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1、土壤中分离尿素的细菌的分离与计数第1页，本讲稿共31页一、课题背景一、课题背景1 1、尿素的利用、尿素的利用尿素尿素是一种重要的是一种重要的农业氮肥。农业氮肥。尿素尿素不能直接不能直接被农作被农作物物吸收。吸收。土壤中的细菌将尿素土壤中的细菌将尿素分解成氨分解成氨之后才能被之后才能被植物利用。植物利用。2 2、细菌利用尿素的原因、细菌利用尿素的原因土壤中的细菌分解尿素是因为它们土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶能合成脲酶CO(NHCO(NH2 2)脲酶脲酶+H+H2 2O O+CO+CO2 2NHNH3 3第2页，本讲稿共31页3 3、常见的分解尿素的微生物、常见的分解尿素的微生物芽孢杆
2、菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解杆菌、梭状芽孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。尿素。4 4、课题目的、课题目的从土壤中分离出能够分解尿素的细菌从土壤中分离出能够分解尿素的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌一一.研究思路研究思路.筛选菌株筛选菌株.统计菌落数目统计菌落数目.设置对照设置对照第3页，本讲稿共31页 1 1、实例：、实例：启示：启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。到相
3、应的环境中去寻找。原因：原因：因为热泉温度因为热泉温度707080800 0C C，淘汰了绝大多数微，淘汰了绝大多数微生物只有生物只有TaqTaq细菌被筛选出来。细菌被筛选出来。DNADNA多聚酶链式反应多聚酶链式反应是一是一种在体外将种在体外将少量少量DNADNA大量大量复制复制的技术，此项技术要的技术，此项技术要求使用求使用耐高温（耐高温（93930 0C C）的）的DNADNA聚合酶。聚合酶。第4页，本讲稿共31页要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，要分离一种微生物，必须根据该微生物的特点，包包括营养、生理、生长条件等；括营养、生理、生长条件等；方法：方法：抑制大多数微生物不能生长
4、抑制大多数微生物不能生长造成有利于该菌生长的环境，造成有利于该菌生长的环境，结果：结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。板稀释等方法对它进行纯化培养分离。2、实验室中微生物的筛选原理：、实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于人为提供有利于目的菌株目的菌株生长的条件生长的条件(包括营养、包括营养、温度、温度、pH等等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。，同时抑制或阻止其他微生物生长。第5页，本讲稿共31页15.0g15.0g琼脂琼脂1.0g1.0g尿素尿素10.0g10.0g葡萄糖葡萄糖0.2g0.2gMgSOMgSO
5、447H7H2 2O O2.1g2.1gNaHNaH2 2POPO4 41.4g1.4gKHKH2 2POPO4 43 3、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数所需培养基：从物理性质看此培养基属于哪类？从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基固体培养基第6页，本讲稿共31页在此培养基中哪些作为碳源、氮源？在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源：碳源：葡萄糖、尿素葡萄糖、尿素 氮源：氮源：尿素尿素培养基的培养基的氮源为尿素氮源为尿素，只有能合成，只有能合成脲酶脲酶的微生物才能的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏缺乏脲酶的微生
6、物由于脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。的微生物。5 5、培养基选择分解尿素的微生物的原理、培养基选择分解尿素的微生物的原理第7页，本讲稿共31页1 1、显微镜直接计数：、显微镜直接计数：利用利用血球计数板血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。中微生物的数量。.统计菌落数目：统计菌落数目：不能区分死菌与活菌；不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；不适于对运动细菌的计数；需要相
7、对高的细菌浓度；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；个体小的细菌在显微镜下难以观察；缺点缺点第8页，本讲稿共31页2.2.间接计数法（间接计数法（活菌计数法）活菌计数法）原理：原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。即一个菌落代表原先的一个单细胞。常用方法：稀释涂布平板法。常用方法：稀释涂布平板法。每克样品中的菌落数每克样品中的菌落数(CV)M(CV)M其中，其中，C C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落代表某一稀释度
8、下平板上生长的平均菌落数，数，V V代表涂布平板时所用的稀释液的体积代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)(ml)，M M代表稀释倍数。代表稀释倍数。第9页，本讲稿共31页注意事项注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在为了保证结果准确，一般选择菌落数在3030300300的平板上进行计数。的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以
9、三个涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在5050个左右为最好。个左右为最好。第10页，本讲稿共31页计数法计数法直接计数法、直接计数法、平板计数法、平板计数法、比浊法、比浊法、膜过滤法膜过滤法第11页，本讲稿共31页例题：统计菌落数目的方法有例题：统计菌落数目的方法有 （）A.A.B.B.C.C.D.D.D D涂布平板法涂布平板法 重量法重量法 直接计数法直接计数法 比比浊法浊法 生理指标法生理指标法 膜过滤法膜过滤法第12页，本讲稿共31页设置对照的主要目的设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对是
