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1、5、离子交换层析、离子交换层析优点优点：具有开放性支持骨架，具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大；吸附容量大；有亲水性有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件便可以洗，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件便可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活；脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活；多孔性，表面积大、交换容量大、回收率高多孔性，表面积大、交换容量大、回收率高，可用于分离和，可用于分离和制备。制备。（1 1）基本原理基本原理离子交换剂是由离子交换剂是由基质基质电荷基团（或功能基团）电荷基团（或功能基团）反离子反离子纤维素纤维素OCH2COO
2、Na+反离子反离子基质基质电荷基团电荷基团图图图图5 5羧甲基纤维素离子交换剂组成示意图羧甲基纤维素离子交换剂组成示意图羧甲基纤维素离子交换剂组成示意图羧甲基纤维素离子交换剂组成示意图每个分子能够和离子交换剂形成的每个分子能够和离子交换剂形成的静电键的数目静电键的数目 离子交换剂与生物大分子间的亲和力取决于离子交换剂与生物大分子间的亲和力取决于:由于不同蛋白质有不同的由于不同蛋白质有不同的pI，在同一，在同一pH下，各种蛋白质下，各种蛋白质所带的电荷种类和数量不同，因此与离子交换剂的吸附作用所带的电荷种类和数量不同，因此与离子交换剂的吸附作用的强弱不同，有些甚至完全不吸附。从而将有不同电荷的蛋
3、的强弱不同，有些甚至完全不吸附。从而将有不同电荷的蛋白质分开。然后通过改变缓冲液的盐浓度（离子强度）和白质分开。然后通过改变缓冲液的盐浓度（离子强度）和pH，用溶液中的离子置换吸附上的蛋白质，吸附力弱的先洗脱，用溶液中的离子置换吸附上的蛋白质，吸附力弱的先洗脱下来，吸附力强的后洗脱下来，从而使蛋白质混合物的组分下来，吸附力强的后洗脱下来，从而使蛋白质混合物的组分分开。分开。电荷数目多寡电荷数目多寡与分子中电荷的排布有关与分子中电荷的排布有关。1）吸附阶段：紧密吸附：紧密吸附：紧密吸附：紧密吸附：静电键的数目相当多，以致它们同时解离的概率为零。静电键的数目相当多，以致它们同时解离的概率为零。处于
4、此状态的物质，被吸附于柱顶而不下移。处于此状态的物质，被吸附于柱顶而不下移。有限吸附平衡：有限吸附平衡：有限吸附平衡：有限吸附平衡：静电键的数目较少，它们同时解离的概率达到一个静电键的数目较少，它们同时解离的概率达到一个有限值（有限值（0 1间）。只有在此范围内才能达到较高的分间）。只有在此范围内才能达到较高的分辨率。辨率。解吸状态：解吸状态：解吸状态：解吸状态：静电键数目极少，同时解离的概率为静电键数目极少，同时解离的概率为1，完全不吸附。，完全不吸附。2）洗脱（解吸附）阶段：洗脱方法洗脱方法增加缓冲液的离子强度增加缓冲液的离子强度改变改变pH，洗脱方式洗脱方式梯度洗脱：梯度洗脱：阶段洗脱：
5、阶段洗脱：（2）离子交换剂的分类和性质）离子交换剂的分类和性质离子交换剂应满足下列要求离子交换剂应满足下列要求离子交换剂应满足下列要求离子交换剂应满足下列要求：有高度的不溶性有高度的不溶性有疏松的多孔结构或巨大的表面积有疏松的多孔结构或巨大的表面积有较多的交换基团有较多的交换基团有稳定的物理化学性质有稳定的物理化学性质离子交换剂的分型离子交换剂的分型离子交换剂的分型离子交换剂的分型1 1）阳离子交换剂）阳离子交换剂）阳离子交换剂）阳离子交换剂磺酸基磺酸基团团（-OSO3H）甲基磺酸基甲基磺酸基团团（-O-CH2-SO3H）乙基磺酸基乙基磺酸基团团（-O-CH2-CH2-SO3H）强强阳离子交阳
6、离子交换剂换剂磷酸基磷酸基团团（-OPO3H2）亚亚磷酸基磷酸基团团（-OPO2H）中强中强阳离子交换剂阳离子交换剂酚酚羟羟基（基（-）羧羧酸（酸（-COOH）弱弱阳离子交换剂阳离子交换剂弱酸性：弱酸性：RCOOH+Na+RCOONa+H+强酸性：强酸性：RS03.H+Na+RS03.Na+H+弱碱性：弱碱性：RNH3+(OH)+Cl 某些交换反应如下：某些交换反应如下：强碱性：强碱性：RN+(CH3)3OH+Cl R N+(CH3)2Cl OH R NH3+Cl OH 2 2）阴离子交换剂）阴离子交换剂）阴离子交换剂）阴离子交换剂季胺季胺盐盐N+(CH3)3三乙基氨基乙基三乙基氨基乙基-O-
