酶六章酶的固定化精选文档.ppt

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1、酶六章酶的固定化本讲稿第一页，共一百五十八页酶催化的优点酶催化的优点作为一种生物催化剂，酶参作为一种生物催化剂，酶参与生物体内的各种代谢反应，具与生物体内的各种代谢反应，具有专一性强、催化效率高及作用有专一性强、催化效率高及作用条件温和等优点。条件温和等优点。本讲稿第二页，共一百五十八页酶催化的缺陷酶催化的缺陷酶对环境影响十分敏感，各酶对环境影响十分敏感，各种物理、化学和生物因素（如温种物理、化学和生物因素（如温度、压力、电磁场、氧化、还原、度、压力、电磁场、氧化、还原、有机溶剂、金属离子、离子强度、有机溶剂、金属离子、离子强度、pH、酶修饰和酶降解等）都可能、酶修饰和酶降解等）都可能使酶丧失

2、生物活力。使酶丧失生物活力。本讲稿第三页，共一百五十八页 在过去的科学研究和生产实践在过去的科学研究和生产实践中，酶一直都是以溶于水的游离状中，酶一直都是以溶于水的游离状态进行催化反应的，但游离酶即使态进行催化反应的，但游离酶即使在酶反应的最适条件下进行催化，在酶反应的最适条件下进行催化，也还存在着容易失活、反应后不能也还存在着容易失活、反应后不能回收等缺陷，有时不易与产物分开，回收等缺陷，有时不易与产物分开，影响产品提纯及质量。影响产品提纯及质量。本讲稿第四页，共一百五十八页设设 想想如果能设计一种方法，将酶束缚于特殊的如果能设计一种方法，将酶束缚于特殊的相，使它与整体相（或整体流体）分隔开

3、，但相，使它与整体相（或整体流体）分隔开，但仍能进行底物和效应物（激活剂或抑制剂）的仍能进行底物和效应物（激活剂或抑制剂）的分子交换。分子交换。这种固定化的酶可以象一般化学反应这种固定化的酶可以象一般化学反应的固体催化剂一样，既具有酶的催化特性，的固体催化剂一样，既具有酶的催化特性，又具有一般化学催化剂能回收、反复使用又具有一般化学催化剂能回收、反复使用等优点，并且生产工艺可以连续化、自动等优点，并且生产工艺可以连续化、自动化。化。本讲稿第五页，共一百五十八页进展进展经过经过4040多年的研究和发展，酶的固定化多年的研究和发展，酶的固定化技术取得了长足的进步。它不仅在理论研究技术取得了长足的进

4、步。它不仅在理论研究（如阐明酶作用机理）上发挥独特作用，在（如阐明酶作用机理）上发挥独特作用，在实际应用上也显示出强大威力。实际应用上也显示出强大威力。用这种技术不仅能稳定酶，改变酶的用这种技术不仅能稳定酶，改变酶的专一性、提高酶活力，从而改善酶的种种专一性、提高酶活力，从而改善酶的种种特性，使之更符合人类要求，而且还能创特性，使之更符合人类要求，而且还能创造适应特殊要求的新酶。造适应特殊要求的新酶。本讲稿第六页，共一百五十八页现状人们对固定化酶极感兴趣，因为其性质比可溶性酶及其相关技术优越，对固定化酶的利用也与日俱增。本讲稿第七页，共一百五十八页固定化酶的定义固定化酶的定义所谓固定化酶，是指

5、在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。不管用何种方法制备的固定化酶，都应该满足上述固定化酶的条件。本讲稿第八页，共一百五十八页 固定化酶与游离酶相比，具有下列优点固定化酶与游离酶相比，具有下列优点（l）极易将固定化酶与底物、产物分开；）极易将固定化酶与底物、产物分开；（2）可以在较长时间内进行反复分批反应和装）可以在较长时间内进行反复分批反应和装 柱连续反应；柱连续反应；（3）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；）在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；（4）酶反应过程能够加以严格控制；）酶反应过程能够加以严格控制；（5）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工

6、）产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工 艺；艺；（6）较游离酶更适合于多酶反应；）较游离酶更适合于多酶反应；（7）可以增加产物的收率，提高产物的质量；）可以增加产物的收率，提高产物的质量；（8）酶的使用效率提高，成本降低。）酶的使用效率提高，成本降低。本讲稿第九页，共一百五十八页 固定化酶是二十世纪五十年固定化酶是二十世纪五十年代开始发展起来的一项新技术、代开始发展起来的一项新技术、最初是将水溶性酶与不溶性载体最初是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物，所以曾叫过衍生物，所以曾叫过“水不溶酶水不溶酶”（water insoluble enzyme

7、）和）和“固相酶固相酶”（solid phase enzyme）。）。本讲稿第十页，共一百五十八页 但是后来发现，也可以将酶包但是后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出，在这种情应产物可以透过膜逸出，在这种情况下，酶本身仍处于溶解状态，只况下，酶本身仍处于溶解状态，只不过被固定在一个有限的空间内不不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。能再自由流动。本讲稿第十一页，共一百五十八页 因此，用水不溶酶或固相酶的因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不恰当了。名称就不恰当了。本讲