10、排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。实验结果的影响，提高实验结果的可信度。.设置对照：设置对照：实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，实验时，A A同学从对应的同学从对应的10106 6倍稀释的培养基中筛选出倍稀释的培养基中筛选出大约大约150150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约择出大约5050个菌落。分析其原因。个菌落。分析其原因。原原因因：土土样样不不同同，培培养养基基污污染染或或操操作作失失误误(或或者者是是混入了其他的含氮物质混入了其他的含氮
11、物质)第13页，本讲稿共31页小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。服力，对照的设置是必不可少的。方案一：方案一：由其他同学用与由其他同学用与A同学相同土样进行实验同学相同土样进行实验 方案二：方案二：将将A同学配制的培养基在不加土样的情况同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。到污染。结果预测：结果预测：如果结果与如果结果与A同学一致，则证明同学一致，则证明A无误；如无误；如果结果不同，则证明果结果不同，则证明A同学存在操作失误或
12、培养基的配同学存在操作失误或培养基的配制有问题。制有问题。第14页，本讲稿共31页二二.实验的具体操作实验的具体操作 .土壤取样土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。灭菌。.制备培养基：制备培养基：制备以尿素为唯一氮源的制备以尿素为唯一氮源的选择培养基选择培养基。第15页，本讲稿共31页应在火焰旁称取土壤应在火焰旁称取土壤10g10g。在稀释土壤溶液的过程
13、中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行分离不同的微生物采用不同的稀释度分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在目的：保证获得菌落数在3030300300之间、适于计数的之间、适于计数的平板平板 三三 样品的稀释样品的稀释第16页，本讲稿共31页为为什什么么分分离离不不同同的的微微生生物物要要采采用用不不同同的的稀稀释释度度？测测定定土土壤壤中中细细菌菌的的总总量量和和测测定定土土壤壤中中能能分
14、分解解尿尿素素的的细细菌菌的的数数量量，选用的稀释范围相同吗？选用的稀释范围相同吗？原原因因：土土壤壤中中各各类类微微生生物物的的数数量量（单单位位：株株/kg/kg）是是不不同同的的。例例如如在在干干旱旱土土壤壤中中的的上上层层样样本本中中：好好氧氧及及兼兼性性厌厌氧氧细细菌菌数数约约为为2 2 185185万万，放放线线菌菌数数约约为为477477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.123.1万。万。结结论论：为为获获得得不不同同类类型型的的微微生生物物，就就需需要要按按不不同同的的稀稀释释度度进进行行分分离离，同同时时还还应应当当有有针针对对性性地地提提供供选选择择培培养的条件。养的条件。
15、第17页，本讲稿共31页.取样涂布取样涂布实验时要实验时要对培养皿作对培养皿作好标记。注好标记。注明培养基类明培养基类型、培养时型、培养时间、稀释度、间、稀释度、培养物等。培养物等。如果得到了如果得到了2 2个或个或个或个或2 2 2 2个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300303003030030300的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确精确，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。，需要重新实验。第
16、18页，本讲稿共31页.微生物的培养与观察微生物的培养与观察在菌落计数时，每隔在菌落计数时，每隔24h24h统计一次菌落数目。统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。时间不足而导致遗漏菌落的数目。培养不同微生物往往需要不同培养温度。培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：细菌：30303737培养培养1 12d2d放线菌：放线菌：25252828培养培养5 57d7d霉菌：霉菌：25252828的温度下培养的温度下培养3 34d4d。第19页，本讲稿共31页微生物的培养与观察微生物的培养与观察
17、第20页，本讲稿共31页三三.结果分析与评价结果分析与评价1.1.通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落通过对照实验，若培养物有杂菌污染，菌落数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形数偏高；若培养物混入其他氮源，则菌落形态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素态多样，菌落数偏高，难以选择出分解尿素的微生物。的微生物。2.2.提示：选择每个平板上长有提示：选择每个平板上长有3030030300个菌个菌落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。落的稀释倍计算每克样品的菌数最合适。同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相同一稀释倍数的三个重复的菌落数不能相差悬殊，如相差较大，表示实验不精确。差悬殊，如相差较大，表
18、示实验不精确。第21页，本讲稿共31页四、操作提示四、操作提示 无菌操作无菌操作 做好标记做好标记 规划时间规划时间 第22页，本讲稿共31页五五.课外延伸课外延伸 在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果指示剂。培养某种细菌后，如果PHPH升高，指升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器
19、过滤后，将滤膜放到滤器过滤后，将滤膜放到滤器过滤后，将滤膜放到滤器过滤后，将滤膜放到 伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝伊红美蓝 培养基上培养，大肠杆培养基上培养，大肠杆培养基上培养，大肠杆培养基上培养，大肠杆菌菌菌菌菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色菌落呈现黑色，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。，通过记述得出水样中大肠杆菌的数量。第23页，本讲稿共31页大肠杆菌呈大肠杆菌呈 黑色中心黑色中心 ,有或无金属光泽有或无金属光泽大肠杆菌在伊大肠杆菌在伊红美蓝琼脂红美蓝琼脂(EMB)(EMB)上典型特征上典型特征 第24页，本讲稿共31页本课题知识小结本课题知识小结:第25页，本讲稿共31页六、例题解析六