7、（CH2)2N+(C2H5)3强强阴阴离子交离子交换剂换剂叔胺叔胺N+H（CH3）2仲胺仲胺盐盐(N+H2CH3)伯胺伯胺盐盐（N+H3）二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基-O-(CH2)2-N+H(C2H5)2氨基乙基氨基乙基-O-(CH2)2N+H3弱弱阴离子交换剂阴离子交换剂离子交换剂离子交换剂离子交换剂离子交换剂根据化学性质分为三类：根据化学性质分为三类：根据化学性质分为三类：根据化学性质分为三类：由苯乙烯和二乙烯苯的共聚物作为骨架，再引入所需的酸性基团由苯乙烯和二乙烯苯的共聚物作为骨架，再引入所需的酸性基团或碱性基团。或碱性基团。例如聚苯乙烯磺化型离子交换树脂是由苯乙烯与二乙烯苯共聚和例如
8、聚苯乙烯磺化型离子交换树脂是由苯乙烯与二乙烯苯共聚和再磺化引入磺酸基合成。磺酸根连在树脂上，氢离子与磺酸再磺化引入磺酸基合成。磺酸根连在树脂上，氢离子与磺酸根的负电荷互相平衡，可与外来离子相互交换。根的负电荷互相平衡，可与外来离子相互交换。树脂离子交换剂：树脂离子交换剂：树脂离子交换剂：树脂离子交换剂：不适用于大分子的蛋白质分离纯化不适用于大分子的蛋白质分离纯化多用于小肽和氨基酸的分离纯化及无离子水的制备。多用于小肽和氨基酸的分离纯化及无离子水的制备。特点：特点：特点：特点：交联孔径小，吸附力太牢，要求洗脱条件剧烈交联孔径小，吸附力太牢，要求洗脱条件剧烈阳离子交换剂有阳离子交换剂有:羧甲基纤维
9、素（羧甲基纤维素（CM-纤维素），纤维素），阴离子交换剂有阴离子交换剂有:二乙基氨基乙基纤维素（二乙基氨基乙基纤维素（DEAE-纤维素）纤维素）纤维素离子交换剂：纤维素离子交换剂：纤维素离子交换剂：纤维素离子交换剂：是以微晶纤维素为基质，通过化学方法引入电荷基团构成的。是以微晶纤维素为基质，通过化学方法引入电荷基团构成的。离子交换纤维素分子上的羟基被离子基团取代。离子交换纤维素分子上的羟基被离子基团取代。特点：特点：特点：特点：对蛋白质的对蛋白质的交换容量大，结合力弱，交换容量大，结合力弱，洗脱条件缓和，洗脱条件缓和，因而是分离纯化生物活性大分子的理想的工具。因而是分离纯化生物活性大分子的理想
10、的工具。非特异性吸附少，非特异性吸附少，不易使蛋白质变性，不易使蛋白质变性，能引入大量活性基团而不破坏骨架能引入大量活性基团而不破坏骨架故交换容量很高故交换容量很高是是将将交交换换基基团团连连接接到到交交联联葡葡聚聚糖糖上上制制成成的的一一类类交交换换剂剂，因因而而既既具具有有离离子子交交换换作作用用，又又具具有有分分子子筛筛效效应应，是是一一类类广广泛泛应应用的色谱分离物质。用的色谱分离物质。交联葡聚糖离子交换剂：交联葡聚糖离子交换剂：交联葡聚糖离子交换剂：交联葡聚糖离子交换剂：特点：特点：特点：特点：阳离子交换剂有阳离子交换剂有:SE-Sephadex(强强)CM-Sephadex(弱弱)
11、阴离子交换剂有阴离子交换剂有：QAE-Sephadex(强强)DEAE-Sephadex（弱）弱）表表表表7-6 7-6 7-6 7-6 一些常用的纤维素离子交换剂和一些常用的纤维素离子交换剂和一些常用的纤维素离子交换剂和一些常用的纤维素离子交换剂和SephadexSephadexSephadexSephadex离子交换剂离子交换剂离子交换剂离子交换剂离子交换剂离子交换剂可电离基团可电离基团I、阳离子交换剂、阳离子交换剂CM-纤维素（弱酸型）纤维素（弱酸型）羧甲基羧甲基P-纤维素（中强酸型）纤维素（中强酸型）磷酸基磷酸基SE-纤维素（强酸型）纤维素（强酸型）磺乙基磺乙基SP-Sephadex(
12、强酸型强酸型)磺丙基磺丙基II、阴离子交换剂、阴离子交换剂AE-纤维素（弱碱型）纤维素（弱碱型）氨基乙基氨基乙基PAB-纤维素（弱碱型）纤维素（弱碱型）对氨基苯甲基对氨基苯甲基DEAE-纤维素（中强碱型）纤维素（中强碱型）二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex（中强碱型）（中强碱型）二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基TEAE-纤维素（强碱型）纤维素（强碱型）三乙基氨基乙基三乙基氨基乙基QAE-Sephadex（强碱型）（强碱型）二乙基（二乙基（2-羟丙基）羟丙基）-氨基乙基氨基乙基指指单位重量交换剂中可解离基团的数量单位重量交换剂中可解离基团的数量，是离子交换剂的特性，是离子交换剂的
