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1、常用实验基本技术细胞培养第1页,本讲稿共25页四大常用基本技术逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)免疫组织化学技术(免疫组化)免疫印迹技术(Western blot)细胞培养技术局限性 联合应用第2页,本讲稿共25页细胞培养技术细胞培养(Cell culture)是指从生物体内取出组织或细胞,在体外适当的条件下,使之存活、生长和繁殖,并维持其结构和功能的方法。细胞培养便于应用各种方法和技术进行研究,并可直接观察,已成为现代生物医学研究中一项非常重要的技术。第3页,本讲稿共25页培养细胞的生存条件无菌环境(器皿、超净台)超纯水温度(37左右左右)气体(5%CO2/空气)PH值(7.0-7.4,细
2、胞耐酸不耐碱)营养条件(基础培养基+10%FBS)渗透压、培养基质等第4页,本讲稿共25页细胞培养用液平衡盐溶液:洗涤组织、细胞 D-Hanks液、PBS液等。消化液:分散细胞 0.25%胰酶、0.02%EDTA液或二者混合使用培养液:细胞生存、生长和繁殖 基础培养基(DMEM、RPMI1640等),已商品化 10%左右的胎牛血清(FBS)第5页,本讲稿共25页培养细胞的来源直接取材:实验动物、胚胎、临床标本等细胞系:各实验室保存 细胞库:上海中科院细胞库、武汉细胞库、中国医科院细胞中心第6页,本讲稿共25页培养方式原代培养:直接从生物体内获取组织细胞进行的首次培养。只能原代培养:神经元、心肌
3、细胞等。传代培养:当培养细胞增殖到一定密度后,生长受到抑制,需要分散稀释后重新培养。常见:肿瘤细胞系第7页,本讲稿共25页培养细胞的处理改变细胞外部因素改变细胞内部因素第8页,本讲稿共25页外部因素药物高温低氧射线第9页,本讲稿共25页内部因素改变细胞内基因表达水平:上调:基因转染 下调:RNAi第10页,本讲稿共25页细胞转染转染(transfection)是指将外源性DNA或 RNA导入细胞的过程。上调目的基因表达:质粒载体 病毒载体下调目的基因表达:化学合成siRNA 质粒载体 病毒载体第11页,本讲稿共25页转染方法电转法脂质体介导的转染法病毒载体介导的转染法第12页,本讲稿共25页转
4、染试剂脂质体与非脂质体:商品化,多家公司如Invitrogen、Fermentas、Qiagen等都有售。常用:Invitrogen公司Lipofectamine 2000 可用来转染质粒和siRNA.其他专用试剂:如Invitrogen公司RNAiMAX Transfection Reagent 专门用来转染siRNA.第13页,本讲稿共25页瞬时转染与稳定转染瞬时转染:将DNA导入活细胞内,但DNA不会嵌入细胞的染色体中,可在2-3天内收集被转染的细胞进行基因表达分析。稳定转染:将目的基因导入活细胞,根据选择标记经过一段时间的筛选,使目的基因整合入细胞染色体中,从而得到稳定表达目的基因的细
5、胞系。第14页,本讲稿共25页真核筛选标记第15页,本讲稿共25页设立对照组空载体对照:如PCDNA3、PEGFP-N1等。Scrambled siRNA:将选中的siRNA序列打乱。作为阴性对照的scrambled siRNA应该与选中的siRNA序列有相同的核苷酸组成,并且与目的基因的mRNA没有明显的同源性。第16页,本讲稿共25页细胞特性检测活力:MTT实验凋亡:TUNEL染色、流式细胞术等增殖:BrdU掺入法、克隆形成实验分化:形态学观察、分化标志物检测致瘤性:体内成瘤实验第17页,本讲稿共25页靶基因表达水平检测RT-PCRWestern blot免疫组化其他:基因芯片、流式细胞术
6、等第18页,本讲稿共25页细胞培养的应用用途:1.验证体内实验结果 2.进行深入机制研究优点:可同时获得大量生物学性质相似的细胞作为研究对象,便于施加各种干预因素,方便观察与检测。局限性:不能准确反应体内的真实状况,需与体内实验相互验证。第19页,本讲稿共25页神经干细胞分离培养取取E12.5d小鼠胚胎端脑,制成单细胞悬液,接种于神经小鼠胚胎端脑,制成单细胞悬液,接种于神经干细胞培养基,体外培养干细胞培养基,体外培养2天,可见神经球形成。天,可见神经球形成。第20页,本讲稿共25页NSC鉴定体外培养神经干细胞体外培养神经干细胞BrdU(+),Nestin(+),并能分化为,并能分化为MAP2(
7、+)神经元和神经元和GFAP(+)星形胶质细胞。星形胶质细胞。第21页,本讲稿共25页出生后7天小鼠脑切片,可见G-CSFR与Nestin共表达。SVZ:室管膜下区;LV:侧脑室体外培养神经干细胞,免疫染色结果显示:Nestin(神经干细胞marker)与G-CSFR共表达于神经干细胞。RT-PCR结果也显示神经干细胞表达G-CSFR。第22页,本讲稿共25页体外培养神经干细胞,免疫染色结果显示:与对照组相比,G-CSF作用组BrdU阳性细胞比例明显增高。第23页,本讲稿共25页小鼠脑切片,免疫染色结果显示,与对照组(CT)及缺血缺氧性模型组(HI)相比,G-CSF处理组(HI+G-CSF)室管膜下区(SVZ)BrdU阳性细胞数明显增加。第24页,本讲稿共25页谢谢!第25页,本讲稿共25页