8、稿第十二页，共一百五十八页 固定化酶正式定名固定化酶正式定名 在在1971年第一届国际酶工程会年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用议上，正式建议采用“固定化酶固定化酶”（immobilized enzyme）的名称。）的名称。本讲稿第十三页，共一百五十八页历史上较大的时事件历史上较大的时事件1916年，年，Nelson&Griffin“酶不溶于水而具有活性酶不溶于水而具有活性”1948年，年，Sumner 尿素酶制成非溶性酶尿素酶制成非溶性酶1953年，年，Grubhofer&Schleith 第一次实现了酶的固第一次实现了酶的固 定化定化1960年，千细一郎，开始了氨基酰化酶固定化研究年，

9、千细一郎，开始了氨基酰化酶固定化研究1969年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于年，千细一郎成功的将固定化氨基酰化酶应用于 DL-AA的光学分析上的光学分析上1971年，固定化酶名称提出，年，固定化酶名称提出，Immobilized enzyme本讲稿第十四页，共一百五十八页酶的固定化方法酶的固定化方法本讲稿第十五页，共一百五十八页固定化酶的制备原则固定化酶的制备原则固定化酶的应用目的、应用固定化酶的应用目的、应用环境各不相同，而且可用于固定环境各不相同，而且可用于固定化制备的物理、化学手段、材料化制备的物理、化学手段、材料等多种多样。等多种多样。本讲稿第十六页，共一百五十八页 制备固定

10、化酶要根据不同情况（不制备固定化酶要根据不同情况（不同酶、不同应用目的和应用环境）来选同酶、不同应用目的和应用环境）来选择不同的方法，但是无论如何选择，确择不同的方法，但是无论如何选择，确定什么样的方法，都要遵循几个基本原定什么样的方法，都要遵循几个基本原则则本讲稿第十七页，共一百五十八页原则原则1 1必须注意维持酶的催化活性必须注意维持酶的催化活性及专一性，保持酶原有的专一性、及专一性，保持酶原有的专一性、高效催化能力和在常温常压下能高效催化能力和在常温常压下能起催化反应的特点。起催化反应的特点。本讲稿第十八页，共一百五十八页原则原则2固定化应该有利于生产自动固定化应该有利于生产自动化、连续

11、化。为此，用于固定化化、连续化。为此，用于固定化的载体必须有一定的机械强度，的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。不能因机械搅拌而破碎或脱落。本讲稿第十九页，共一百五十八页原则原则3 3固定化酶应有最小的空间位固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量，制备固近，以提高产品的产量，制备固定化酶时所选载体应尽可能地不定化酶时所选载体应尽可能地不阻碍酶和底物的接近。阻碍酶和底物的接近。本讲稿第二十页，共一百五十八页原则原则4 4酶与载体必须结合牢固，从酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于而使固定化酶能回收贮

12、藏，利于反复使用，因此，在制备固定化反复使用，因此，在制备固定化酶时，应使酶和载体尽可能地结酶时，应使酶和载体尽可能地结合牢固。合牢固。本讲稿第二十一页，共一百五十八页原则原则5固定化酶应有最大的稳定性，固定化酶应有最大的稳定性，在制备固定化酶时，所选载体不在制备固定化酶时，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学与废物、产物或反应液发生化学反应。反应。本讲稿第二十二页，共一百五十八页原则原则6固定化酶应能保持甚至超过固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性，在制备固定化原有酶液的活性，在制备固定化酶时，酶和载体结合部位不应是酶时，酶和载体结合部位不应是酶的活性中心或与维持酶高级空酶的活性中心或与

13、维持酶高级空间结构有关的基团，因此，应尽间结构有关的基团，因此，应尽可能预先保护这些基团；可能预先保护这些基团；本讲稿第二十三页，共一百五十八页原则原则7固定化酶应易与产物分离，固定化酶应易与产物分离，即能通过简单的过滤或离心就可即能通过简单的过滤或离心就可回收和重复使用；回收和重复使用；本讲稿第二十四页，共一百五十八页原则原则8 固定化酶成本要低，应为廉固定化酶成本要低，应为廉价的、有利于推广的产品，以便价的、有利于推广的产品，以便于工业使用。于工业使用。本讲稿第二十五页，共一百五十八页酶的固定化方法酶的固定化方法酶的固定化方法很多，但对酶的固定化方法很多，但对任何酶都适用的方法是没有的。任

