶液，为不致使酶随反应液流失，所以在它反应液流失，所以在它的出口处通常有滤膜。的出口处通常有滤膜。第八十八页，本课件共有98页填充床式反应器填充床式反应器 床内用颗粒床内用颗粒状或片状固定状或片状固定化酶填充，运化酶填充，运转时，底物按转时，底物按一定方向以恒一定方
41、向以恒定速度通过反定速度通过反应床。应床。使用最使用最普遍普遍.第八十九页，本课件共有98页连续搅拌桶式超滤反应器连续搅拌桶式超滤反应器CSTR/Ultrfitration reactor,CSTR/UFR由连续流搅拌桶由连续流搅拌桶式反应器和超滤式反应器和超滤装置组合而成，装置组合而成，为小分子量产物与高为小分子量产物与高分子底物的分离、底分子底物的分离、底物较彻底的转化以及物较彻底的转化以及溶液酶或固定化酶的溶液酶或固定化酶的反复使用提供了可能。反复使用提供了可能。但酶易因循环超滤而但酶易因循环超滤而失效损失。失效损失。第九十页，本课件共有98页流流 动动 床床 式反式反 应应 器器Flu
42、idized bed Fluidized bed reactor,FBRreactor,FBR 底物溶液以足够大的底物溶液以足够大的流速向上通过固定化流速向上通过固定化酶床层，使固体颗粒酶床层，使固体颗粒处于流化状态。混合处于流化状态。混合程度高，故传热、传程度高，故传热、传质情况良好。可用于质情况良好。可用于处理粘性强和含有固处理粘性强和含有固体颗粒的底物，或用体颗粒的底物，或用于需要供应气体或排于需要供应气体或排放气体的反应。放气体的反应。第九十一页，本课件共有98页循环流式反应器循环流式反应器Recycle reactor,RCRRecycle reactor,RCR 把部分流出物把部分
43、流出物与加料流混合，与加料流混合，然后再令其进然后再令其进入反应器。特入反应器。特点是可以提高点是可以提高液体的流速和液体的流速和减少底物向固减少底物向固定化酶表面传定化酶表面传递的阻力。递的阻力。第九十二页，本课件共有98页固定化酶反应器的选择依据固定化酶反应器的选择依据 固定化酶的形状固定化酶的形状 底物的物理性质底物的物理性质 酶反应动力学特性酶反应动力学特性 酶的稳定性酶的稳定性 操作要求及反应器费用操作要求及反应器费用第九十三页，本课件共有98页1、固定化酶的形状固定化酶的形状 一般言之，颗粒状或片状固定化酶对一般言之，颗粒状或片状固定化酶对连连续流搅拌桶式反应器续流搅拌桶式反应器和
44、和填充床式反应器填充床式反应器类型的反应器类型的反应器均可适用。但膜状和纤维状的固定化酶则均可适用。但膜状和纤维状的固定化酶则不适于不适于连续流搅拌桶式反应器连续流搅拌桶式反应器。另一方面，如果固定化酶易变形、易另一方面，如果固定化酶易变形、易粘结或颗粒细小时，那么在填充于粘结或颗粒细小时，那么在填充于填充床式填充床式反应器反应器后，往往会引起高的压力降和堵塞后，往往会引起高的压力降和堵塞床层，并且在大规模生产中无法实现高的床层，并且在大规模生产中无法实现高的流率。此时宜采用流动床式反应器。流率。此时宜采用流动床式反应器。第九十四页，本课件共有98页2、底物的物理性质物的物理性质 底物分三种情
45、况：溶解性物质、颗粒底物分三种情况：溶解性物质、颗粒物质与胶状物质。溶解性底物显然对任物质与胶状物质。溶解性底物显然对任何类型反应器均不会造成困难。何类型反应器均不会造成困难。颗粒状和胶状底物则往往会导致床层颗粒状和胶状底物则往往会导致床层堵塞，对此可用循环流式反应器或流动堵塞，对此可用循环流式反应器或流动床式反应器。床式反应器。连续流搅拌桶式反应器连续流搅拌桶式反应器只要搅拌速度足够高，只要搅拌速度足够高，能维持底物和固定化酶良好的悬浮状态，能维持底物和固定化酶良好的悬浮状态，也可用于颗粒状底物。但高的搅拌速度也可用于颗粒状底物。但高的搅拌速度会导致固定化酶从载体上被剪切下来，会导致固定化酶
46、从载体上被剪切下来，所以转速不能太高。所以转速不能太高。第九十五页，本课件共有98页3、酶反应动力学特性酶反应动力学特性 一般而言，填充床式反应器在固定化一般而言，填充床式反应器在固定化酶反应器中占有主导地位，它适合于产酶反应器中占有主导地位，它适合于产物抑制的场合。物抑制的场合。第九十六页，本课件共有98页4、酶的稳定性酶的稳定性 在反应器操作过程中，由于搅拌浆或液流的剪切在反应器操作过程中，由于搅拌浆或液流的剪切作用，常会使固定的酶从载体上脱落下来，或由于作用，常会使固定的酶从载体上脱落下来，或由于磨损，引起粒度的减小而影响固定化酶的操作稳定磨损，引起粒度的减小而影响固定化酶的操作稳定性，
47、其中尤以性，其中尤以连续流搅拌桶式反应器连续流搅拌桶式反应器最为严重。最为严重。为解决这一问题而改进反应器设计，是把为解决这一问题而改进反应器设计，是把酶直接粘接在搅拌轴上，或把固定酶设置在与酶直接粘接在搅拌轴上，或把固定酶设置在与轴相连的金属网篮内。轴相连的金属网篮内。第九十七页，本课件共有98页5 5、操作要求及反应器费用操作要求及反应器费用连续流搅拌桶式反应器连续流搅拌桶式反应器是最便宜的，它结构简单，是最便宜的，它结构简单，且具有良好的操作性，适应性强；而其他类型的且具有良好的操作性，适应性强；而其他类型的反应器，则都需为特定的生产过程专门设计和制反应器，则都需为特定的生产过程专门设计和制造。在讨论反应器价格的同时，还应该考虑固定造。在讨论反应器价格的同时，还应该考虑固定化酶本身的费用，及在各种反应器中的稳定性。化酶本身的费用，及在各种反应器中的稳定性。第九十八页，本课件共有98页