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1、分子生物学实验第1页，本讲稿共14页 基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA的提取通常用于构建基因组文库、的提取通常用于构建基因组文库、的提取通常用于构建基因组文库、的提取通常用于构建基因组文库、SouthernSouthernSouthernSouthern杂交杂交杂交杂交(包包包包括括括括RFLP)RFLP)RFLP)RFLP)及及及及PCRPCRPCRPCR分离基因等。分离基因等。分离基因等。分离基因等。利用基因组利用基因组利用基因组利用基因组DNADNADNADNA较长的特性较长的特性较长的特性较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子可以将其与细胞器或质粒等小分子可以将其与
2、细胞器或质粒等小分子可以将其与细胞器或质粒等小分子DNADNADNADNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNADNADNADNA即沉即沉即沉即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中淀形成纤维状絮团飘浮其中淀形成纤维状絮团飘浮其中淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出，而小分子可用玻棒将其取出，而小分子可用玻棒将其取出，而小分子可用玻棒将其取出，而小分子DNADNADNADNA则则则则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部只形成颗
3、粒状沉淀附于壁上及底部只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。从而达到提取的目的。从而达到提取的目的。从而达到提取的目的。在提取过程中在提取过程中在提取过程中在提取过程中,染色体会发生机械断裂染色体会发生机械断裂染色体会发生机械断裂染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段产生大小不同的片段产生大小不同的片段产生大小不同的片段,因因因因此分离基因组此分离基因组此分离基因组此分离基因组DNADNADNADNA时应尽量在温和的条件下操作时应尽量在温和的条件下操作时应尽量在温和的条件下操作时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚如尽量减少酚如尽量减少酚如尽量减少酚/氯仿氯仿氯仿氯仿抽提、混
4、匀过程要轻缓抽提、混匀过程要轻缓抽提、混匀过程要轻缓抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的以保证得到较长的以保证得到较长的以保证得到较长的DNADNADNADNA。一般来说。一般来说。一般来说。一般来说,构建构建构建构建基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库,初始初始初始初始DNADNADNADNA长度必须在长度必须在长度必须在长度必须在100kb100kb100kb100kb以上以上以上以上,否则酶切后两边都带合否则酶切后两边都带合否则酶切后两边都带合否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行适末端的有效片段很少。而进行适末端的有效片段很少。而进行适末端的有效片段很少。而进行RFLP
5、RFLPRFLPRFLP和和和和PCRPCRPCRPCR分析分析分析分析,DNA,DNA,DNA,DNA长度可短至长度可短至长度可短至长度可短至50kb,50kb,50kb,50kb,在该长度以上在该长度以上在该长度以上在该长度以上,可保证酶切后产生可保证酶切后产生可保证酶切后产生可保证酶切后产生RFLPRFLPRFLPRFLP片段片段片段片段(20kb(20kb(20kb(20kb以下以下以下以下),),),),并并并并可保证包含可保证包含可保证包含可保证包含PCRPCRPCRPCR所扩增的片段所扩增的片段所扩增的片段所扩增的片段(一般一般一般一般2kb2kb2kb2kb以下以下以下以下)。
6、第2页，本讲稿共14页不同生物（植物、动物、微生物）的基因组不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNADNA的提取方法有所的提取方法有所不同不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNADNA时必须参照文献和经验时必须参照文献和经验建立相应的提取方法建立相应的提取方法,以获得可用的以获得可用的DNADNA大分子。尤其是组织中大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCRPCR反应等有较强的抑制作用
7、反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组因此用富含这类物质的材料提取基因组DNADNA时时,应考虑除去多糖和酚类应考虑除去多糖和酚类物质。物质。本实验以动物肝脏为材料本实验以动物肝脏为材料,学习基因组学习基因组DNADNA提取的一般方法。提取的一般方法。第3页，本讲稿共14页提纯的思路提纯的思路提纯的思路提纯的思路1.1.1.1.基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA的特性：分子量较大、易断（如何保证的特性：分子量较大、易断（如何保证的特性：分子量较大、易断（如何保证的特性：分子量较大、易断（如何保证DNADNADNADNA分子的分子的分子的分子的完整性？）完整性？