13、特性常用单位重量或单位容积交换剂的能交换的毫克当量离子来表示；常用单位重量或单位容积交换剂的能交换的毫克当量离子来表示；交换容量交换容量交换容量交换容量影响交换容量的因子：影响交换容量的因子：影响交换容量的因子：影响交换容量的因子：筛孔筛孔离子强度离子强度pH（3）离子交换层析条件的选择）离子交换层析条件的选择 1 1）离子交换剂的选择）离子交换剂的选择）离子交换剂的选择）离子交换剂的选择交换容量是提供交换离子的量度，是选用交换剂数量的交换容量是提供交换离子的量度，是选用交换剂数量的重要参考依据。重要参考依据。选用何种交换剂还要根据被分离的物质选用何种交换剂还要根据被分离的物质所带电荷所带电荷
14、、分子分子大小大小，及，及是否耐酸碱是否耐酸碱等对离子交换剂进行选择。等对离子交换剂进行选择。阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择 当当pHpI时时,应选择阴离子交换剂；应选择阴离子交换剂；如果被分离物质为两性离子，则一般应根据其在稳定的如果被分离物质为两性离子，则一般应根据其在稳定的pH范范围内所带电荷来选择交换剂。围内所带电荷来选择交换剂。例如，例如，一蛋白质的一蛋白质的pI为为5若该物质在若该物质在pH58稳定时，则应选择阴离子交换剂；稳定时，则应选择阴离子交换剂；若该物质在若该物质在pH5以下稳定时，则可选择阳离子交换剂。以下稳定时，
15、则可选择阳离子交换剂。对于已知等电点的物质对于已知等电点的物质在中性或偏碱性的条件下进行电泳，在中性或偏碱性的条件下进行电泳，向阳极移动较快向阳极移动较快的物质，在同样条件下可被的物质，在同样条件下可被阴离子交换剂吸附阴离子交换剂吸附；向阴极移动向阴极移动或向阳极移动较慢的，可被或向阳极移动较慢的，可被阴离子交换剂吸附阴离子交换剂吸附。对于未知等电点的物质对于未知等电点的物质可参照电泳的结果可参照电泳的结果阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择阴、阳离子交换剂的选择强、弱离子交换剂的选择强、弱离子交换剂的选择强、弱离子交换剂的选择强、弱离子交换剂的选择强性离子交换剂
16、强性离子交换剂强性离子交换剂强性离子交换剂:应用范围广，但选择性低应用范围广，但选择性低，所以常用它来制备，所以常用它来制备无离子水和分离一些在极端无离子水和分离一些在极端pH溶液中解离且较稳定的溶液中解离且较稳定的物质。比如简单的、复杂的、无机的及有机的阳离子物质。比如简单的、复杂的、无机的及有机的阳离子都可与强酸性阳离子交换。都可与强酸性阳离子交换。弱性离子交换剂弱性离子交换剂弱性离子交换剂弱性离子交换剂选择性较高，适用的选择性较高，适用的pH范围较窄，这种离子交范围较窄，这种离子交换剂在换剂在pH为中性的溶液中交换容量也高，为中性的溶液中交换容量也高，用它分离生用它分离生命大分子物质时，
17、其活性不易丧失。所以，分离生物命大分子物质时，其活性不易丧失。所以，分离生物样品习惯采用弱性离子交换剂样品习惯采用弱性离子交换剂为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，为了提高交换容量，一般应选择结合力较小的反离子。据此，强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择强阳性和强阴性离子交换剂应分别选择H型和型和0H型；型；弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择弱酸性和弱碱性离子交换剂应分别选择Na型和型和Cl型。型。不同离子型交换剂的选择不同离子型交换剂的选择不同离子型交换剂的选择不同离子型交换剂的选择离子交换剂处于电中性时往往带有一定的反离子。离子交换剂处于电中性时往往带有一定的反离子。如如阳
18、离子交换剂的反离子阳离子交换剂的反离子可以是可以是H+(称称H型）型）Na+（称（称Na型）型）NH4+等等树脂树脂基质是疏水性化合物基质是疏水性化合物而而纤维素纤维素、葡聚糖葡聚糖和和琼脂糖琼脂糖基质则是亲水性化合物。基质则是亲水性化合物。不同基质离子交换剂的选择不同基质离子交换剂的选择不同基质离子交换剂的选择不同基质离子交换剂的选择在在分分离离生生命命大大分分子子物物质质时时，一一般般认认为为后后三三种种基基质质(亲亲水水性性化化合合物物)比比前前一一种种基基质质(疏疏水水性性化化合合物物)更更为为优优越越。由由于于后后三三种种是是亲亲水水性性的的，且且对对生生命命大大分分子子物物质质的的