14、何酶都适用的方法是没有的。本讲稿第二十六页，共一百五十八页酶的固定化方法通常按照用于结合的化学酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类反应的类型进行分类 固定化方法 分类非化学结合法结晶法分散法 物理吸附法离子结合法化学结合法 交联法共价结合法包埋法 微囊法网格法本讲稿第二十七页，共一百五十八页（一）非共价结合法（一）非共价结合法1结晶法结晶法2 分散法分散法3 物理吸附法物理吸附法4 离子结合法离子结合法 本讲稿第二十八页，共一百五十八页1.结晶法就是使酶结晶从而实现固定化的方法。对于晶体来说，载体就是酶蛋白本身。提供了非常高的酶浓度。对于活力较低的酶来说，这一点就更具优越性。

15、本讲稿第二十九页，共一百五十八页结晶法的局限性结晶法的局限性在不断的重复循环中，酶在不断的重复循环中，酶会有损耗，从而使得固定化酶会有损耗，从而使得固定化酶浓度降低。浓度降低。本讲稿第三十页，共一百五十八页2 分散法分散法通过酶分散于水不溶相中从通过酶分散于水不溶相中从而实现固定化的方法。而实现固定化的方法。对于在水不溶的有机相中进行的反应，对于在水不溶的有机相中进行的反应，最简单的固定化方法是将干粉悬浮于溶剂中，最简单的固定化方法是将干粉悬浮于溶剂中，并且可以通过过滤和离心的方法将酶进行分并且可以通过过滤和离心的方法将酶进行分离和再利用。离和再利用。本讲稿第三十一页，共一百五十八页 对于用在

16、水不溶性溶剂中的固对于用在水不溶性溶剂中的固定化酶，有许多途径可以提高它们定化酶，有许多途径可以提高它们的反应速率的反应速率本讲稿第三十二页，共一百五十八页正确的体系和贮存状态使酶粉末正确的体系和贮存状态使酶粉末充分分散，将有助于提高活力。充分分散，将有助于提高活力。在干燥过程中，加入多种化合在干燥过程中，加入多种化合物有助于酶的分散，这些化合物也物有助于酶的分散，这些化合物也作为稳定剂和保护剂发挥作用。作为稳定剂和保护剂发挥作用。本讲稿第三十三页，共一百五十八页通过与亲脂化合物的共价连接通过与亲脂化合物的共价连接 能增加酶在有机相中的溶解度能增加酶在有机相中的溶解度可以通过将其包埋在膜体系可

17、以通过将其包埋在膜体系中或通过多相反应来实现酶的固中或通过多相反应来实现酶的固定化。定化。本讲稿第三十四页，共一百五十八页酶的固定化。酶的固定化。将酶简单地吸附到多孔载体中就能将酶简单地吸附到多孔载体中就能显著地增加单一催化中心的获得，并且显著地增加单一催化中心的获得，并且易于从产物中分离酶。易于从产物中分离酶。交联的晶体需要表面活性剂来补偿交联的晶体需要表面活性剂来补偿它们在有机相中的低活力。它们在有机相中的低活力。本讲稿第三十五页，共一百五十八页3.物理吸附法物理吸附法酶被物理吸附于不溶性载体酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方法。的一种固定化方法。本讲稿第三十六页，共一百五十八页载体载

18、体无机载体有多孔玻璃、活性炭、酸性白无机载体有多孔玻璃、活性炭、酸性白土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、漂白土、高岭石、氧化铝、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；土、羟基磷灰石、磷酸钙、金属氧化物等；天然高分子载体有淀粉、白蛋白等；天然高分子载体有淀粉、白蛋白等；大孔型合成树脂、陶瓷等载体也十分引大孔型合成树脂、陶瓷等载体也十分引人注目；人注目；具有疏水基的载体（丁基或已基具有疏水基的载体（丁基或已基-葡聚葡聚糖凝胶）可以疏水性吸附酶，以及以单宁糖凝胶）可以疏水性吸附酶，以及以单宁作为配基的纤维素衍生物等载体。作为配基的纤维素衍生物等载体。本讲稿第三十七页，共一百五十八页

19、物理吸附法也能固定微生物细胞，并有可能在研究此法中开发出固定化增殖微生物的优良载体。本讲稿第三十八页，共一百五十八页 物理吸附法具有酶活性中心物理吸附法具有酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少不易被破坏和酶高级结构变化少的优点，因而酶活力损失很少。的优点，因而酶活力损失很少。若能找到适当的载体，这是若能找到适当的载体，这是很好的方法。很好的方法。但是它有酶与载体相互作用但是它有酶与载体相互作用力弱、酶易脱落等缺点。力弱、酶易脱落等缺点。本讲稿第三十九页，共一百五十八页4.离子结合法离子结合法酶通过离子键结合于具有离酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶性载体的固定子交换基的水不溶性载体的固

