第八章蛋白质的测定PPT讲稿.ppt

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1、第八章蛋白质的测定第1页，共48页，编辑于2022年，星期三第一节第一节 概述概述1.蛋白质概况蛋白质概况 蛋蛋白白质质是是含含氮氮的的有有机机化化合合物物，分分子子量量很很大大。主主要要由由C、H、O、N、S五五种种元元素素组组成成。某某些蛋白质中还含有微量的些蛋白质中还含有微量的 P、Cu、Fe、I 等。等。第2页，共48页，编辑于2022年，星期三食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常食品和其原料中蛋白质含量的测定，主要（也是最常用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算用的）用凯氏定氮法测定总氮量，然后乘一个蛋白质换算系数。这里也包括非蛋白的氮，如核酸、含氮碳水化合物、

2、系数。这里也包括非蛋白的氮，如核酸、含氮碳水化合物、生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素所以只能称为生物碱等；含氮类脂、卟啉和含氮的色素所以只能称为粗粗蛋白的含量。蛋白的含量。蛋白质是生命的物质基础，人体蛋白质是生命的物质基础，人体11%13%总热总热量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，量来自蛋白质。无论动物、植物都含有蛋白质，只是含量及类型不同。只是含量及类型不同。第3页，共48页，编辑于2022年，星期三关于氮关于氮-pro换算等数换算等数对于氮含量换算成对于氮含量换算成pro含量的等数，历来采用含量的等数，历来采用6.25，这个数值是以，这个数值是以pro平均含氮而导出的数值。平均

3、含氮而导出的数值。一般手册上列出了一部分换算等数，用时可查，一般手册上列出了一部分换算等数，用时可查，蛋蛋=6.25，肉，肉=6.25，牛乳，牛乳=6.38，稻米，稻米=5.95，大麦，大麦=5.83，玉米，玉米=6.25，小麦，小麦=5.83，麸皮，麸皮=6.31，面粉，面粉=5.70，如果手册上查不到的样品则可用，如果手册上查不到的样品则可用6.25，一般在一般在写报告时要注明采用的换算等数以何物代替。写报告时要注明采用的换算等数以何物代替。第4页，共48页，编辑于2022年，星期三一类是利用蛋白质的一类是利用蛋白质的一类是利用蛋白质的一类是利用蛋白质的共性即含氮量、肽键共性即含氮量、肽键

4、共性即含氮量、肽键共性即含氮量、肽键和折射率等测定蛋白和折射率等测定蛋白和折射率等测定蛋白和折射率等测定蛋白质含量；质含量；质含量；质含量；另一类是利用蛋白质另一类是利用蛋白质另一类是利用蛋白质另一类是利用蛋白质中的氨基酸残基、酸中的氨基酸残基、酸中的氨基酸残基、酸中的氨基酸残基、酸性和碱性基因以及芳性和碱性基因以及芳性和碱性基因以及芳性和碱性基因以及芳香基团等测定蛋白质香基团等测定蛋白质香基团等测定蛋白质香基团等测定蛋白质含量。含量。含量。含量。蛋白质的测定方法分两大类：蛋白质的测定方法分两大类：第5页，共48页，编辑于2022年，星期三具体测定方法：具体测定方法：凯氏定氮法凯氏定氮法:最常

5、用的，最常用的，国内外应用普遍。国内外应用普遍。双缩脲反应双缩脲反应染料结合反应染料结合反应酚试剂法酚试剂法国外：国外：红外分析仪红外分析仪第6页，共48页，编辑于2022年，星期三第7页，共48页，编辑于2022年，星期三第二节第二节 蛋白质的定性测定蛋白质的定性测定一、蛋白质的一般显色反应一、蛋白质的一般显色反应电电泳泳或或纸纸层层析析之之后后用用一一些些染染料料与与蛋蛋白白质质结结合合并并变变色色。书中列举了书中列举了 5 种染料。种染料。二、复合蛋白质的显色反应二、复合蛋白质的显色反应（一）糖蛋白的显色（一）糖蛋白的显色（3种方法）种方法）（二）脂蛋白的显色（二）脂蛋白的显色（2种方法