19、吸吸附附和和洗洗脱脱都都比比前前者者温温和和，所所以以采采用用后后者者基基质质制制成成的的离离子子交交换换剂剂，被被分分离离物物质质活活性性不不易易受受到破坏。到破坏。如选用如选用阴离子交换剂阴离子交换剂,pH值一般比有效成分的值一般比有效成分的pI值高一个单位值高一个单位;选用选用阳离子交换剂阳离子交换剂,pH值一般比有效成分的值一般比有效成分的pI值低一个单位值低一个单位;离子强度为离子强度为0.1时时，就能很快把有效成分与杂质分开。，就能很快把有效成分与杂质分开。2 2）缓冲液的选择）缓冲液的选择）缓冲液的选择）缓冲液的选择 选用的起始缓冲液选用的起始缓冲液选用的起始缓冲液选用的起始缓冲
20、液其其pH值和离子强度等能使样品中有效成分与离子交换剂结值和离子强度等能使样品中有效成分与离子交换剂结合，而不能使样品中杂质与离子交换剂结合合，而不能使样品中杂质与离子交换剂结合.其离子强度和其离子强度和pH值应使有效成分从离子交换剂上解离下来，值应使有效成分从离子交换剂上解离下来，一般离子强度要比起始缓冲液高一般离子强度要比起始缓冲液高，pH值是随着离子交换剂性值是随着离子交换剂性质变化而变化。质变化而变化。选用的洗脱液选用的洗脱液选用的洗脱液选用的洗脱液缓冲液选择的关键在于缓冲液选择的关键在于:了解有效成分的等电点。了解有效成分的等电点。A、取、取10支支1.5ml试管，在各管中加入试管，
21、在各管中加入0.1gSephadex或或1.5mlSepharose（或（或Sephacel）离子交换剂离子交换剂B、用不同、用不同pH值值0.5molL缓冲液分别洗涤缓冲液分别洗涤10次次（阴离子交换剂选（阴离子交换剂选pH59，阳阳离子选离子选pH48，配方见表配方见表5-8)C、用不同用不同pH值值0.05molL（对（对Sephadex)或或0.01molL（对（对Sepharose或或Sephacel）缓冲液（各管缓冲液（各管PH值仍与洗涤液相同）平衡值仍与洗涤液相同）平衡5次（每次洗涤、平次（每次洗涤、平衡的上清液均可用倾斜法或离心法除去，但最后一次应采用离心法除去，衡的上清液均可
22、用倾斜法或离心法除去，但最后一次应采用离心法除去，试管间操作要尽量一致）试管间操作要尽量一致）初步选择缓冲液（初步选择缓冲液（初步选择缓冲液（初步选择缓冲液（pHpH值）的简便方法值）的简便方法值）的简便方法值）的简便方法：D、同样量的待分离样品加到管中，缓慢混合同样量的待分离样品加到管中，缓慢混合510min，静止沉淀静止沉淀E、测定各管有效成分的含量、绘制出相应图谱（见图测定各管有效成分的含量、绘制出相应图谱（见图5-9A）。）。最适最适pH(7.0)的选择的选择在在pH7.0以上的缓冲液中，有效成分全部被吸附了。以上的缓冲液中，有效成分全部被吸附了。因此，起始缓冲液（即样品的溶解液和层析
23、柱的平衡液）因此，起始缓冲液（即样品的溶解液和层析柱的平衡液）pH可选可选用用7.0。在各管中加入不同离子强度的缓冲液，经过洗涤、平衡、加样、测定在各管中加入不同离子强度的缓冲液，经过洗涤、平衡、加样、测定含量，即可绘制出相应的图谱（见图含量，即可绘制出相应的图谱（见图5-9B）。）。当离子强度当离子强度()0.3mol/L)时盐浓度的选择时盐浓度的选择起始缓冲液和限制性缓冲液（洗脱液）离子强度的确定起始缓冲液和限制性缓冲液（洗脱液）离子强度的确定起始缓冲液和限制性缓冲液（洗脱液）离子强度的确定起始缓冲液和限制性缓冲液（洗脱液）离子强度的确定在在10支盛离子交换剂的试管中，先用相同缓冲液进行充
24、分洗涤、平支盛离子交换剂的试管中，先用相同缓冲液进行充分洗涤、平衡，然后按总交换容量的百分数，分别加入不同量的样品液，吸附毕，衡，然后按总交换容量的百分数，分别加入不同量的样品液，吸附毕，取上清液测定待分离物的含量，并绘制相应图谱（见图取上清液测定待分离物的含量，并绘制相应图谱（见图59C）。）。从图看出，离子交换剂的总交换容量达从图看出，离子交换剂的总交换容量达40时，其吸附力已呈饱和时，其吸附力已呈饱和状态。这表明该交换剂中加入样品液的最大量为总交换容量的状态。这表明该交换剂中加入样品液的最大量为总交换容量的40。3 3）加样量的确定）加样量的确定）加样量的确定）加样量的确定在在pH7.0