8、）完整性？）完整性？）2.2.2.2.组织和细胞的破碎组织和细胞的破碎组织和细胞的破碎组织和细胞的破碎3.3.3.3.要去除的物质：要去除的物质：要去除的物质：要去除的物质：蛋白、多糖、脂类、蛋白、多糖、脂类、蛋白、多糖、脂类、蛋白、多糖、脂类、RNARNARNARNA和小分子物质和小分子物质和小分子物质和小分子物质 第4页，本讲稿共14页一、材料一、材料 哺乳动物新鲜组织。哺乳动物新鲜组织。二、设备二、设备 移液管移液管高速冷冻离心机高速冷冻离心机台式离心机台式离心机水浴锅。水浴锅。第5页，本讲稿共14页三、试剂：三、试剂：1.1.组织匀浆液组织匀浆液 200 mL 200 mL 灭菌备用灭
9、菌备用 10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 25mmol/L EDTA 25mmol/L EDTA 100mmol/L NaCl 100mmol/L NaCl2.2.酶解液酶解液 100 mL 100 mL（灭菌后再加蛋白酶（灭菌后再加蛋白酶K K和和SDS)SDS)20mmol/L Tris-HCl pH 8.0 20mmol/L Tris-HCl pH 8.0 50mmol/L EDTA 50mmol/L EDTA 200mmol/L NaCl 200mmol/L NaCl 200ug/mL 200ug/mL蛋白酶蛋白酶K K
10、 1 1SDS SDS 第6页，本讲稿共14页3.3.生理盐水生理盐水(0.7%)1000 mL (0.7%)1000 mL 灭菌备用灭菌备用4.3mol/L NaAc pH5.2 100 mL 4.3mol/L NaAc pH5.2 100 mL 灭菌备用灭菌备用 先用先用50mL50mL水溶解固体水溶解固体NaAc NaAc 再用再用3mol/L3mol/L乙酸调乙酸调pHpH至至5.25.2，最后定容，最后定容同时灭菌备用：同时灭菌备用：枪头：枪头：1mL 1mL、200uL 200uL 各一盒各一盒小指管小指管:2.0:2.0、0.5mL0.5mL各各2020个个研磨棒研磨棒:20:2
11、0支支无菌水：无菌水：250ml X 2250ml X 2瓶瓶第7页，本讲稿共14页四、实验步骤四、实验步骤 基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA的提取：的提取：的提取：的提取：0.2g0.2g0.2g0.2g鼠肝，冰冷生理盐水洗鼠肝，冰冷生理盐水洗鼠肝，冰冷生理盐水洗鼠肝，冰冷生理盐水洗3 3 3 3次，剪碎次，剪碎次，剪碎次，剪碎加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入加入液氮，研磨碎鼠肝成粉末，加入2mL2mL2mL2mL匀浆液混匀匀浆液混匀匀浆液混匀匀浆液混匀匀浆液转入匀浆液转入匀浆液转入匀浆液转入2mL2mL2mL2
12、mL小指管，小指管，小指管，小指管，4 4 4 40 0 0 0C,5000rpmC,5000rpmC,5000rpmC,5000rpm离心离心离心离心2min,2min,2min,2min,沉淀加沉淀加沉淀加沉淀加0.4mL0.4mL0.4mL0.4mL无菌水，无菌水，无菌水，无菌水，吹散吹散吹散吹散，再，再，再，再加加加加0.4mL0.4mL0.4mL0.4mL酶解液，酶解液，酶解液，酶解液，慢慢颠倒慢慢颠倒慢慢颠倒慢慢颠倒混匀混匀混匀混匀555555550 0 0 0C C C C 水浴酶解过夜或水浴酶解过夜或水浴酶解过夜或水浴酶解过夜或2 2 2 2小时以上，小时以上，小时以上，小时以
13、上，4 4 4 40 0 0 0C C C C存放存放存放存放第8页，本讲稿共14页（加（加（加（加RNase,RNase,RNase,RNase,终浓度终浓度终浓度终浓度200ug/mL200ug/mL200ug/mL200ug/mL，373737370 0 0 0C C C C保温保温保温保温60min60min60min60min）加等体积酚加等体积酚加等体积酚加等体积酚/氯仿氯仿氯仿氯仿/异戊醇，异戊醇，异戊醇，异戊醇，慢慢颠倒慢慢颠倒慢慢颠倒慢慢颠倒混匀，冰上混匀，冰上混匀，冰上混匀，冰上平倒静置平倒静置平倒静置平倒静置10-20min10-20min10-20min10-20min
14、4 4 4 40 0 0 0C C C C，10000rpm10000rpm10000rpm10000rpm离心离心离心离心10min10min10min10min，用扩口枪头取出上清，用扩口枪头取出上清，用扩口枪头取出上清，用扩口枪头取出上清上清加等体积氯仿上清加等体积氯仿上清加等体积氯仿上清加等体积氯仿/异戊醇，异戊醇，异戊醇，异戊醇，慢慢颠倒慢慢颠倒慢慢颠倒慢慢颠倒混匀混匀混匀混匀4 4 4 40 0 0 0C,10000rpmC,10000rpmC,10000rpmC,10000rpm，用扩口枪头取上清，用扩口枪头取上清，用扩口枪头取上清，用扩口枪头取上清第9页，本讲稿共14页上清加上