6、）种方法）第8页，共48页，编辑于2022年，星期三第三节第三节 蛋白质的定量测定蛋白质的定量测定 一一般般说说来来，动动物物性性食食品品的的蛋蛋白白质质含含量量高高于于植植物物性性食食品品。例例如如牛牛肉肉中中蛋蛋白白质质含含量量为为 20.0%左左右右，猪猪肉肉 9.5%，兔兔肉肉 21%，鸡肉鸡肉 20%，牛乳牛乳 3.5%，带鱼带鱼 18.0%，大豆大豆 40%，面粉面粉 9.9%，菠菜菠菜 2.4%，黄瓜黄瓜 1.0%，苹果苹果 1.4%一些蛋白质的含氮量一些蛋白质的含氮量一些蛋白质的含氮量一些蛋白质的含氮量 一般为一般为一般为一般为 15%17.6%15%17.6%，有的上下浮动，

7、有的上下浮动，有的上下浮动，有的上下浮动=N6.25=蛋白质含量蛋白质含量第9页，共48页，编辑于2022年，星期三一、一、凯氏定氮法凯氏定氮法 由由Kieldhl于于1833年提出，现发展为常量、微年提出，现发展为常量、微量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中量、自动定氮仪法，半微量法及改良凯氏法。书中只介绍前三种。只介绍前三种。第10页，共48页，编辑于2022年，星期三（一）常量凯氏定氮法（一）常量凯氏定氮法样样品品与与浓浓硫硫酸酸和和催催化化剂剂一一同同加加热热消消化化，使使蛋蛋白白质质分分解解，其其中中碳碳和和氢氢被被氧氧化化为为二二氧氧化化碳碳和和水水逸逸出出，而而样样品品中

8、中的的有有机机氮氮转转化化为为氨氨与与硫硫酸酸结结合合成成硫硫酸酸铵铵。然然后后加加碱碱蒸蒸馏馏，使使氨氨蒸蒸出出。用用H3BO3吸吸收收后后再再以以标标准准HCl或或硫硫酸酸溶溶液液滴滴定定。根根据据标标准准酸酸消消耗耗量量可可以计算出蛋白质的含量。以计算出蛋白质的含量。1.原理原理第11页，共48页，编辑于2022年，星期三LOGO1.ONE1.ONE2.TWO2.TWO3.THREE3.THREE2、整个过程分三步：、整个过程分三步：消化消化蒸馏蒸馏吸收与吸收与滴定滴定第12页，共48页，编辑于2022年，星期三（1）消化）消化 总反应式：总反应式：加硫酸钾加硫酸钾 作为增温剂，提高溶液

9、沸点，作为增温剂，提高溶液沸点，纯硫酸沸点纯硫酸沸点 340，加入硫酸钾之后可以提高，加入硫酸钾之后可以提高至至400以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提以上。也可加入硫酸钠，氯化钾等提高沸点，但效果不如硫酸钾。高沸点，但效果不如硫酸钾。2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O一定要用浓硫酸（一定要用浓硫酸（98%）第13页，共48页，编辑于2022年，星期三 加硫酸铜加硫酸铜 作为催化剂。还可以作消化终点指作为催化剂。还可以作消化终点指示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、示剂（做蒸馏时碱性指示剂）。还可以加氧化汞、汞（均有毒，价格

10、贵）、硒粉、二氧化钛。汞（均有毒，价格贵）、硒粉、二氧化钛。加氧化剂加氧化剂 如双氧水、次氯酸钾等加速有机如双氧水、次氯酸钾等加速有机 物氧化速物氧化速度。度。第14页，共48页，编辑于2022年，星期三仪器：要防止仪器：要防止爆沸。爆沸。另外：介绍另外：介绍“自自动回流消化仪动回流消化仪”第15页，共48页，编辑于2022年，星期三（2 2）蒸馏蒸馏蒸馏蒸馏 消化液消化液消化液消化液+40%+40%氢氢氢氢氧化钠加热蒸馏，氧化钠加热蒸馏，氧化钠加热蒸馏，氧化钠加热蒸馏，放出氨气。放出氨气。放出氨气。放出氨气。第16页，共48页，编辑于2022年，星期三（3）吸收与滴定吸收与滴定用用4%硼酸吸

