植物组织培养基本操作.ppt

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1、2 2植物组织培养基本操作植物组织培养基本操作目的与要求目的与要求目的与要求目的与要求 了解植物组织培养的培养基种类、成分及其特点，了解植物组织培养的培养基种类、成分及其特点，了解植物组织培养的培养基种类、成分及其特点，了解植物组织培养的培养基种类、成分及其特点，学习植物组织培养基本操作，了解离体培养环境条学习植物组织培养基本操作，了解离体培养环境条学习植物组织培养基本操作，了解离体培养环境条学习植物组织培养基本操作，了解离体培养环境条件，以及炼苗移栽基本方法。件，以及炼苗移栽基本方法。件，以及炼苗移栽基本方法。件，以及炼苗移栽基本方法。具有植物组织培养基本操作程序的认知。能够识具有植物组织培

2、养基本操作程序的认知。能够识具有植物组织培养基本操作程序的认知。能够识具有植物组织培养基本操作程序的认知。能够识别各类培养基特点，熟悉别各类培养基特点，熟悉别各类培养基特点，熟悉别各类培养基特点，熟悉MSMSMSMS培养基成分；具有制培养基成分；具有制培养基成分；具有制培养基成分；具有制作培养基能力，具有选择外植体、表面灭菌、无菌作培养基能力，具有选择外植体、表面灭菌、无菌作培养基能力，具有选择外植体、表面灭菌、无菌作培养基能力，具有选择外植体、表面灭菌、无菌接种等基本能力；具有植物组织培养条件控制基本接种等基本能力；具有植物组织培养条件控制基本接种等基本能力；具有植物组织培养条件控制基本接种

3、等基本能力；具有植物组织培养条件控制基本能力；有进行组培苗驯化练苗的基本能力。能力；有进行组培苗驯化练苗的基本能力。能力；有进行组培苗驯化练苗的基本能力。能力；有进行组培苗驯化练苗的基本能力。第一节第一节 培培养养基成分、种类及特点基成分、种类及特点 第二节第二节 培养基的制备培养基的制备 第三节第三节 外植体无菌接种外植体无菌接种 第四节第四节 外植体培养外植体培养 第五节第五节 试管苗的驯化与移栽试管苗的驯化与移栽组织培养步骤图组织培养步骤图（1 1）准备阶段）准备阶段 查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制定出切实可行的培养

4、方案。实际制定出切实可行的培养方案。根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段根据实验方案配制适当的化学消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。所需的培养基，并经高压灭菌或过滤除菌后备用。（2 2）外植体的选择与消毒）外植体的选择与消毒 选择合适的部位作为外植体，采回后经过处理，然后进选择合适的部位作为外植体，采回后经过处理，然后进行消毒处理。行消毒处理。将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大小的小块，或剥离出茎尖、挑出花药，接种到启动培养基上。或剥离出茎尖、挑出花药，接种到启动培养基上。（3 3）启动培养）启

5、动培养 接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋外植体中已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋芽直接萌发形成芽。芽直接萌发形成芽。将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原基或形成胚状体，最后发育形成再生植株。或形成胚状体，最后发育形成再生植株。（4 4）增殖培养）增殖培养 分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的增殖培分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的增殖培养基经反复多次切割转接。养基经反复多次切割转接。当芽苗繁殖到一定数量后，再将一

6、部分用于壮苗生根，当芽苗繁殖到一定数量后，再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的还要进行病另一部分保存或继续扩繁。进行脱毒苗培养的还要进行病毒检测。毒检测。（5 5）生根培养）生根培养 刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降低或不加细胞分裂素浓度，提高生长素浓度，促进芽苗低或不加细胞分裂素浓度，提高生长素浓度，促进芽苗生根，提高其健壮度。生根，提高其健壮度。（6 6）炼苗移栽）炼苗移栽 选择生长健壮，有选择生长健壮，有3 35 5条根的生根苗进行炼苗，移条根的生根苗进行炼苗，移栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫

7、。当苗栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫。当苗完全成活后，再移向大田。完全成活后，再移向大田。拟定培养方案拟定培养方案外植体预处理外植体预处理外植体无菌接外植体无菌接种种启动培养启动培养分化出芽、胚分化出芽、胚状体或原球茎状体或原球茎继代增殖培养继代增殖培养生根培养生根培养炼苗移栽炼苗移栽成活供生产使成活供生产使用用植物组织培养的一般程序植物组织培养的一般程序 培养基配制灭菌培养基配制灭菌第一节第一节培养基成分、种类及特点培养基成分、种类及特点植物生长必需植物生长必需1616种基本元素：种基本元素：N N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S、FeFe、MnMn、B B、CuCu

