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1、色谱分析总论第1页，本讲稿共50页色谱分析法概论色谱分析法概论色谱分析法的历史色谱分析法的历史色谱分析法的分类色谱分析法的分类色谱分析法的特点和局限性色谱分析法的特点和局限性色谱图和相关术语色谱图和相关术语现代发展和联用技术现代发展和联用技术243 13 33 5第2页，本讲稿共50页色谱分析法定义色谱分析法定义色谱分析法色谱分析法(chromatography)：以试样组分在两相以试样组分在两相（固定相和流动相）间的溶解、吸附、分配、离子（固定相和流动相）间的溶解、吸附、分配、离子交换或其它亲和作用的差异为依据而建立起来的各交换或其它亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法称色谱分析
2、法。即利用物质的物理种分离分析方法称色谱分析法。即利用物质的物理及物理化学性质的差异，将多组分混合物进行分离及物理化学性质的差异，将多组分混合物进行分离和测定的一种分析方法。色谱分析法是仪器分析常和测定的一种分析方法。色谱分析法是仪器分析常用的方法之一。应用对象：主要是混合物中有机成用的方法之一。应用对象：主要是混合物中有机成分的分离和分析。分的分离和分析。第3页，本讲稿共50页色谱分析法的发展历史色谱分析法的发展历史v色谱法的创始人是俄国植物学家茨色谱法的创始人是俄国植物学家茨维特，维特，(M.S.Tswett)1903年他将年他将植物色素的石油醚浸取液倒入填充植物色素的石油醚浸取液倒入填充
3、有碳酸钙的直立玻璃管中，浸取液有碳酸钙的直立玻璃管中，浸取液中的色素被碳酸钙吸附，通过加入中的色素被碳酸钙吸附，通过加入石油醚冲洗，色素中各组分互相分石油醚冲洗，色素中各组分互相分离离,形成不同颜色的色带。形成不同颜色的色带。v1906，色谱图，色谱图色谱法的由来色谱法的由来第4页，本讲稿共50页石油醚石油醚(流动相流动相)色色谱谱带带叶绿素的石叶绿素的石油醚溶液油醚溶液色谱柱色谱柱碳酸钙碳酸钙(固定相固定相)第5页，本讲稿共50页经典液液色谱经典液液色谱1941，粗粒度填料粗粒度填料流动相：液体流动相：液体动力：重力动力：重力1952固定相：惰性载体有固定相：惰性载体有机液膜机液膜流动相：气
4、体流动相：气体气相色谱法气相色谱法马丁和辛格马丁和辛格固定相和流动相的变化固定相和流动相的变化第6页，本讲稿共50页v1952，Golay，v小口径毛细管小口径毛细管v分辨率和柱效能分辨率和柱效能v理论论述理论论述v1959，Porath and Flodin，v多孔凝胶多孔凝胶v空间排阻色谱法空间排阻色谱法v分子量和分子大小分子量和分子大小固定相材料、分离机制的变化固定相材料、分离机制的变化第7页，本讲稿共50页v1970-v高效液相色谱高效液相色谱(HPLC)v检测模式和性能优越的检测器检测模式和性能优越的检测器v色谱联用色谱联用仪器操作时代仪器操作时代v1975，H.smallv离子色谱
5、离子色谱v阴离子色谱分析阴离子色谱分析第8页，本讲稿共50页v1979，石英毛细管色谱柱，石英毛细管色谱柱v毛细管电泳技术毛细管电泳技术v1981，熔融石英毛细管，熔融石英毛细管v电迁移进样电迁移进样v荧光检测荧光检测v蛋白质分析、糖分析、蛋白质分析、糖分析、DNA测序、手性分离、单细胞分析测序、手性分离、单细胞分析毛细管电泳的快速发展时期毛细管电泳的快速发展时期第9页，本讲稿共50页v1954v中科院大连化学物理研究所中科院大连化学物理研究所v第一张色谱图第一张色谱图我国的色谱发展我国的色谱发展第10页，本讲稿共50页色谱分析法的分类色谱分析法的分类v1、按两相的聚集状态、按两相的聚集状态流
6、动相流动相 固定相固定相 类型类型液相色谱液相色谱LC液体液体 固体固体 液液-固色谱固色谱液体液体 液体液体 液液-液色谱液色谱气体气体 固体固体 气气-固色谱固色谱气体气体 液体液体 气气-液色谱液色谱气相色谱气相色谱GC第11页，本讲稿共50页v吸附色谱：吸附性能的差异吸附色谱：吸附性能的差异气固气固液固液固v分配色谱：分配系数的不同分配色谱：分配系数的不同溶解度溶解度液体液体v离子交换色谱：分离组分与固定相离子进行可逆交换离子交换色谱：分离组分与固定相离子进行可逆交换离子交换树脂离子交换树脂v空间排阻色谱：分子筛空间排阻色谱：分子筛葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶2、按分离的原理分类、按分离的原理