11、收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定，指示剂用混合指示剂（甲基红用混合指示剂（甲基红溴甲基酚绿混合指示剂）溴甲基酚绿混合指示剂）国标用亚甲基兰国标用亚甲基兰+甲基红。甲基红。指示剂指示剂 红色红色 绿色绿色 红色红色 （酸）（酸）（碱）（碱）（酸）（酸）用过量的用过量的 H2SO4 或或 HCl 标准溶液吸收，再用标准溶液吸收，再用 NaOH 标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。标准溶液滴定过剩的酸液，用甲基红指示剂。吸收吸收滴定滴定第17页，共48页，编辑于2022年，星期三 所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。消化时不要用强火，应保持和

12、缓沸腾，以免粘贴消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免粘贴在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下在凯氏瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。消化不完全而造成氮损失。3、注意事项：、注意事项：消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝消化时应注意不时转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下，并促进其消化完全。完全。完全。完全。第18页

13、，共48页，编辑于2022年，星期三 样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或加热，并时时摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入加入30过氧化氢过氧化氢 23 m1 后再继续加热消化。后再继续加热消化。若取样量较大，如干试样超过若取样量较大，如干

14、试样超过若取样量较大，如干试样超过若取样量较大，如干试样超过5 g 5 g 可按每克试样可按每克试样可按每克试样可按每克试样5 5 m1m1的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。的比例增加硫酸用量。第19页，共48页，编辑于2022年，星期三 般消化至呈透明后，继续消化般消化至呈透明后，继续消化30分钟即可，但对于分钟即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含赖氨酸、组含有特别难以氨化的氮化合物的样品如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但时间。有机

15、物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。含铁量多时，呈较深绿色。蒸馏装置不能漏气。蒸馏装置不能漏气。第20页，共48页，编辑于2022年，星期三 蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧蒸馏前若加碱量不足，消化液呈蓝色不生成氢氧化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。化铜沉淀，此时需再增加氢氧化钠用量。氢氧化铜在氢氧化铜在氢氧化铜在氢氧化铜在70709090时发黑。时发黑。时发黑。时发黑。蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离

16、液面清洗管口，蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸再蒸1分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。分钟后关掉热源否则可能造成吸收液倒吸。第21页，共48页，编辑于2022年，星期三二、二、微量凯氏定氮法微量凯氏定氮法1、原理及适用范围同前、原理及适用范围同前2、与常量法不同点：、与常量法不同点：加入硼酸量加入硼酸量有有50 ml 10 ml,滴定用盐酸浓度由滴定用盐酸浓度由0.1 mol/L 0.01 mol/L,可用微量滴定管。可用微量滴定管。3、蒸馏装置见下图、蒸馏装置见下图 。第22页，共48页，编辑于2022年，星期三第23页，共48页，编辑于2022年，星期三三、三、自动凯

17、氏定氮法自动凯氏定氮法1 1、原理及适用范围同前原理及适用范围同前 2 2、特点：特点：（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶，红外线加热的消化炉。热的消化炉。（2）快速：一次可同时消化）快速：一次可同时消化8个样品，个样品，30分钟可消化完分钟可消化完毕。毕。（3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定，自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，字显示装置。可计算总氮百分含量并记录，12分钟完分钟完成成1个样。个样。第24页，共48页，编辑于2022年，星期三第25页，共48页，编辑于2022年，星期三

18、二、双缩脲法二、双缩脲法 传传统统的的凯凯氏氏定定氮氮法法应应用用范范围围广广，灵灵敏敏度度高高、准准确确，不不要大仪器，但费时间，有环境污染。要大仪器，但费时间，有环境污染。新开发的：双缩脲法、新开发的：双缩脲法、紫外分光光度法、紫外分光光度法、染料结合法、染料结合法、水杨酸比色法等。水杨酸比色法等。第26页，共48页，编辑于2022年，星期三1.原理原理脲脲（尿尿素素）NH2CONH2 加加热热至至150160时时，两分子缩和成双缩脲。两分子缩和成双缩脲。双双缩缩脲脲能能和和硫硫酸酸铜铜的的碱碱性性溶溶液液生生成成紫紫色色络络和和物物，这这种种反应叫双缩脲反应。（缩二脲反应）反应叫双缩脲反