20、、例题解析 例例1 1对细菌群体生长规律测定的正确的表述是对细菌群体生长规律测定的正确的表述是A A在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B B至少接种一种细菌至少接种一种细菌 C C接种一个细菌接种一个细菌 D D及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 解析：细菌群体解析：细菌群体生长规律的测定生长规律的测定是人们在一定条件下进行的。这些是人们在一定条件下进行的。这些条件是：一条件是：一种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总种细菌、恒定容积的培养基，液体培养基、定时测定细菌总数数。在这些条件下，才能测定出细菌的生长规律。测定时只能用一种。在这些条件下，才能测定出细菌的生长
21、规律。测定时只能用一种细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生细菌的子细胞群体的变化规律表达微生物的生长；恒定容积是给微生物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若物提供一定的生存环境；液体培养基才能通过样品推测细菌总数。若接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。接种多种细菌，则会发生种间斗争而不能测定一种微生物的生长规律。在接种时，要保证一定的接种量。在接种时，要保证一定的接种量。答案：答案：A A第26页，本讲稿共31页例例2 2在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争在微生物群体生长规律的测定中，种内斗争最显著最激烈的时期是最显著
22、最激烈的时期是A A调整期调整期 B B对数期对数期 C C稳定期稳定期 D D衰亡期衰亡期解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空解析：种内斗争是一种生态因素。种内斗争反应了种内生物对生存空间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程间和生活资源的争夺。在生活空间充裕，营养充足的时候，种内斗争的程度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越度是比较低的。随着微生物个体数目的增加，每个个体的生存空间越来越少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激少，营养物质也越来越少，每个个体对生存空间和资源的争夺也越来越激烈，
23、种内斗争就越来越激烈。由此可知，在烈，种内斗争就越来越激烈。由此可知，在稳定期稳定期的种内斗争最激烈。在的种内斗争最激烈。在衰亡期，微生物的数目已经开始减少，衰亡期，微生物的数目已经开始减少，pHpH已经极度不适于微生物的生存，已经极度不适于微生物的生存，次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机次级代谢产物积累到很高的程度，这时的微生物的生存斗争主要是与无机环境的斗争。环境的斗争。答案：答案：C C第27页，本讲稿共31页1.1.对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（对细菌群体生长规律测定的正确的表述是（）A.A.在液体培养基上进行在液体培养基上进行 B.B.至少接种一
24、种细菌至少接种一种细菌 C.C.接种一个细菌接种一个细菌 D.D.及时补充消耗的营养物质及时补充消耗的营养物质 2.2.使用选择培养基的目的是（使用选择培养基的目的是（）A.A.培养细菌培养细菌 B.B.培养真菌培养真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是()()A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B.B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖
25、和尿素葡萄糖和尿素实践训练实践训练A A C CD D第28页，本讲稿共31页4.4.下列说法不正确的是（下列说法不正确的是（）A.A.科学家从科学家从70708080度热泉中分离到耐高温的度热泉中分离到耐高温的TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶 B.B.统计某一稀释度的统计某一稀释度的5 5个平板的菌落数依次为个平板的菌落数依次为M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作为该样品菌落数的估计值作为该样品菌落数的估计值 C.C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度实验结果的
26、影响，提高实验结果的可信度 D.D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。最多。5.5.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（）A.A.较多的氮源物质较多的氮源物质 B.B.较多的碳源物质较多的碳源物质 C.C.青霉素类药物青霉素类药物 D.D.高浓度食盐高浓度食盐B BC C第29页，本讲稿共31页例例3 3（20052005年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的年江苏）抗生素作为治疗细菌感染的药物，其高效性和巨大的经济价值使抗生素工业经久不药物，其高效性和巨大的经济价值使
27、抗生素工业经久不衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。衰。其中青霉素的发现和应用具有划时代的意义。青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是青霉素发酵产生青霉素。青霉菌的新陈代谢类型是 ，青霉素是青霉菌的青霉素是青霉菌的 代谢产物。代谢产物。在生产和科研中，常选用处于在生产和科研中，常选用处于 期的青霉菌作为菌期的青霉菌作为菌种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，种或研究材料，因为此时的青霉菌代谢旺盛，和和 比较稳定。比较稳定。对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，对青霉菌菌体生长情况的测定：取一定体积的发酵液，经离心分离、反复洗涤后，经离心分离、反复洗涤后，再计算发酵罐中菌体，再计算发酵罐中菌体的总重量。的总重量。异养需氧型异养需氧型次级次级对数对数个体的形态个体的形态生理特性生理特性称菌体的湿重称菌体的湿重 （称烘干后的重量）（称烘干后的重量）第30页，本讲稿共31页第31页，本讲稿共31页