25、0.1mol/L盐浓度时盐浓度时,最佳操作容量最佳操作容量(总交换量的总交换量的40%)的选择的选择五、亲和层析五、亲和层析可对天然生物活性物质进行高特异性的分离和纯化。可对天然生物活性物质进行高特异性的分离和纯化。（一）基本原理（一）基本原理抗原和抗体抗原和抗体激素和受体激素和受体酶和底物及辅酶酶和底物及辅酶酶和抑制剂酶和抑制剂酶和调节效应物酶和调节效应物RNA和其互补的和其互补的DNA等等生物分子之间这种特异的结合能力称为生物分子之间这种特异的结合能力称为亲和力亲和力。利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法利用对配体的特异生物学亲和力的纯化方法利用对配
26、体的特异生物学亲和力的纯化方法优点优点:亲和层析的过程亲和层析的过程亲和层析的过程亲和层析的过程配基固相化：配基固相化：将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶水不溶 性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称性载体上，制成亲和吸附剂后装柱（称亲和柱）。亲和柱）。亲亲和和吸吸附附：将将含含有有纯纯化化对对象象的的混混合合物物通通过过亲亲和和柱柱，纯纯化化对对象象吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。吸附在柱上，其他物质流出色谱柱。解吸附解吸附:用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的欲纯化物质洗脱出来。和柱上的欲纯
27、化物质洗脱出来。亲和层析中两个进行专一结合的分子互称对方为亲和层析中两个进行专一结合的分子互称对方为配基配基。（二）固定相（二）固定相亲和层析固定相是由三部分构成亲和层析固定相是由三部分构成基体（基体（Matrix）间隔臂（间隔臂（Spacer-Arm）配位体（配位体（Ligand）理想的基质应满足下面的要求：理想的基质应满足下面的要求：理想的基质应满足下面的要求：理想的基质应满足下面的要求：1、极低的非特异吸附性。、极低的非特异吸附性。2、高度的亲水性。、高度的亲水性。3、较好的理化稳定性。、较好的理化稳定性。4、大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合；、大量的化学基团能被有效地活
28、化，而且容易和配体结合；5、适当的多孔性（即孔径大小和筛孔多少）。、适当的多孔性（即孔径大小和筛孔多少）。1 1、基体的选择、基体的选择、基体的选择、基体的选择 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶多孔玻璃珠多孔玻璃珠琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 (1)具有稳定的物理化学性质具有稳定的物理化学性质(2)均均匀匀、多多孔孔的的网网状状结结构构，允允许大分子物质自由通透许大分子物质自由通透(3)流动性好流动性好(4)非特异性吸附少非特异性吸附少常用的基质常用的基质常用的基质常用的基质优点优点 最常用的活化方法是最常用的活化方法是最常用的活化方法是最常用的活化方法是:用溴化氰活化琼脂糖用溴化氰活
29、化琼脂糖，配配体体-NH2如：如：CH-CH-SepharoseSepharose 4B 4B带有一个六碳长的臂有活性的末端羧基；带有一个六碳长的臂有活性的末端羧基；环氧活化的环氧活化的SepharoseSepharose 6B 6B的臂上带有一个活化的酯基；的臂上带有一个活化的酯基；AH-AH-SepharoseSepharose 4B 4B的臂末端带有一个氨基的臂末端带有一个氨基 CDCD1 1-Agarose-Agarose含有含有N-N-氨基甲酸烷基酯氨基甲酸烷基酯首首先先把把适适当当长长度度的的氨氨基基化化合合物物共共价价结结合合到到用用溴溴化化氰氰活活化化的的琼脂糖上。制成稳定的衍