19、应。（缩二脲反应）蛋蛋白白质质分分子子中中含含有有肽肽键键 CONH 与与双双缩缩脲脲结结构构相相似似。在在同同样样条条件件下下也也有有呈呈色色反反应应，在在一一定定条条件件下下，其其颜颜色色深深浅浅与与蛋蛋白白质质含含量量成成正正比比，可可用用分分光光光光度度计计来来测测其其吸吸光光度度，确确定含量。（定含量。（560nm）NH2CONHCONH2 +NH3NH2CONH2+NH2CONH2第27页，共48页，编辑于2022年，星期三注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不注：测蛋白质时叫

20、双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化用消化用消化用消化2.方法特点及应用范围方法特点及应用范围本本法法灵灵敏敏度度较较低低，但但操操作作简简单单快快速速，故故在在生生物物化化学学领领域域中中测测定定蛋蛋白白质质含含量量时时常常用用此此法法。本本法法亦亦适适用用于于豆豆类类、油油料料、米米谷谷等作物种子及肉类等样品测定。等作物种子及肉类等样品测定。3.主要仪器：主要仪器：分光光度计，离心机（分光光度计，离心机（4000 r/min）4.试剂：试剂：(1)碱性硫酸铜溶液碱性硫酸铜溶液 (2)四氯化碳四氯化碳第28页，共48页，编辑于2022年，星期三5操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标操作

21、方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线准样绘标准曲线。三紫外吸收法三紫外吸收法 1 1原理：利用蛋白质的特有基团，原理：利用蛋白质的特有基团，R R（NHCH NHCHCOCO）对紫外光有吸收作用在对紫外光有吸收作用在280 nm280 nm下，吸光度与蛋白质浓下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。度成直线关系，求含量。第29页，共48页，编辑于2022年，星期三2 2适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。故在食品分析领域应用不广泛。3 3主要仪器：主要仪器：紫外分光光度计紫外分光光度计 离心机（

22、离心机（3000 5000 r/min3000 5000 r/min）4 4操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线操作：用凯氏法测定作标样做标准曲线第30页，共48页，编辑于2022年，星期三第五节第五节 氨基酸的定性测定氨基酸的定性测定利用各种显色反应利用各种显色反应第31页，共48页，编辑于2022年，星期三第六节第六节 氨基酸定量测定氨基酸定量测定一氨基酸的一般定量测定一氨基酸的一般定量测定一氨基酸的一般定量测定一氨基酸的一般定量测定（一）甲醛滴定法（一）甲醛滴定法（一）甲醛滴定法（一）甲醛滴定法 1.1.原理：氨基酸本身有碱性原理：氨基酸本身有碱性 NH NH2 2 基，又有基，又有 酸性

23、酸性 COOH COOH 基，成中性内盐，加入甲醛基，成中性内盐，加入甲醛 溶液后，与溶液后，与 NH NH2 2 结合，碱性消失，再用强结合，碱性消失，再用强碱来滴定碱来滴定 COOH COOH 基。基。2 2特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程特点：适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的中氮量减少情况等。（适于食品中游离氨基酸的测定）测定）第32页，共48页，编辑于2022年，星期三 3 3双指示剂：双指示剂：40%40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将氢氧化钠将40%40%甲

24、醛中和至蓝色。甲醛中和至蓝色。0.1%0.1%百里酚酞乙醇溶液，百里酚酞乙醇溶液，0.1%0.1%中性红中性红50%50%乙醇溶液，乙醇溶液，0.1 mol/L 0.1 mol/L 氢氧化钠标准溶液。氢氧化钠标准溶液。4 4操作：同时取两份样：操作：同时取两份样：+中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和 样液中其它酸性物质。样液中其它酸性物质。+百里酚酞百里酚酞+中性甲醛中性甲醛+NaOH+NaOH 滴，中和了滴，中和了 样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总 和。和。二者之差可计算氨基酸含量二者之差可计算氨基酸含量第33页，