7、分类第12页，本讲稿共50页v柱色谱柱色谱(玻璃、不锈钢、石英玻璃、不锈钢、石英)气固气固液固液固v纸色谱纸色谱液液液液v薄层色谱薄层色谱(硅胶、聚酰胺硅胶、聚酰胺)液固液固3、按固定相的材料和使用方式、按固定相的材料和使用方式v冲洗法、顶替法、迎头法冲洗法、顶替法、迎头法4、按色谱动力学过程分类、按色谱动力学过程分类第13页，本讲稿共50页5、按色谱技术分类、按色谱技术分类v程序升温气相色谱法程序升温气相色谱法沸点范围宽沸点范围宽v反应气相色谱法反应气相色谱法沸点高样品沸点高样品v裂解气相色谱法裂解气相色谱法分子量大，聚合物分子量大，聚合物v顶空气相色谱法顶空气相色谱法分析置于密闭容器中的气
8、固或气液达到平衡分析置于密闭容器中的气固或气液达到平衡v毛细管气相色谱法毛细管气相色谱法总理论踏板数高、高效、快速、高灵敏总理论踏板数高、高效、快速、高灵敏v多维气相色谱法多维气相色谱法v制备色谱法制备色谱法第14页，本讲稿共50页色谱分析法的特点和局限性一、特点、特点1、选择性好、选择性好v固定相固定相v操作温度操作温度沸点相近的混合物沸点相近的混合物同位素同位素同分异构体同分异构体对映异构体对映异构体第15页，本讲稿共50页2、分离效率高，分析速度快、分离效率高，分析速度快气相色谱气相色谱v气体黏度小气体黏度小v色谱柱色谱柱高效液相色谱高效液相色谱v高压泵高压泵v色谱填料色谱填料第16页，
9、本讲稿共50页3、灵敏度高、样品用量少、灵敏度高、样品用量少v检测器热导池检测器，g氢火焰离子化检测器，百万分几-6电子俘获检测器火焰光度检测器，十亿分几-9第17页，本讲稿共50页v气相色谱气相色谱气体气体易挥发的有机物易挥发的有机物沸点高沸点高热裂解热裂解v高效液相色谱高效液相色谱不易挥发、高沸点不易挥发、高沸点不稳定不稳定糖类、大分子化合物糖类、大分子化合物 药物分析药物分析v石油工业、环境保护、临床化学、药物与药剂、农药、食品、卫生防石油工业、环境保护、临床化学、药物与药剂、农药、食品、卫生防疫理化检验、司法检验疫理化检验、司法检验4、应用范围广、应用范围广第18页，本讲稿共50页v给
10、不出定性结果，需要已知的标物质作对比，或将样品的数据与标准物给不出定性结果，需要已知的标物质作对比，或将样品的数据与标准物质的数据进行对比，与质谱、红外等波谱鉴定仪器联用质的数据进行对比，与质谱、红外等波谱鉴定仪器联用v定量时需要标准物质定量时需要标准物质v对个别异构体和固体物质分析能力差对个别异构体和固体物质分析能力差二、局限性二、局限性第19页，本讲稿共50页色谱图和相关术语v1、色谱图、色谱图(chromatogram)：进样后检测仪器记录下来的：进样后检测仪器记录下来的检测器响应信号随时间或载气流出体积分布的曲线图。检测器响应信号随时间或载气流出体积分布的曲线图。第20页，本讲稿共50
11、页2、基线、基线(baseline)：当没有组分进入检测器时，色谱流出曲线：当没有组分进入检测器时，色谱流出曲线是一条只反映仪器噪声随时间变化的曲线。是一条只反映仪器噪声随时间变化的曲线。(正常操作条件下，检测器对流动相的响应信号正常操作条件下，检测器对流动相的响应信号)第21页，本讲稿共50页3、色谱峰、色谱峰(chromatographic peak)样品随流动相经过色谱柱后，分离开的各组分经过检测器时产生样品随流动相经过色谱柱后，分离开的各组分经过检测器时产生的吸收峰，峰状微分曲线。的吸收峰，峰状微分曲线。第22页，本讲稿共50页4、峰面积、峰面积(area)组分流出的曲线与基线所包围的
12、面积。组分流出的曲线与基线所包围的面积。(CGEAFHD)表示：符号表示：符号A第23页，本讲稿共50页v5、峰底、峰底(peak base)v色谱峰下面的基线延长线色谱峰下面的基线延长线v峰起点到终点间的直线峰起点到终点间的直线vCD第24页，本讲稿共50页v6、峰高、峰高色谱峰最高点至峰底的垂直距离色谱峰最高点至峰底的垂直距离AB表示符号表示符号:h第25页，本讲稿共50页v7、峰宽、峰宽(W)：沿色谱峰两侧拐点所作的切线与峰底相交两：沿色谱峰两侧拐点所作的切线与峰底相交两点之间的距离。点之间的距离。IJ。表示符号：。表示符号：v8、半峰宽、半峰宽(Wh/2)：半峰宽：峰高为：半峰宽：峰高