30、生物琼脂糖上。制成稳定的衍生物构成构成构成构成“手臂手臂手臂手臂”最多的方法是最多的方法是最多的方法是最多的方法是将琼脂衍生物与将琼脂衍生物与溴乙酰衍生物溴乙酰衍生物或或琥珀酸酐琥珀酸酐等化合物反应后，等化合物反应后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基团的化合物反应，即可生再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基团的化合物反应，即可生成一系列具有长短不等成一系列具有长短不等“手臂手臂”的亲和吸附剂，这对增加配的亲和吸附剂，这对增加配体与分离物之间的操作容量、提高分离效果是有益的。体与分离物之间的操作容量、提高分离效果是有益的。常用的氨基化合物常用的氨基化合物1,6-己二胺己二胺6-氨基己酸氨基己酸在水溶性的
31、在水溶性的碳化二亚胺碳化二亚胺存在下，这种衍生物极易与含羧基存在下，这种衍生物极易与含羧基或氨基的任何化合物结合成固相载体。或氨基的任何化合物结合成固相载体。例例如如用用对对氨氨基基苯苯-D-硫硫代代吡吡喃喃半半乳乳糖糖苷苷作作为为配配体体纯纯化化-半半乳乳糖糖苷苷酶酶时，时，如如果果把把配配体体直直接接连连于于sepharose4B上上所所产产生生的的衍衍生生物物A，则则不不能能吸吸附附半乳糖苷酶。半乳糖苷酶。而而当当sepharose上上引引入入氨氨乙乙基基乙乙酰酰胺胺或或引引入入3,3-二二氨氨基基二二丙丙胺胺琥琥珀珀酰酰胺胺再接配体时，所产生的衍生物再接配体时，所产生的衍生物B和和C都
32、能吸附都能吸附-半乳糖苷酶半乳糖苷酶2 2、配体的选择、配体的选择、配体的选择、配体的选择抑制剂抑制剂效应物效应物酶的辅助因子酶的辅助因子类似底物类似底物抗体抗体 包括半抗原包括半抗原(碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸碱基、核苷、核苷酸、寡核苷酸)-蛋白质复蛋白质复合物抗体合物抗体其他物（如外源凝集素、其他物（如外源凝集素、polyA、polyU、染料和金属离子）染料和金属离子）等。等。可选择的配体有可选择的配体有 例如，用例如，用抗生物素蛋白抗生物素蛋白（也称亲和素）作为配体纯化（也称亲和素）作为配体纯化含有生物素含有生物素的羟化酶的羟化酶时，由于抗生物素蛋白（时，由于抗生物素蛋白（avidin
33、）-生物素（生物素（biotin）解解离常数接近离常数接近11015mol，要使它们分离必须用剧烈的条件。即要使它们分离必须用剧烈的条件。即6molL盐酸胍溶液，盐酸胍溶液，pH1.5，才能解吸出羧化酶，而在此条件才能解吸出羧化酶，而在此条件下，羧化酶的活性大部分不可逆地丧失了下，羧化酶的活性大部分不可逆地丧失了.一般要求配体和大分子物质的解离常数为一般要求配体和大分子物质的解离常数为510 310 8mol/L。配体须具备两个条件：配体须具备两个条件：配体须具备两个条件：配体须具备两个条件：(1)与被分离的物质有适当的亲和力，与被分离的物质有适当的亲和力，进行特异的和可逆的结合。进行特异的和
34、可逆的结合。(2)具有与基质共价结合的基团具有与基质共价结合的基团表表表表7-2 7-2 构成固相载体的某些基质和配体构成固相载体的某些基质和配体构成固相载体的某些基质和配体构成固相载体的某些基质和配体I 酶酶醛氧化酶醛氧化酶 琼脂糖琼脂糖 N-苯甲基苯甲基-6-甲基菸酰胺甲基菸酰胺胺肽酶胺肽酶 琼脂糖琼脂糖 环六亚甲基二胺环六亚甲基二胺天冬氨酸转氨酶天冬氨酸转氨酶 琼脂糖琼脂糖 5-磷酸盐吡哆醛磷酸盐吡哆醛菠萝蛋白酶菠萝蛋白酶 琼脂糖琼脂糖 -氨基乙酰基氨基乙酰基-D-色氨酸甲基酯色氨酸甲基酯羧肽酶羧肽酶A 琼脂糖琼脂糖 L-酪氨酪氨酰酰-D-色氨酸色氨酸 琼脂糖琼脂糖 D-色氨酸色氨酸 纤
35、维素纤维素 甘氨酰甘氨酰-D-苯丙氨酸苯丙氨酸DNase Agarose DNADNA聚合酶聚合酶 丙烯酰胺丙烯酰胺 DNA3-磷酸甘油醛脱氢酶磷酸甘油醛脱氢酶 琼脂糖琼脂糖 NAD3-磷酸甘油脱氢酶磷酸甘油脱氢酶 琼脂糖琼脂糖 3-磷酸甘油磷酸甘油糖苷酶糖苷酶 琼脂糖琼脂糖 糖苷糖苷胃蛋白酶胃蛋白酶 琼脂糖琼脂糖 Poly-L-赖氨酸赖氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸tRNA连接酶连接酶 琼脂糖琼脂糖 苯丙氨酸苯丙氨酸磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶 琼脂糖琼脂糖 Cibacron blue T3GA丙酮酸激酶丙酮酸激酶 Sephadex Cibacron blue T3GA凝血酶凝血酶 琼脂糖琼脂糖 4-Ch