25、共48页，编辑于2022年，星期三（二）茚三酮的比色法（二）茚三酮的比色法 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。颜色深浅与氨基酸含量蓝紫色化合物，可比色定量。颜色深浅与氨基酸含量成正比，最大吸收波长为成正比，最大吸收波长为570nm.570nm.（三）电位滴定法（三）电位滴定法第34页，共48页，编辑于2022年，星期三第七节第七节 氨基酸的分离与测定氨基酸的分离与测定 一薄层色谱法（薄层层析法（一薄层色谱法（薄层层析法（TLC TLC 法）法）Thin Layer ChromatographyThin Layer

26、Chromatography简介：简介：近年来发展起来的一种微量而快速的层析方近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。农药残留量、黄曲霉毒素等。第35页，共

27、48页，编辑于2022年，星期三（一）原理：（一）原理：（一）原理：（一）原理：取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，在溶剂系统中进行双向上行法展开，在溶剂系统中进行双向上行法展开，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层样品各组分在薄层样品各组分在薄层样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，

28、同一物质具有板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的相同的相同的相同的R Rf f值，不同成分则有不同的值，不同成分则有不同的值，不同成分则有不同的值，不同成分则有不同的R Rf f值，因而各种混合物值，因而各种混合物值，因而各种混合物值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的基酸进行对比，鉴别各种氨基酸

29、种类，从显色斑点颜色的基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。深浅可以大致确定其含量。深浅可以大致确定其含量。深浅可以大致确定其含量。第36页，共48页，编辑于2022年，星期三R Rf f=a/b=a/bab样点样点溶剂前沿溶剂前沿点样原点点样原点第37页，共48页，编辑于2022年，星期三优点：优点：展开时间短，一般在展开时间短，一般在20302030分钟，展开距离通常只需分钟，展开距离通常只需10 cm10 cm，且分离效果好。，且分离效果好。层析后得到的斑点小而清晰。层析后得到的斑点小而清晰。能够使用多种显色剂。能够使用多种显色剂。点样量少，灵敏度高。

30、（比纸层析高点样量少，灵敏度高。（比纸层析高1010010100倍）倍）精确到精确到0.01ug0.01ug。也可用于大量分离也可用于大量分离500 mg500 mg，作为样品制备层析。，作为样品制备层析。缺点：缺点：R Rf f值重现性比纸上层析差。值重现性比纸上层析差。分分类类：按按层层析析的的原原理理可可分分为为：吸吸附附、分分配配、离离子子交交换、凝胶等。换、凝胶等。第38页，共48页，编辑于2022年，星期三（三）操作方法：（三）操作方法：薄层板制备薄层板制备 样品液制备样品液制备 点样：距薄板底端点样：距薄板底端2cm2cm处，用针画一标记作为处，用针画一标记作为 原点。再以点样距

31、扳子宽窄可点几个点同时原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时 展开，点与点之间间隔展开，点与点之间间隔1 12cm2cm。a.a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注 意要等一个点干了再点另一个点。意要等一个点干了再点另一个点。b.b.用一小直径用一小直径3 mm 3 mm 滤纸片，浸入样液，埋到滤纸片，浸入样液，埋到 板子上先挖好一个小洞穴。板子上先挖好一个小洞穴。第39页，共48页，编辑于2022年，星期三 展展开开：点点样样完完了了，放放入入密密闭闭容容器器中中（展展开开槽槽），倾倾斜斜一一定定角角度度10103030，下下端端浸浸入入展展开开

32、剂剂1cm1cm，千千万万别别让让溶溶剂剂浸浸过过了了样样点点。到到离离顶顶端端一一部部分分，取取出出样样板板、晾晾干、显色。干、显色。a.a.展展开开剂剂的的有有关关情情况况：主主要要是是低低沸沸点点的的2 23 3种种有有机机溶溶剂剂组组成成的的溶溶剂剂系系统统，分分离离效效果果主主要要决决定定于于展展开开剂剂的的选选择择，因因为为吸吸附附剂剂在在一一定定情情况况下下是是恒恒定定的的，吸吸附附剂剂的的选选择余地远远小于展开剂的选择择余地远远小于展开剂的选择。第40页，共48页，编辑于2022年，星期三b.b.展开剂的选择方法：展开剂的选择方法：.微量圆环法。微量圆环法。.用小载波片试验，微