13、为0.5h处的峰宽。处的峰宽。GH。v9、标准偏差、标准偏差()：峰高：峰高0.607h处峰宽处峰宽EF的一半。的一半。v区域宽度区域宽度：色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，：色谱峰的区域宽度是色谱流出曲线的重要参数之一，可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。可用于衡量色谱柱的柱效及反映色谱操作条件下的动力学因素。宽度越窄，其效率越高，分离的效果也越好。宽度越窄，其效率越高，分离的效果也越好。第26页，本讲稿共50页v保留时间保留时间(rentention time,t)：组分从进样到出现峰最大值所需的：组分从进样到出现峰最大值所需的时间时间v死时间死时间(dea
14、d time,t0)：不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值不与固定相作用的物质从进样到出现峰极大值时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，时的时间，它与色谱柱的空隙体积成正比。由于该物质不与固定相作用，因此，其流速与流动相的流速相近。据因此，其流速与流动相的流速相近。据 t0 可求出流动相平均流速可求出流动相平均流速 第27页，本讲稿共50页调整保留时间调整保留时间(adjusted retention time,tr)：某组份的保留时间：某组份的保留时间扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即扣除死时间后的保留时间，它是组份在固定相中的滞留时间。即
15、 由于保留时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间由于保留时间为色谱定性依据。但同一组份的保留时间与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。与流速有关，因此有时需用保留体积来表示保留值。第28页，本讲稿共50页死体积死体积V0：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连：色谱柱管内固定相颗粒间空隙、色谱仪管路和连接头间空隙和检测器间隙的总和。忽略后两项可得到：接头间空隙和检测器间隙的总和。忽略后两项可得到：Fco为柱出口的载气流速为柱出口的载气流速（mL/min)F0-检测器出口流速；检测器出口流速；Tr-室温；室温；Tc-柱温；柱温；p0-大气压；大气压；pw-室温室温时水蒸汽压。时水蒸
16、汽压。第29页，本讲稿共50页保留体积保留体积Vr：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时：指从进样到待测物在柱后出现浓度极大点时所通过的流动相的体积。所通过的流动相的体积。调整保留体积调整保留体积Vr：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。：某组份的保留体积扣除死体积后的体积。以上保留时间和保留体积又统称保留值。以上保留时间和保留体积又统称保留值。第30页，本讲稿共50页色谱曲线的意义色谱曲线的意义色谱峰数色谱峰数=样品中单组份的最少个数；样品中单组份的最少个数；色谱保留值色谱保留值定性依据；定性依据；色谱峰高或面积色谱峰高或面积定量依据；定量依据；色谱保留值或区域宽度色谱保留值或区域宽度色谱
17、柱分离效能评价指标；色谱柱分离效能评价指标；色谱峰间距色谱峰间距固定相或流动相选择是否合适的依据。固定相或流动相选择是否合适的依据。第31页，本讲稿共50页色谱现代发展及相关联用技术1、理论发展、理论发展vTsweet的经典色谱的经典色谱 气相色谱不断完善气相色谱不断完善v色谱热力学和动力学色谱热力学和动力学 色谱分离的最佳途径色谱分离的最佳途径热力学：色谱峰间的距离。热力学：色谱峰间的距离。v研究内容：组分保留值与热力学参数以及组分结构之间的构效关系的规律，研究内容：组分保留值与热力学参数以及组分结构之间的构效关系的规律，主要用于定性。主要用于定性。动力学：色谱峰宽窄动力学：色谱峰宽窄v研究