15、清加1/101/10体积的体积的NaAcNaAc和加和加2 2倍体积的无水乙醇倍体积的无水乙醇慢慢混匀沉淀慢慢混匀沉淀DNADNA，-20200 0C C静置静置30min30min，DNADNA沉淀形成白色絮状物。沉淀形成白色絮状物。12000rpm12000rpm离心离心15min15min，弃上清，弃上清沉淀用沉淀用1mL 75%1mL 75%冷乙醇洗两次，每次冷乙醇洗两次，每次12000rpm12000rpm离心离心10min10min，弃上清，弃上清超净台中干燥加超净台中干燥加 50uL TE,450uL TE,40 0C C溶解过夜，溶解过夜，-20-200 0C C保存保存第10
16、页，本讲稿共14页基因组基因组DNADNA的检测的检测 前述方法得到的前述方法得到的前述方法得到的前述方法得到的DNADNADNADNA一般可以用作一般可以用作一般可以用作一般可以用作Southern,RFLPSouthern,RFLPSouthern,RFLPSouthern,RFLP、PCRPCRPCRPCR等等等等分析。由于所用材料的不同分析。由于所用材料的不同分析。由于所用材料的不同分析。由于所用材料的不同,得到的得到的得到的得到的DNADNADNADNA产量及质量均不同产量及质量均不同产量及质量均不同产量及质量均不同,有有有有时时时时DNADNADNADNA中含有酚类和多糖类物质中含
17、有酚类和多糖类物质中含有酚类和多糖类物质中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和会影响酶切和会影响酶切和会影响酶切和PCRPCRPCRPCR的效果。的效果。的效果。的效果。所以获得基因组所以获得基因组所以获得基因组所以获得基因组DNADNADNADNA后后后后,均需检测均需检测均需检测均需检测DNADNADNADNA的产量和质量。的产量和质量。的产量和质量。的产量和质量。1.DNA1.DNA1.DNA1.DNA溶液稀释溶液稀释溶液稀释溶液稀释20-3020-3020-3020-30倍后倍后倍后倍后,测定测定测定测定OD260/OD280 OD260/OD280 OD260/OD280 OD260/
18、OD280 比值比值比值比值,明确明确明确明确DNADNADNADNA的含量和质量。的含量和质量。的含量和质量。的含量和质量。()2.2.2.2.取取取取2-5l 2-5l 2-5l 2-5l 在在在在0.7%agarose0.7%agarose0.7%agarose0.7%agarose胶上胶上胶上胶上80V80V80V80V电泳电泳电泳电泳,检测检测检测检测DNADNADNADNA的分子的分子的分子的分子大小。大小。大小。大小。()3.3.3.3.取取取取2g DNA,2g DNA,2g DNA,2g DNA,用用用用10101010单位单位单位单位(U)Hind(U)Hind(U)Hin
19、d(U)Hind酶切过夜酶切过夜酶切过夜酶切过夜,0.7%,0.7%,0.7%,0.7%agaroseagaroseagaroseagarose胶上电泳胶上电泳胶上电泳胶上电泳,检测能否完全酶解检测能否完全酶解检测能否完全酶解检测能否完全酶解(做做做做RFLP,DNARFLP,DNARFLP,DNARFLP,DNA必须完全必须完全必须完全必须完全酶解酶解酶解酶解)。第11页，本讲稿共14页 如果如果如果如果DNADNADNADNA中所含杂质多中所含杂质多中所含杂质多中所含杂质多,不能完全酶切不能完全酶切不能完全酶切不能完全酶切,或小分或小分或小分或小分子子子子DNADNADNADNA多多多多,
20、影响接续的分析和操作影响接续的分析和操作影响接续的分析和操作影响接续的分析和操作,可以用下列方法处可以用下列方法处可以用下列方法处可以用下列方法处理：理：理：理：（1 1 1 1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。（2 2 2 2）酚）酚）酚）酚:氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提氯仿抽提,去除蛋白质和多糖。去除蛋白质和多糖。去除蛋白质和多糖。去除蛋白质和多糖。（3 3 3 3）SepharoseSepharoseSepharoseSepharose柱过滤柱过滤柱过滤柱过滤,去除酚
21、类、多糖和小分子去除酚类、多糖和小分子去除酚类、多糖和小分子去除酚类、多糖和小分子DNADNADNADNA。（4 4 4 4）CsClCsClCsClCsCl梯度离心梯度离心梯度离心梯度离心,去除杂质去除杂质去除杂质去除杂质,分离大片段分离大片段分离大片段分离大片段DNA(DNA(DNA(DNA(可用可用可用可用作文库构建作文库构建作文库构建作文库构建)。第12页，本讲稿共14页可能的结果：可能的结果：由于基因组由于基因组DNADNA比较难溶、且容易被降解，电泳时经常会出现比较难溶、且容易被降解，电泳时经常会出现弥散的或不均一的条带（如左图）。所以实验时一定要注意机弥散的或不均一的条带（如左图）。所以实验时一定要注意机械力对大分子械力对大分子DNADNA的破坏作用，如避免振荡、使用扩口枪头的破坏作用，如避免振荡、使用扩口枪头等。另外要适当的延长溶解时间。等。另外要适当的延长溶解时间。第13页，本讲稿共14页n n实验的常见问题、关键问题及难点：实验的常见问题、关键问题及难点：基因组基因组DNADNA的断裂、的断裂、蛋白和色素去除不干净蛋白和色素去除不干净 基因组基因组DNADNA难溶、电泳时凝胶易碎难溶、电泳时凝胶易碎第14页，本讲稿共14页