36、lorobenzoyl amide 琼脂糖琼脂糖 苯甲脒苯甲脒胰蛋白酶胰蛋白酶 琼脂糖琼脂糖 卵类黏蛋白酶卵类黏蛋白酶 纤维素纤维素 4-苯甲脒苯甲脒 共聚物乙基顺丁烯二酸酐共聚物乙基顺丁烯二酸酐 胰蛋白酶和胰舒血管素的抑制剂胰蛋白酶和胰舒血管素的抑制剂分离物分离物 基质基质 配体配体表表表表7-2 7-2 构成固相载体的某些基质和配体构成固相载体的某些基质和配体构成固相载体的某些基质和配体构成固相载体的某些基质和配体II其他其他脂肪细胞脂肪细胞琼脂糖琼脂糖胰岛素胰岛素白蛋白白蛋白琼脂糖琼脂糖脂肪酸脂肪酸抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶琼脂糖琼脂糖伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶琼脂糖琼脂糖胰
37、蛋白酶胰蛋白酶绒膜促性腺激素绒膜促性腺激素琼脂糖琼脂糖伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白刺激卵泡的激素刺激卵泡的激素琼脂糖琼脂糖伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白糖蛋白糖蛋白琼脂糖琼脂糖伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白肝炎肝炎-抗原抗原琼脂糖琼脂糖伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白干扰素干扰素琼脂糖或琼脂糖或Sepharose抗体或抗体或poly(U)外源凝集素外源凝集素任意选任意选糖蛋白和多糖糖蛋白和多糖细胞膜细胞膜琼脂糖琼脂糖葡萄糖葡萄糖促黄体发生激素促黄体发生激素琼脂糖琼脂糖伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白磷壁（酸）质磷壁（酸）质伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白分离物分离物 基质基质 配体配体表表表表7-2 7-2
38、构成固相载体的某些基质和配体构成固相载体的某些基质和配体构成固相载体的某些基质和配体构成固相载体的某些基质和配体III核酸核酸DNA琼脂糖琼脂糖染料（孔雀绿或苯基中性红）染料（孔雀绿或苯基中性红）DNA或或RNA硅藻土硅藻土甲基化白蛋白甲基化白蛋白Hg或或SH-RNA琼脂糖琼脂糖Hg或或SH-mRNA纤维素或琼脂糖纤维素或琼脂糖OligodT或或polyA等等变性单链变性单链DNA（即基因片段）琼脂糖即基因片段）琼脂糖cDNA分离物分离物 基质基质 配体配体把配体偶联到基质上的方法有：把配体偶联到基质上的方法有：把配体偶联到基质上的方法有：把配体偶联到基质上的方法有：物理物理化学化学包埋法包埋
39、法吸附法吸附法交联法交联法偶联法偶联法双功能试剂（如戊二醛、碳化二亚胺等）双功能试剂（如戊二醛、碳化二亚胺等）溴化氰（溴化氰（CNBr）、）、环氧氯丙烷、环氧氯丙烷、双环氧乙烯、双环氧乙烯、丁二烯砜丁二烯砜亚氨二乙酸等亚氨二乙酸等适用于含氨基的配体，适用于含氨基的配体，适用于无机分子的配体适用于无机分子的配体如金属等如金属等 分离、纯化的对象皆为分离、纯化的对象皆为（四）流动相（四）流动相（四）流动相（四）流动相其中大多数为极性化合物，不少还具有生物活性。其中大多数为极性化合物，不少还具有生物活性。因因此此，当当从从固固定定相相上上将将它它们们洗洗脱脱下下来来时时，需需使使用用pH值值接接近近
40、于于中中性性的的稀稀缓缓冲冲溶液，在比较温和的洗脱条件下洗脱，保持其生物活性。溶液，在比较温和的洗脱条件下洗脱，保持其生物活性。氨基酸氨基酸多肽多肽蛋白质蛋白质核苷核苷核苷酸核苷酸寡聚和多聚核苷酸寡聚和多聚核苷酸核糖核酸核糖核酸酶酶辅酶辅酶寡糖寡糖多糖等生物分子，多糖等生物分子，（五）亲和层析的主要应用（五）亲和层析的主要应用（五）亲和层析的主要应用（五）亲和层析的主要应用纯化大分子物质纯化大分子物质研究酶的结构与功能研究酶的结构与功能1、抗体、抗原及其结合物、抗体、抗原及其结合物用于纯化抗体、抗原及其结合物的配体主要有抗原（纯化抗体）、抗体（纯用于纯化抗体、抗原及其结合物的配体主要有抗原（纯