20、定化方法。化方法。本讲稿第四十页，共一百五十八页载体载体阴离子交换剂如阴离子交换剂如DEAE-纤维纤维 素，素，DEAE-葡聚糖凝胶，葡聚糖凝胶，Amberlite IRA-93，410，900；阳离子交换剂如，阳离子交换剂如，CM-纤维纤维 素，素，Amberlite CG-50，IRC-50，IR-120，Dowex-50等。等。本讲稿第四十一页，共一百五十八页离子结合法的优点离子结合法的优点操作简单，操作简单，处理条件温和，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的酶的高级结构和活性中心的 氨基酸残基不易被破坏，能氨基酸残基不易被破坏，能 得到酶活回收率较高的固定得到酶活回收率较高的固定 化

21、酶。化酶。本讲稿第四十二页，共一百五十八页缺点缺点载体和酶的结合力比较弱，载体和酶的结合力比较弱，容易受缓冲液种类或容易受缓冲液种类或pH的影响，的影响，在离子强度高的条件下进行反应在离子强度高的条件下进行反应时，酶往往会从载体上脱落。时，酶往往会从载体上脱落。本讲稿第四十三页，共一百五十八页 离子结合法也能用于微生物细离子结合法也能用于微生物细胞的固定化，但是由于微生物在胞的固定化，但是由于微生物在使用中会发生自溶。使用中会发生自溶。用此法要得到稳定的固定化用此法要得到稳定的固定化微生物较为困难。微生物较为困难。本讲稿第四十四页，共一百五十八页 迄今已有许多酶用离子结合迄今已有许多酶用离子结

22、合法固定化，例如法固定化，例如1969年最早应用年最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-葡聚糖凝胶固定化的。葡聚糖凝胶固定化的。本讲稿第四十五页，共一百五十八页（二）化学结合法（二）化学结合法1 共价结合法共价结合法2 交联法交联法本讲稿第四十六页，共一百五十八页共价偶联法共价偶联法本讲稿第四十七页，共一百五十八页酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联

23、成水不溶性的固定化酶；（交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶形成水不溶性的固定化酶本讲稿第四十八页，共一百五十八页1共价结合法共价结合法酶与载体以共价键结合的固定化方法酶与载体以共价键结合的固定化方法方法：方法：将载体有关基团活化，然后与将载体有关基团活化，然后与酶有关基团发生偶联反应。酶有关基团发生偶联反应。另一种是在载体上接上一个双另一种是在载体上接上一个双功能试剂，然后将酶偶联上去。功能试剂，然后将酶偶联上去。本讲稿第四十九页，共一百五十八页可与载体共价结合的酶的功能团可与载体共价结合的酶的功能团 或或 氨基、氨

24、基、或或-羧基、巯基、羧基、巯基、羟基、咪唑基、酚基等。羟基、咪唑基、酚基等。参与共价结合的氨基酸残基不应是参与共价结合的氨基酸残基不应是 酶催化活性所必需的，否则往往造酶催化活性所必需的，否则往往造 成固定后的酶活性完全丧失。成固定后的酶活性完全丧失。本讲稿第五十页，共一百五十八页共价结合法与共价结合法与离子结合法或物理离子结合法或物理吸附法相吸附法相比的优点比的优点酶与载体结合牢固，一般不酶与载体结合牢固，一般不会因底物浓度高或存在盐类等原会因底物浓度高或存在盐类等原因而轻易脱落。因而轻易脱落。本讲稿第五十一页，共一百五十八页缺陷缺陷反应条件苛刻，操作复杂；反应条件苛刻，操作复杂；会引起酶

25、蛋白高级结构变化，破会引起酶蛋白高级结构变化，破坏部分活性中心。坏部分活性中心。因此往往不能得到比活高的固定化因此往往不能得到比活高的固定化酶，酶活回收率一般为酶，酶活回收率一般为30左右，甚至左右，甚至底物的专一性等酶的性质也会发生变化。底物的专一性等酶的性质也会发生变化。本讲稿第五十二页，共一百五十八页所用载体分三类所用载体分三类天然有机载体（如多糖、蛋白质、细天然有机载体（如多糖、蛋白质、细 胞），胞），无机物（玻璃、陶瓷等）无机物（玻璃、陶瓷等）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙等）本讲稿第五十三页，共一百五十八页 载体的活化方法依载体性质各载体的活化方法依载

26、体性质各不相同不相同本讲稿第五十四页，共一百五十八页羟基聚合物羟基聚合物 纤维素、葡聚糖、琼脂糖及纤维素、葡聚糖、琼脂糖及胶原等可用溴化氰法、活化酯法、胶原等可用溴化氰法、活化酯法、环氧化法及三嗪法等。环氧化法及三嗪法等。本讲稿第五十五页，共一百五十八页溴化氰法溴化氰法本讲稿第五十六页，共一百五十八页 溴化氰法能在非常温和条件下溴化氰法能在非常温和条件下与酶蛋白的氨基发生反应，它已成与酶蛋白的氨基发生反应，它已成为近年来普遍使用的固定化方法，为近年来普遍使用的固定化方法，尤其是溴化氢活化的琼脂糖已在实尤其是溴化氢活化的琼脂糖已在实验室广泛用于制备固定化酶以及亲验室广泛用于制备固定化酶以及亲和层