33、量展开剂展开用小载波片试验，微量展开剂展开5cm5cm。.图解法：图解法：样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。有机溶剂极性由小到大为：有机溶剂极性由小到大为：石石油油醚醚、环环己己烷烷、四四氯氯化化碳碳、三三氯氯乙乙烷烷、甲甲苯苯、苯苯、二二氯氯甲甲烷烷、氯氯仿仿、乙乙醚醚、乙乙酸酸乙乙酯酯、丙丙酮酮、正正丙丙醇醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。乙醇、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。第41页，共48页，编辑于2022年，星期三c.c.展开的方式：展开的方式：上

34、上行行法法、下下行行法法、双双向向展展开开、单单向向多多次次展展开开、双双向向多次展开。多次展开。双向展开：双向展开：第42页，共48页，编辑于2022年，星期三 显色：显色：a.a.喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。b.b.喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。c.c.将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。（涂板时把（涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中）荧光指示剂加入到固体吸附剂中）第43页，共48页，编辑于2022年，星期三定定性性：在在同同一一块块板板上上，

35、同同等等条条件件下下操操作作，被被测测样样与与标准样同时展开、显色，同标准样同时展开、显色，同 R Rf f 值即是；值即是；查手册找相同的查手册找相同的 R Rf f 值。值。定定量量：a.a.目目视视定定量量法法：以以标标准准斑斑点点对对照照，相相当当于于样样品斑点中含量品斑点中含量ugug数。数。b.b.斑点面积定量法。斑点面积定量法。c.c.将样点取下来，定容，离心，比色。将样点取下来，定容，离心，比色。d.d.利用薄层色谱扫描仪：利用薄层色谱扫描仪：例：日本岛津例：日本岛津 CS910 CS910 型双波长薄型双波长薄 层色谱扫描仪层色谱扫描仪 第44页，共48页，编辑于2022年，

36、星期三 介绍离心薄层色谱仪：介绍离心薄层色谱仪：介绍离心薄层色谱仪：介绍离心薄层色谱仪：1.LBG 1型离心薄层色谱仪型离心薄层色谱仪 北京产北京产2.7924型离心薄层色谱仪型离心薄层色谱仪 美国美国Harrison 公司研制公司研制3.CLC 5型离心制备液体色谱仪（日本日立公司，带紫型离心制备液体色谱仪（日本日立公司，带紫外检测器、记录器和自动收集器，制备量可达外检测器、记录器和自动收集器，制备量可达 10g。二氨基酸自动分析仪法二氨基酸自动分析仪法三气相色谱法三气相色谱法四高效液相色谱法四高效液相色谱法第45页，共48页，编辑于2022年，星期三第46页，共48页，编辑于2022年，星

37、期三10-3第47页，共48页，编辑于2022年，星期三第八章第八章 重点重点1.为什么说用凯氏定氮法测出的蛋白质只能称作粗蛋白？为什么说用凯氏定氮法测出的蛋白质只能称作粗蛋白？2.凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理？步骤和注意事项。凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理？步骤和注意事项。3.消化时加入消化时加入K2SO4和和 CuSO4的作用是什么？的作用是什么？4.蛋白质的结果计算为什么要乘上蛋白质换算系数？蛋白质的结果计算为什么要乘上蛋白质换算系数？6.25的系数的系数是怎么得到的？是怎么得到的？5.蛋白质蒸馏装置的水蒸气发生器中的水为何要调成酸性？蛋白质蒸馏装置的水蒸气发生器中的水为何要调成酸性？6.双缩脲法测定蛋白质的原理。双缩脲法测定蛋白质的原理。7.氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。8.简述茚三酮比色法测定蛋白质的原理。简述茚三酮比色法测定蛋白质的原理。第48页，共48页，编辑于2022年，星期三