41、化抗体）、抗体（纯化抗原）和金黄色葡萄球菌蛋白化抗原）和金黄色葡萄球菌蛋白A（StaphylococcalproteinA.SPA)等物质。等物质。由于由于SPA能与免疫球蛋白能与免疫球蛋白G（IgG）结合。因此利用结合。因此利用SPASepharoseCL-4B固相固相载体可以分离载体可以分离IgG、抗原和免疫复合物。抗原和免疫复合物。2、糖蛋白、糖蛋白 目前用于纯化糖蛋白的配体主要是凝聚素（目前用于纯化糖蛋白的配体主要是凝聚素（lectin）,不同的凝聚素结合糖蛋不同的凝聚素结合糖蛋白的类型不同白的类型不同如如：伴刀豆球蛋白：伴刀豆球蛋白能束缚含能束缚含-D-吡喃甘露糖苷或吡喃甘露糖苷或-
42、D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白。吡喃葡萄糖苷的糖蛋白。而而云扁豆（云扁豆（Lenlil）凝聚素凝聚素结合甲状腺球蛋白的能力比结合甲状腺球蛋白的能力比Con.A(Con.A(伴刀豆球蛋白）强伴刀豆球蛋白）强 因此，可用不同的因此，可用不同的lectin-Sepharose 4B固相固相载体分离各种糖蛋白。载体分离各种糖蛋白。反过来，用糖蛋白（如卵清蛋白、猪甲状腺球蛋白、牛下颌黏蛋白等）作为反过来，用糖蛋白（如卵清蛋白、猪甲状腺球蛋白、牛下颌黏蛋白等）作为配体制成的固相载体可以分离各种凝聚素。配体制成的固相载体可以分离各种凝聚素。3含硫基蛋白含硫基蛋白 用活化的巯基用活化的巯基-Sepharose 4B
43、(低容量的衍生物）或巯基丙酰低容量的衍生物）或巯基丙酰（Thiopropyl）-Sepharose 6B（高容量的衍生物）和高容量的衍生物）和Hg-Sepharose 4B 吸附剂可以分离含巯基的蛋白质、酶、肽以及汞化或巯基化的核苷酸。吸附剂可以分离含巯基的蛋白质、酶、肽以及汞化或巯基化的核苷酸。4核酸核酸用用poly(U)-Sepharose吸附剂可以分离吸附剂可以分离mRNA；用用poly（A）-Sepharose4B吸附剂可以分离很多物质，如吸附剂可以分离很多物质，如用用Lysine-Sepharose 4B吸附剂还可以分离吸附剂还可以分离rRNA、双链、双链DNA 和和血纤维蛋白溶酶原
44、等物质。血纤维蛋白溶酶原等物质。束缚束缚mRNA的蛋白质的蛋白质束缚束缚Poly（A）的）的RNA病毒病毒RNA依赖于依赖于DNA的的RNA聚合酶聚合酶抗核酸的抗体等；抗核酸的抗体等；5、其他、其他 上述的应用事例都是用特异物质（作配体）与基质结合制成的上述的应用事例都是用特异物质（作配体）与基质结合制成的吸附剂来分离有效成分的。还有一种情况则是直接用基质与某些吸附剂来分离有效成分的。还有一种情况则是直接用基质与某些化合物之间存在束缚力的特性来分离有效成分的，如用葡聚糖凝化合物之间存在束缚力的特性来分离有效成分的，如用葡聚糖凝胶和酸化的琼脂糖凝胶可以分离凝集素（见图胶和酸化的琼脂糖凝胶可以分离
45、凝集素（见图7-14)6、研究酶的结构与功能、研究酶的结构与功能 在进行酶的结构与功能研究时，经常使用专一的化学试剂改变在进行酶的结构与功能研究时，经常使用专一的化学试剂改变酶的功能团酶的功能团.这种操作往往会引起酶活力的不完全丧失，但是难以这种操作往往会引起酶活力的不完全丧失，但是难以确定具有的酶活力是代表残留的天然酶活力？还是化学试剂作用确定具有的酶活力是代表残留的天然酶活力？还是化学试剂作用后酶的催化能力变小了？这就须将具有生物活性的和失去活性的后酶的催化能力变小了？这就须将具有生物活性的和失去活性的蛋白质分开后，进行活力检测才能确定。但是，它们之间的分离蛋白质分开后，进行活力检测才能确
46、定。但是，它们之间的分离是比较困难的。然而，亲和层析法是可以解决这一问题的。是比较困难的。然而，亲和层析法是可以解决这一问题的。例如，葡萄球菌核酸酶经亲和标记物标记后，证明该标记物与例如，葡萄球菌核酸酶经亲和标记物标记后，证明该标记物与酶活性中心的酪氨酸结合，可导致酶活力丧失酶活性中心的酪氨酸结合，可导致酶活力丧失83，剩余酶活，剩余酶活力力17。这究竟是核酸酶的活性中心被结合后仍有。这究竟是核酸酶的活性中心被结合后仍有17的酶活的酶活力力?还是因为有少量的核酸未标记上而残存酶活力？这是用一还是因为有少量的核酸未标记上而残存酶活力？这是用一般分离方法无法解决的。而用高专一性的亲和层析法则是容易般分离方法无法解决的。而用高专一性的亲和层析法则是容易解决的。因为失去活性中心的核酸酶与亲和吸附剂是无亲和力解决的。因为失去活性中心的核酸酶与亲和吸附剂是无亲和力的，可直接通过柱子流出。而天然酶却与亲和吸附剂有亲和力的，可直接通过柱子流出。而天然酶却与亲和吸附剂有亲和力（即两者可形成一种复合物），须用特殊洗脱剂才能洗出。（即两者可形成一种复合物），须用特殊洗脱剂才能洗出。