27、析的固定化吸附剂。和层析的固定化吸附剂。本讲稿第五十七页，共一百五十八页活化酯法活化酯法本讲稿第五十八页，共一百五十八页环氧化法环氧化法本讲稿第五十九页，共一百五十八页三嗪法三嗪法 三氯三氯-均均-三嗪三嗪 三氯三氯-均均-三嗪纤维素三嗪纤维素 本讲稿第六十页，共一百五十八页醛基载体醛基载体纤维素葡聚糖经过碘酸氧化或用二甲纤维素葡聚糖经过碘酸氧化或用二甲基砜氧化裂解葡萄糖环，产生二醛高聚物，基砜氧化裂解葡萄糖环，产生二醛高聚物，每个葡萄糖分子含二个醛基。每个葡萄糖分子含二个醛基。本讲稿第六十一页，共一百五十八页本讲稿第六十二页，共一百五十八页羧基载体羧基载体本讲稿第六十三页，共一百五十八页多胺

28、载体多胺载体本讲稿第六十四页，共一百五十八页本讲稿第六十五页，共一百五十八页无机载体无机载体可采用直接法和涂层法（用可采用直接法和涂层法（用活化的聚合物如白蛋白或葡聚糖活化的聚合物如白蛋白或葡聚糖涂层）涂层）本讲稿第六十六页，共一百五十八页 本讲稿第六十七页，共一百五十八页2 交联法交联法用双功能或多功能试剂使酶用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物与微生物细胞之间与酶或微生物与微生物细胞之间交联的固定化方法。交联的固定化方法。与共价结合法一样也是利用共价键固与共价结合法一样也是利用共价键固定酶的，所不同的是它不使用载体。定酶的，所不同的是它不使用载体。本讲稿第六十八页，共一百五十八页参与交联反

29、应的酶蛋白的功能团参与交联反应的酶蛋白的功能团N末端的末端的-氨基氨基赖氨酸的赖氨酸的-氨基氨基酪氨酸的酚基酪氨酸的酚基半胱氨酸的巯基半胱氨酸的巯基组氨酸的咪唑基等组氨酸的咪唑基等本讲稿第六十九页，共一百五十八页交联剂交联剂形成希夫碱的戊二醛，形成希夫碱的戊二醛，形成肽键的异氰酸酯，形成肽键的异氰酸酯，发生重氮偶合反应的双重氮联苯发生重氮偶合反应的双重氮联苯 胺或胺或N，N-乙烯双马来亚胺等。乙烯双马来亚胺等。最常用的交联剂是戊二醛。最常用的交联剂是戊二醛。本讲稿第七十页，共一百五十八页本讲稿第七十一页，共一百五十八页特点特点交联法反应条件比较激烈，固定化交联法反应条件比较激烈，固定化的酶活回

30、收率一般较低，的酶活回收率一般较低，尽可能降低交联剂浓度和缩短反应尽可能降低交联剂浓度和缩短反应时间将有利于固定化酶比活的提高。时间将有利于固定化酶比活的提高。本讲稿第七十二页，共一百五十八页 （三）包埋法（三）包埋法网格型网格型微囊型微囊型本讲稿第七十三页，共一百五十八页网格型网格型将酶或微生物包埋在高分子将酶或微生物包埋在高分子凝胶细微网格中的称为网格型凝胶细微网格中的称为网格型本讲稿第七十四页，共一百五十八页网格型网格型本讲稿第七十五页，共一百五十八页微囊型微囊型将酶或微生物包埋在高分子将酶或微生物包埋在高分子半透膜中的称为微囊型。半透膜中的称为微囊型。本讲稿第七十六页，共一百五十八页微

31、囊型微囊型本讲稿第七十七页，共一百五十八页特点特点包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的高级结残基进行结合反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高。构，酶活回收率较高。但是在包埋时发生化学聚合反应，但是在包埋时发生化学聚合反应，酶容易失活，必须巧妙设计反应条件。酶容易失活，必须巧妙设计反应条件。本讲稿第七十八页，共一百五十八页由于只有小分子可以通过高由于只有小分子可以通过高分子凝胶的网格扩散，并且这种分子凝胶的网格扩散，并且这种扩散阻力还会导致固定化酶动力扩散阻力还会导致固定化酶动力学行为的改变，降低酶活力。学行为的改变，降低酶活力。因

32、此，包埋法只适合作用于小分子底物因此，包埋法只适合作用于小分子底物和产物的酶，对于那些作用于大分子底物和和产物的酶，对于那些作用于大分子底物和产物的酶是不适合的。产物的酶是不适合的。本讲稿第七十九页，共一百五十八页常用的载体材料常用的载体材料1.网格型网格型聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光敏树脂等敏树脂等合成高分子化合物合成高分子化合物淀粉、蒟蒻粉、明胶、胶原、淀粉、蒟蒻粉、明胶、胶原、海藻酸和角叉菜胶等海藻酸和角叉菜胶等天然高分子天然高分子化合物化合物。本讲稿第八十页，共一百五十八页合成高分子化合物合成高分子化合物常采用单常采用单体或预聚物在酶或微生物存在下体或预聚物在酶或微

