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1、第四章高效液相色谱第四章高效液相色谱分析法分析法本讲稿第一页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪美国安捷伦公司美国安捷伦公司Agilent1200 本讲稿第二页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪美国戴安公司美国戴安公司UltiMate3000本讲稿第三页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪一、一、高效液相色谱仪结构流程高效液相色谱仪结构流程 二、二、高压输液系统高压输液系统三、三、梯度淋洗装置梯度淋洗装置六、六、液相色谱检测器液相色谱检测器五、五、分离系统分离系统四、四、进样系统进样系统本讲稿第四页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪
2、高效液相色谱仪储液瓶储液瓶高压泵高压泵进样器进样器色谱柱色谱柱检测器检测器废液废液一、一、高效液相色谱仪结构流程高效液相色谱仪结构流程 高压输液泵、高效分离住、高灵敏度检测器高压输液泵、高效分离住、高灵敏度检测器本讲稿第五页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪二、二、高压输液系统（高压泵）高压输液系统（高压泵）要求：要求：输出压力高；输出压力高；平稳、脉冲小；平稳、脉冲小；流量稳定可调；流量稳定可调；耐腐蚀。耐腐蚀。机械往复柱塞泵结构图机械往复柱塞泵结构图本讲稿第六页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪三、三、梯度淋洗装置梯度淋洗装置在在液液相相色色谱谱中中
3、,可可以以通通过过改改变变流流动动相相的的组组成成、极极性来改善分离和调节出峰时间。性来改善分离和调节出峰时间。本讲稿第七页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定比例送入混合器，混合后进入色谱柱。例送入混合器，混合后进入色谱柱。一台高压泵一台高压泵,通过比例调节阀通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入混合器中混合。剂按一定的比例抽入混合器中混合。高压梯度高压梯度(外梯度外梯度)低压梯度低压梯度(内梯度内梯度)本讲稿第八页，共五十四页第一节第一节 高效
4、液相色谱仪高效液相色谱仪通通过过改改变变流流动动相相的的组组成成来来调调整整组组分分的的k值值，改改变变分分离离因因子子值值，以以达达到到最最短短时时间间内内得得到最佳分离的目的。到最佳分离的目的。梯度洗脱梯度洗脱梯度洗脱的梯度洗脱的特点特点改善分离改善分离,加快分析速度；加快分析速度；改善峰形改善峰形,减少拖尾减少拖尾;可能引起可能引起基线漂移。基线漂移。本讲稿第九页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪四、四、进样系统进样系统六通阀进样六通阀进样装置装置本讲稿第十页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪内径：内径：16mm，柱长：柱长：550cm；柱填料粒径
5、：柱填料粒径：510m为保护色谱柱，为保护色谱柱，通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。五、五、分离系统（色谱柱）分离系统（色谱柱）本讲稿第十一页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪六、六、液相色谱检测器液相色谱检测器类类型型紫外检测器紫外检测器示差折光检测器示差折光检测器荧光检测器荧光检测器电化学检测器电化学检测器电导检测器电导检测器本讲稿第十二页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪（一）、紫外检测器（一）、紫外检测器应用最广泛的检测器应用最广泛的检测器基基本本原原理理：试试样样组组分分对对特特定定波波长长的的
6、紫紫外外光光具具有有选选择择性性的的吸吸收收，吸吸光光度度与与试试样样组组分分浓浓度度之之间间的的定定量量关关系系符符合合郎伯郎伯-比耳定律。比耳定律。优点：优点：灵敏度高，线形范围宽；灵敏度高，线形范围宽；死体积小；死体积小；波长可选；波长可选；对流速和温度变化不对流速和温度变化不敏感；敏感；可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。缺点：缺点：无紫外无紫外-可见吸收组分不响应；可见吸收组分不响应；流动相选择受一定限制。流动相选择受一定限制。本讲稿第十三页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪一些常用溶剂的紫外截止波长一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂溶剂二硫二硫化碳化碳氯仿氯仿四氢四氢呋