18、内容：色谱流出曲线的形状、谱带展宽等的影响因素。研究内容：色谱流出曲线的形状、谱带展宽等的影响因素。v平衡理论、塔板理论、纵向扩散理论、速率理论平衡理论、塔板理论、纵向扩散理论、速率理论v块状液膜模型、分子顶替模型、定标粒子理论模型及最新的各种保留值块状液膜模型、分子顶替模型、定标粒子理论模型及最新的各种保留值预测理论预测理论第32页，本讲稿共50页、技术发展、技术发展1)超临界流体色谱超临界流体色谱v超临界流体：物质处于临界温度和临界压力以上，既不是液体也超临界流体：物质处于临界温度和临界压力以上，既不是液体也不是通常的气体，而是单一相态的流体。不是通常的气体，而是单一相态的流体。v使用超临
19、界流体作流动相的色谱法称为使用超临界流体作流动相的色谱法称为supercritical fluid chromatography,SFCv特点：具有气体的低黏度和高扩散系数，又具有液体的强溶解特点：具有气体的低黏度和高扩散系数，又具有液体的强溶解能力，参与溶质的分配作用，同时具有气相色谱和液相色谱的能力，参与溶质的分配作用，同时具有气相色谱和液相色谱的优点。优点。v变更压力、温度等参数可以改变超临界流体的密度，即改变它的变更压力、温度等参数可以改变超临界流体的密度，即改变它的溶解能力、黏度和扩散系数，改变分离效能。溶解能力、黏度和扩散系数，改变分离效能。v应用范围：难挥发、易热解、易氧化等特性
20、的高分子和天然产物应用范围：难挥发、易热解、易氧化等特性的高分子和天然产物的分离和制备。的分离和制备。第33页，本讲稿共50页v2)微型色谱微型色谱v常规仪器，部件按比例缩小，常规仪器，部件按比例缩小，仪器的小型化，仪器的小型化，便携式的色谱仪便携式的色谱仪v色谱原理和仪器与微制造技术结合色谱原理和仪器与微制造技术结合部件和连接系统等环节进行重新设计部件和连接系统等环节进行重新设计不仅是尺寸的缩小，而是技术革新不仅是尺寸的缩小，而是技术革新第34页，本讲稿共50页3)、高速气相色谱、高速气相色谱v分析速度更快分析速度更快微填充柱微填充柱电子程序压力流量控制系统电子程序压力流量控制系统耐高压的仪
21、器气路系统耐高压的仪器气路系统分析速度提高分析速度提高5-10倍，分辨率提高倍，分辨率提高3-5倍。倍。第35页，本讲稿共50页4)高温气相色谱高温气相色谱v难挥发的化合物难挥发的化合物(高沸点的脂肪烃高沸点的脂肪烃)v温度超过温度超过300v色谱柱：色谱柱：聚酰亚胺，聚酰亚胺，330330聚硅氧烷聚硅氧烷镀铝层镀铝层不锈钢内衬石英，过渡层不锈钢内衬石英，过渡层第36页，本讲稿共50页5)多维色谱多维色谱v多个色谱柱串联多个色谱柱串联v色谱柱间的固定相不同色谱柱间的固定相不同vGC-GC，LC-LC，GC-GC6)快速扫描色质联用快速扫描色质联用v峰宽小峰宽小v5/s第37页，本讲稿共50页v
22、7)毛细管电动色谱毛细管电动色谱(capillary electrochromatography,CEC)vHPLC的固定相填充毛细管内或键合、交联在毛细管的内表的固定相填充毛细管内或键合、交联在毛细管的内表面面v动力：电渗流动力：电渗流v分离原理分离原理电场中的迁移速度电场中的迁移速度两相间的分配系数两相间的分配系数第38页，本讲稿共50页8)保留时间锁定保留时间锁定v保留时间重现性保留时间重现性v特定化合物在不同仪器、不同色谱柱之间保持不变特定化合物在不同仪器、不同色谱柱之间保持不变v原理原理组分性质、固定液、仪器操作条件组分性质、固定液、仪器操作条件一定范围内色谱操作条件对保留时间的影响
23、规律一定范围内色谱操作条件对保留时间的影响规律仪器操作条件：载气压力、流速、柱温仪器操作条件：载气压力、流速、柱温第39页，本讲稿共50页v9)生物芯片生物芯片v10)液相色谱微柱液相色谱微柱v11)GC-MS-MSv12)LC-MS-MSv13)集束式毛细管集束式毛细管多根毛细管色谱柱并联多根毛细管色谱柱并联v14)Merck整体硅胶棒柱、整体硅胶棒柱、v大孔和中孔大孔和中孔v大孔：直通，渗透性大孔：直通，渗透性v中孔中孔:表面积表面积第40页，本讲稿共50页Thank you第41页，本讲稿共50页第42页，本讲稿共50页第43页，本讲稿共50页第44页，本讲稿共50页第45页，本讲稿共50页第46页，本讲稿共50页第47页，本讲稿共50页第48页，本讲稿共50页第49页，本讲稿共50页第50页，本讲稿共50页