33、生物存在下聚合的方法，聚合的方法，溶胶状天然高分子化合物溶胶状天然高分子化合物则则在酶或微生物存在下凝胶化。在酶或微生物存在下凝胶化。本讲稿第八十一页，共一百五十八页 网格型包埋法是固定化微生网格型包埋法是固定化微生物中用得最多、最有效的方法。物中用得最多、最有效的方法。本讲稿第八十二页，共一百五十八页2.微囊型微囊型微囊型固定化酶通常直径为几微米到几百微米的球状体，颗粒比网格型要小得多，比较有利于底物和产物扩散，但是反应条件要求高，制备成本也高。制备微囊型固定化酶方法。界面沉淀法界面聚合法二级乳化法：本讲稿第八十三页，共一百五十八页（1）界面沉淀法）界面沉淀法利用某些高聚物在水相和有利用某些

34、高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成机相的界面上溶解度极低而形成皮膜将酶包埋。皮膜将酶包埋。本讲稿第八十四页，共一百五十八页例子例子先将含高浓度血红蛋白的酶溶液在水不互先将含高浓度血红蛋白的酶溶液在水不互溶的有机相中乳化，在油溶性的表面活性溶的有机相中乳化，在油溶性的表面活性剂存在下形成油包水的微滴，再将溶于有剂存在下形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物加入乳化液中，机溶剂的高聚物加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂，使高聚物在油使高聚物在油水界面上沉淀、析出、形水界面上沉淀、析出、形成膜，将酶包埋，成膜，将酶包埋，最后在乳化剂的帮

35、助下由有机相移入水相最后在乳化剂的帮助下由有机相移入水相本讲稿第八十五页，共一百五十八页方法的特点方法的特点条件温和，酶失活少，条件温和，酶失活少，但要完全除去膜上残留的有机溶剂很但要完全除去膜上残留的有机溶剂很麻烦。麻烦。本讲稿第八十六页，共一百五十八页 作为膜材料的高聚物有硝酸纤作为膜材料的高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。酯等。本讲稿第八十七页，共一百五十八页（2）界面聚合法）界面聚合法利用亲水性单体和疏水性单体在界利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合的原理包埋酶。面发生聚合的原理包埋酶。本讲稿第八十八页，共一百五十八页例子例子将含将含1

36、0血红蛋白的酶溶液与血红蛋白的酶溶液与1，6-己二胺的水溶液混合，己二胺的水溶液混合，立即在含立即在含1%Span-85的氯仿的氯仿-环乙烷环乙烷中分散乳化，中分散乳化，加入溶于有机相的癸二酰氯后，便在加入溶于有机相的癸二酰氯后，便在油油-水界面上发生聚合反应，形成尼水界面上发生聚合反应，形成尼龙膜，将酶包埋。龙膜，将酶包埋。除尼龙膜外还有聚酰胺、聚脲等形成的微囊。除尼龙膜外还有聚酰胺、聚脲等形成的微囊。本讲稿第八十九页，共一百五十八页方法的特点方法的特点制备的微囊大小能随乳化剂浓度和制备的微囊大小能随乳化剂浓度和乳化时的搅拌速度而自由控制，制备过乳化时的搅拌速度而自由控制，制备过程所需时间非

37、常短。程所需时间非常短。但在包埋过程中由于发生化学反应但在包埋过程中由于发生化学反应会引起酶失活。会引起酶失活。本讲稿第九十页，共一百五十八页（3）二级乳化法）二级乳化法酶溶液先在高聚物（常用乙基纤维酶溶液先在高聚物（常用乙基纤维素、聚苯乙烯等）有机相中乳化分散，素、聚苯乙烯等）有机相中乳化分散，乳化液再在水相中分散形成次级乳化液，乳化液再在水相中分散形成次级乳化液，当有机高聚物溶液固化后，每个固体球当有机高聚物溶液固化后，每个固体球内包含着多滴酶液。内包含着多滴酶液。本讲稿第九十一页，共一百五十八页方法的特点方法的特点制备比较容易，但膜比较厚，制备比较容易，但膜比较厚，会影响底物扩散。会影响

38、底物扩散。本讲稿第九十二页，共一百五十八页 此外还有脂质体包埋法，由表面活性此外还有脂质体包埋法，由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶，其特征是剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶，其特征是底物或产物的膜透过性不依赖于膜孔径大底物或产物的膜透过性不依赖于膜孔径大小，而只依赖于对膜成分的溶解度，因此小，而只依赖于对膜成分的溶解度，因此可加快底物透过膜的速度。可加快底物透过膜的速度。本讲稿第九十三页，共一百五十八页各种固定化酶方法的优缺点比较各种固定化酶方法的优缺点比较特性物理吸附法离子结合法包埋法共价结合法交联法制备易易易难难结合力中弱强强强酶活力高高高中中底物专一性无变化无变化无变化有变化有变化再生可能