7、喃呋喃苯苯乙睛乙睛甲醇甲醇水水紫外截止紫外截止波长波长/nm380245212210190205187本讲稿第十四页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪(a)可变波长紫外检测器可变波长紫外检测器(b)二极管阵列检测器二极管阵列检测器本讲稿第十五页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪两种检测器的色谱图两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器二极管阵列检测器峰纯度峰纯度检验检验本讲稿第十六页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪（二）、示差折光检测器（二）、示差折光检测器通用型检测器通用型检测器基
8、本原理：基本原理：连续检测参比池和样品池中流动相之间的连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光系数差值，该值与试样池流动相中的组分浓度折光系数差值，该值与试样池流动相中的组分浓度成正比。成正比。每种物质具有不同的折光指数每种物质具有不同的折光指数。生命科学中各类糖类化合物，没有紫外吸收，一般要生命科学中各类糖类化合物，没有紫外吸收，一般要用示差折光检测器。用示差折光检测器。本讲稿第十七页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 缺点：缺点：灵敏度低；灵敏度低；对温度敏感；对温度敏感；不能用于梯度洗脱。不能用于梯度洗脱。本讲稿第十八页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相
9、色谱仪（三）、荧光检测器（三）、荧光检测器专用型检测器专用型检测器 基基本本原原理理：在在一一定定的的条条件件下下，荧荧光光强强度度与与流流动动相相中中的组分的浓度成之比。的组分的浓度成之比。对对多多环环芳芳烃烃，维维生生素素B、黄黄曲曲霉霉素素、卟卟啉啉类类化化合合物物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。本讲稿第十九页，共五十四页第一节第一节 高效液相色谱仪高效液相色谱仪 特点：特点：高灵敏度；高灵敏度；高选择性；高选择性；可用于梯度洗脱。可用于梯度洗脱。本讲稿第二十页，共五十四页第二节第二节 主要分离类型主要分离类型一、液一、液-固吸附色谱固吸
10、附色谱二、液二、液-液分配与化学键合相色谱液分配与化学键合相色谱三、离子交换色谱三、离子交换色谱四、离子对色谱四、离子对色谱五、空间排阻色谱五、空间排阻色谱六、亲和色谱六、亲和色谱本讲稿第二十一页，共五十四页第二节第二节 主要分离类型主要分离类型一、液一、液-固吸附色谱固吸附色谱 流动相流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。各种不同极性的一元或多元溶剂。固定相固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等。固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等。颗粒度较小，颗粒度较小，5-10m分分离离机机理理：流流动动相相中中的的溶溶质质分分子子(X)与与溶溶剂剂分分子子(S)在在固体吸附剂上竞争吸附的结果。固体吸附剂上竞争吸
11、附的结果。本讲稿第二十二页，共五十四页第二节第二节 主要分离类型主要分离类型 下下标标M、s分分别别代代表表流流动动相相和和固固定定相相，n代代表表被被吸吸附附的的溶溶剂剂分分子子数；数；K代表吸附平衡常数。代表吸附平衡常数。吸附平衡常数吸附平衡常数K不等于分配系数。不等于分配系数。K值越大，保留时间越长，分配系数大。值越大，保留时间越长，分配系数大。适适用用对对象象：相相对对分分子子质质量量中中等等的的油油溶溶性性试试样样，对对具具有有官能团的化合物和异构体有较高选择性。官能团的化合物和异构体有较高选择性。本讲稿第二十三页，共五十四页第二节第二节 主要分离类型主要分离类型二、液二、液-液分配
12、与化学键合相色谱液分配与化学键合相色谱（一）、液（一）、液-液分配色谱液分配色谱固定相与流动相均为液体（互不相溶）。固定相与流动相均为液体（互不相溶）。基本原理基本原理：组分在固定相和流动相上的分配。：组分在固定相和流动相上的分配。与气相色谱与气相色谱中气中气-液色液色谱比较？谱比较？改变流动相的组成来改变流动相的组成来 改善分离效果。改善分离效果。K不仅与固定相的种类不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种有关，也与流动相的种类有关。类有关。本讲稿第二十四页，共五十四页第二节第二节 主要分离类型主要分离类型固定相极性固定相极性流动相极性流动相极性正相分配色谱正相分配色谱（正相柱）（正相柱）组分
13、极性越大，保留时组分极性越大，保留时间越长；使用极性化合间越长；使用极性化合物的分离。物的分离。反相分配色谱反相分配色谱（反相柱）（反相柱）固定相极性固定相极性流动相极性流动相极性组分极性越小，保留时间组分极性越小，保留时间越长；适用非极性化合物越长；适用非极性化合物的分离。的分离。本讲稿第二十五页，共五十四页第二节第二节 主要分离类型主要分离类型（二）、化学键合固定相色谱（二）、化学键合固定相色谱固固定定相相非非常常稳稳定定，在在使使用用中中不不易易流流失失。由由于于可可将将各各种种极极性性的的官官能能团团键键合合到到载载体体表表面面，因因此此它它适适用用于种类繁多样品的分离。于种类繁多样品
14、的分离。特点特点将将各各种种不不同同基基团团通通过过化化学学反反应应键键合合到到硅硅胶胶（担担体）表面的游离羟基上。体）表面的游离羟基上。本讲稿第二十六页，共五十四页第二节第二节 主要分离类型主要分离类型1.键合固定相制备键合固定相制备ODS(C18)键合相键合相硅胶硅胶十八烷基十八烷基氯硅烷氯硅烷非极性非极性硅烷化反应硅烷化反应使用使用pH范围：范围：2-8本讲稿第二十七页，共五十四页第二节第二节 主要分离类型主要分离类型2.键合固定相类型键合固定相类型类类型型反相柱反相柱正相柱正相柱氨丙基氨丙基氰乙基、醚和醇等氰乙基、醚和醇等极性基团极性基团不同碳原子数的不同碳原子数的烷烃（烷烃（C8和和
15、C18）、）、苯基等疏水基团苯基等疏水基团本讲稿第二十八页，共五十四页第二节第二节 主要分离类型主要分离类型保留时间：保留时间：例：以例：以ODS键合色谱柱、甲醇键合色谱柱、甲醇-水为流动相分离以水为流动相分离以下两种苯甲酸，试判断出峰次序。下两种苯甲酸，试判断出峰次序。没食子酸没食子酸3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸固定相固定相:非极性非极性;流动相流动相:极性极性组分极性组分极性:3,4-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸甲甲酰酰胺胺乙乙腈腈甲甲醇醇乙乙醇醇丙丙醇醇丙丙酮酮二二氧氧六六环环四四氢氢呋呋喃喃甲甲乙乙酮酮正正丁丁醇醇乙乙酸酸乙乙酯酯乙乙醚醚异异丙丙醚醚二二氯氯甲甲烷烷氯氯仿仿溴溴乙乙烷烷
16、苯苯四四氯化碳氯化碳二硫化碳二硫化碳环己烷环己烷己烷己烷煤油煤油(最小最小)常用溶剂的极性顺序常用溶剂的极性顺序本讲稿第四十七页，共五十四页第三节第三节 液相色谱的固定相与流动相液相色谱的固定相与流动相1、尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。选择流动相时应注意的问题选择流动相时应注意的问题2、避避免免流流动动相相与与固固定定相相发发生生作作用用而而使使柱柱效效下下降降或或损损坏坏柱柱子子。如如使使固固定定液液溶溶解解流流失失；酸酸性性溶溶剂剂破破坏坏氧氧化化铝铝固定相等。固定
17、相等。本讲稿第四十八页，共五十四页第三节第三节 液相色谱的固定相与流动相液相色谱的固定相与流动相3、试试样样在在流流动动相相中中应应有有适适宜宜的的溶溶解解度度，防防止止产产生沉淀并在柱中沉积。生沉淀并在柱中沉积。4、流流动动相相同同时时还还应应满满足足检检测测器器的的要要求求。当当使使用用紫紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。外检测器时，流动相不应有紫外吸收。本讲稿第四十九页，共五十四页第四节第四节 影响分离的因素与分离类型选择影响分离的因素与分离类型选择一、影响分离的因素一、影响分离的因素二、分离类型的选择二、分离类型的选择本讲稿第五十页，共五十四页第四节第四节 影响分离的因素与分离类型选
18、择影响分离的因素与分离类型选择一、影响分离的因素一、影响分离的因素速率方程速率方程溶质在液相流动相中溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分相中扩散系数的万分之一之一本讲稿第五十一页，共五十四页第四节第四节 影响分离的因素与分离类型选择影响分离的因素与分离类型选择修正的速率方程：修正的速率方程：A.降低颗粒度大小，填充均匀；降低颗粒度大小，填充均匀；B.减小液膜厚度；减小液膜厚度；C.选择粘度小的溶剂；选择粘度小的溶剂；D.选择较低的流动相流速。选择较低的流动相流速。提高柱效途提高柱效途径径本讲稿第五十二页，共五十四页第四节第四节 影响分离的因素与分离类型选择影
19、响分离的因素与分离类型选择二、分离类型的选择二、分离类型的选择根据分析目的、试样性质、化合物的结构根据分析目的、试样性质、化合物的结构本讲稿第五十三页，共五十四页气相色谱与高效液相色谱的比较气相色谱与高效液相色谱的比较 气相色谱气相色谱高效液相色谱高效液相色谱1.只能分析挥发性物质，只能分析只能分析挥发性物质，只能分析 20%的化合物的化合物2.不能用于热不稳定物质的分析不能用于热不稳定物质的分析3.用毛细管色谱可得到很高的柱效用毛细管色谱可得到很高的柱效4.有很灵敏的检测器如有很灵敏的检测器如ECD和较灵和较灵敏的通用检测器（敏的通用检测器（FID和和TCD）5.流动相为气体，无毒，易于处理流动相为气体，无毒，易于处理 6.运行和操作容易运行和操作容易 7.仪器制造难度较小仪器制造难度较小1.几乎可以分析各种物质几乎可以分析各种物质 2.用于热不稳定物质的分析用于热不稳定物质的分析 3.色谱柱较短，柱效较低色谱柱较短，柱效较低4.没有较高灵敏通用检测器没有较高灵敏通用检测器 5.流动相有毒，费用较高流动相有毒，费用较高 6.运行和操作比运行和操作比GC难一些难一些 7.仪器制造难度大仪器制造难度大本讲稿第五十四页，共五十四页