39、可能不可能不可能不可能固定化费用低低中中高本讲稿第九十四页，共一百五十八页包埋、共价结合、共价交联包埋、共价结合、共价交联三种虽结三种虽结 合力强、但不能再生、回收；合力强、但不能再生、回收；吸附法吸附法制备简单，成本低，能回收再制备简单，成本低，能回收再 生，但结合差，在受到离子强度、生，但结合差，在受到离子强度、pHpH 变化影响后，酶会从载体上游离下来。变化影响后，酶会从载体上游离下来。在使用价格较高的酶与载体时可行；在使用价格较高的酶与载体时可行；包埋法包埋法各方面较好，但不适于大分子底各方面较好，但不适于大分子底 物和产物。物和产物。没有一个方法是十全十美的，几没有一个方法是十全十美

40、的，几种方法各有利弊种方法各有利弊本讲稿第九十五页，共一百五十八页固定化酶的性质固定化酶的性质 本讲稿第九十六页，共一百五十八页 固定化是一种化学修饰，酶本固定化是一种化学修饰，酶本身的结构必然受到扰动，同时酶固身的结构必然受到扰动，同时酶固定化后，其催化作用由均相移到异定化后，其催化作用由均相移到异相，由此带来的扩散限制效应、空相，由此带来的扩散限制效应、空间障碍、载体性质造成的分配效应间障碍、载体性质造成的分配效应等因素必然对酶的性质产生影响。等因素必然对酶的性质产生影响。本讲稿第九十七页，共一百五十八页1 1 影响固定化酶性能的因素影响固定化酶性能的因素固定化酶制备物的性质取决于固定化酶

41、制备物的性质取决于 所用的酶及载体材料的性质。所用的酶及载体材料的性质。酶和载体之间相互作用使固定酶和载体之间相互作用使固定 化酶具备了化学、生物化学、化酶具备了化学、生物化学、机械及动力学方面的性质。机械及动力学方面的性质。本讲稿第九十八页，共一百五十八页成分参数酶生物化学性质分子量，辅基，蛋白质表面的功能基团，纯度（杂质的失活或保护作用）动力学参数专一性，pH及温度曲线，活性及抑制性的动力学参数，对pH，温度，溶剂，去污剂及杂质的稳定性。载体化学特征化学组成，功能基，膨胀行为，基质的可及体积，微孔大小及载体的化学稳定性 机械性质颗粒直径，单颗粒压缩行为，流动抗性（固定床反应器），沉降速率（

42、流体床），对搅拌罐的磨损。固定化酶固定化方法 所结合的蛋白，活性酶的产量，内在的动力学参数（即无质量转移效应的性质）质量转移效应分配效应（催化剂颗粒内外不同的溶质浓度），外部或内部（微孔）扩散效应；这些给出了游离酶在合适反应条件下的效率。稳定性操作稳定性(表示为工作条件下的活性降低)，贮藏稳定性效能生产力（产品量/单位活性或酶量），酶的消耗（酶单位数/公斤产品）固定化酶的特征参数固定化酶的特征参数 本讲稿第九十九页，共一百五十八页2 2 固定化后酶活性变化固定化后酶活性变化 固定化酶的活力在多数情况下固定化酶的活力在多数情况下比天然酶小，其专一性也能发生改比天然酶小，其专一性也能发生改变。变。

43、本讲稿第一百页，共一百五十八页例如例如 用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋白用羧甲基纤维素作载体固定的胰蛋白酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力酶，对高分子底物酪蛋白只显示原酶活力的的30%，而对低分子底物苯酞精氨酸，而对低分子底物苯酞精氨酸-对硝基酰替苯胺的活力保持对硝基酰替苯胺的活力保持80%。所以，。所以，一般认为高分子底物受到空间位阻的一般认为高分子底物受到空间位阻的影响比低分子底物大。影响比低分子底物大。本讲稿第一百零一页，共一百五十八页 在同一测定条件下，固定化酶的活力要在同一测定条件下，固定化酶的活力要低于等摩尔原酶的活力的原因可能是：低于等摩尔原酶的活力的原因可能是：酶分子在固定化

44、过程中，空间构象会有酶分子在固定化过程中，空间构象会有 所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸固定化后，酶分子空间自由度受到限制固定化后，酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影响到活性中心对（空间位阻），会直接影响到活性中心对 底物的定位作用；底物的定位作用；内扩散阻力使底物分子与活性中心的接内扩散阻力使底物分子与活性中心的接 近受阻；近受阻；包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大 分子底物不能过膜与酶接近。分子底物不能过膜与酶接近。本讲稿第一百零二页，共一百五十八页值得注意的是值得注意的是也有个别情况，酶在固定化后反也有个别

45、情况，酶在固定化后反 而比原酶活力提高。而比原酶活力提高。原因可能是偶联过程中酶得到化原因可能是偶联过程中酶得到化 学修饰，或固定化过程提高了酶学修饰，或固定化过程提高了酶 的稳定性。的稳定性。本讲稿第一百零三页，共一百五十八页3 3 固定化对酶稳定性的影响固定化对酶稳定性的影响 稳定性是关系到固定化酶能否稳定性是关系到固定化酶能否实际应用的大问题实际应用的大问题本讲稿第一百零四页，共一百五十八页酶的稳定性包括酶的稳定性包括 热稳定性热稳定性 对各种有机试剂稳定性对各种有机试剂稳定性 对酶抑制剂的稳定性对酶抑制剂的稳定性 对不同对不同pH（酸度）稳定性（酸度）稳定性 对蛋白酶稳定性对蛋白酶稳定

46、性 贮存稳定性贮存稳定性 操作稳定性操作稳定性本讲稿第一百零五页，共一百五十八页在大多数情况下酶经过固定化后其稳定在大多数情况下酶经过固定化后其稳定性都有所增加，这是十分有利的。性都有所增加，这是十分有利的。本讲稿第一百零六页，共一百五十八页 Merlose曾选择曾选择50种固定化酶，种固定化酶，就其稳定性与固定化前的酶进行比就其稳定性与固定化前的酶进行比较，发现其中有较，发现其中有30种酶经固定化后种酶经固定化后稳定性提高，稳定性提高，12种酶无变化，只有种酶无变化，只有8种酶稳定性降低。种酶稳定性降低。本讲稿第一百零七页，共一百五十八页热稳定性 固定化酶的稳定性变化固定化酶的稳定性变化固定

47、化酶；固定化酶；2.2.自然酶自然酶本讲稿第一百零八页，共一百五十八页 固定化后酶稳定性提高的原因，可固定化后酶稳定性提高的原因，可能有以下几点：能有以下几点：固定化后酶分子与载体多点连接固定化后酶分子与载体多点连接 ，可防止酶分子伸展变形。，可防止酶分子伸展变形。酶活力的缓慢释放。酶活力的缓慢释放。抑制酶的自降解。将酶与固态载抑制酶的自降解。将酶与固态载 体结合后，由于酶失去了分子间体结合后，由于酶失去了分子间 相互作用的机会，从而抑制了降相互作用的机会，从而抑制了降 解。解。本讲稿第一百零九页，共一百五十八页 然而，由于目前尚未找到固然而，由于目前尚未找到固定化方法与稳定性之间规律性，定化

48、方法与稳定性之间规律性，因此要预测怎样才能提高稳定性因此要预测怎样才能提高稳定性还有一定困难，但大多数情况下还有一定困难，但大多数情况下酶经过固定化后稳定性提高了。酶经过固定化后稳定性提高了。本讲稿第一百一十页，共一百五十八页4 4 固定化酶的最适温度变化固定化酶的最适温度变化酶反应的最适温度是酶热稳定性酶反应的最适温度是酶热稳定性与反应速度的综合结果。由于固定化与反应速度的综合结果。由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。度也随之提高，这是非常有利的结果。当然，也有报道最适温度不变或当然，也有报道最适温度不变或下降的。下降的

49、。本讲稿第一百一十一页，共一百五十八页5 固定化酶的最适固定化酶的最适pH变化变化酶由蛋白质组成，其催化能力酶由蛋白质组成，其催化能力 对外部环境特别是对外部环境特别是pH非常敏感。非常敏感。酶固定化后，对底物作用的最适酶固定化后，对底物作用的最适 pH和和pH-活性曲线常常发生偏移活性曲线常常发生偏移 本讲稿第一百一十二页，共一百五十八页 pH对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响对固定化前后天冬酰胺酶活力的影响1.固定化酶；固定化酶；2.游离酶游离酶本讲稿第一百一十三页，共一百五十八页6 6 固定化酶的米氏常数（固定化酶的米氏常数（KmKm）变化）变化固定化酶的表观米氏常数固定化酶的表观米氏常数

50、KmKm随载体的随载体的 带电性能变化。带电性能变化。与溶液酶相比，固定化酶即使在溶液与溶液酶相比，固定化酶即使在溶液 的底物浓度较低时，也可达到最大反的底物浓度较低时，也可达到最大反 应速度，即固定化酶的表观应速度，即固定化酶的表观KmKm值低于值低于 溶液的溶液的KmKm值；值；简单说，由于高级结构变化及载体影简单说，由于高级结构变化及载体影 响引起酶与底物亲和力变化，从而使响引起酶与底物亲和力变化，从而使 Km Km 变化。变化。本讲稿第一百一十四页，共一百五十八页 辅酶的固定化辅酶的固定化本讲稿第一百一十五页，共一百五十八页辅酶的定义辅酶的定义 约约1/3的酶的催化作用得以进的酶的催化