8、、ZnZn、MoMo、ClCl、C C、H H、O O。离体培养条件下，各元素主要从培养基中获得：离体培养条件下，各元素主要从培养基中获得：H H和和O O来来源源于于水水，C C来来源源于于添添加加的的糖糖类类，其其它它矿矿质质元元素来源于组成培养基的无机盐。素来源于组成培养基的无机盐。培培养养基基是是根根据据植植物物生生长长所所需需营营养养成成分分，配配制制成成的的供植物生长的人工制作的营养物质。供植物生长的人工制作的营养物质。一、培养基的成分一、培养基的成分 培培养养基基一一般般包包括括无无机机盐盐、有有机机化化合合物物和和生生长长调调节剂三大基本组成成分。节剂三大基本组成成分。1 1、

9、无机盐类、无机盐类 功能功能 离体组织生长发育的基本成分离体组织生长发育的基本成分根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两类：类：大量元素大量元素植物所需元素的使用量一般在每升几十植物所需元素的使用量一般在每升几十-几千毫克，有几千毫克，有C C、H H、O O、N N、P P、K K、CaCa、MgMg、S S。微微量量元元素素植植物物所所需需元元素素的的浓浓度度小小于于1010-5-510-10-7 7mol/Lmol/L，FeFe、CuCu、ZnZn、MnMn、MoMo、B B、ClCl。除除C C、H H、O O外，其它矿质元素通常以离子态吸

10、收外，其它矿质元素通常以离子态吸收 N-N-硝态氮和铵态氮硝态氮和铵态氮 2 2、有机化合物、有机化合物 培培养养基基中中只只有有无无机机盐盐叫叫做做基基本本培培养养基基，为为使使培培养养物物更更好好的的生生长长，还还需需添添加加有有机机成成分分，常常用用有有糖糖类类、维维生生素素、醇类、嘌呤、氨基酸等。醇类、嘌呤、氨基酸等。糖类糖类 功能功能MPaMPa。多使用蔗糖，试管苗生长与繁殖浓度多使用蔗糖，试管苗生长与繁殖浓度2-3%2-3%，幼胚培，幼胚培养养4-6%4-6%，某些特殊培养中用，某些特殊培养中用8-10%8-10%。细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖。细胞和原生质体培养还用

11、麦芽糖、葡萄糖、果糖。维生素类维生素类 功功能能 参参与与酶酶的的形形成成、蛋蛋白白质质、脂脂肪肪代代谢谢，明明显显的的促进离体培养物的生长。促进离体培养物的生长。盐盐酸酸硫硫胺胺素素-VBVB1 1、盐盐酸酸吡吡哆哆醇醇-VBVB6 6、烟烟酸酸-VppVpp、生物素生物素-VHVH、维生素维生素C-VcC-Vc。肌醇肌醇 功能功能 促进糖的转化、维生素和激素的利用，对胚促进糖的转化、维生素和激素的利用，对胚状体和芽的形成有良好影响。状体和芽的形成有良好影响。用量一般用量一般50-10050-100mg/Lmg/L。腺嘌呤腺嘌呤 合合成成各各种种细细胞胞分分裂裂素素的的前前体体物物质质之之一

12、一，利利于于细细胞分裂，促进芽的形成和生长。胞分裂，促进芽的形成和生长。氨基酸氨基酸 蛋蛋白白质质的的成成分分，是是有有机机氮氮化化合合物物，常常用用甘甘氨氨酸酸和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。其它复合成分其它复合成分 成成分分尚尚不不清清楚楚的的天天然然提提取取物物，如如椰椰乳乳、香香蕉蕉汁汁、酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。3 3、生长调节物质、生长调节物质 生长素类生长素类 功能功能 促进细胞脱分化和细胞伸长，促进细胞脱分化和细胞伸长，诱导愈伤组织产生诱导愈伤组织产生 生长素与细胞分裂素协调作用，在生长素

13、与细胞分裂素协调作用，在离体培养中，生长素促进根的形成，离体培养中，生长素促进根的形成，抑制芽的形成。抑制芽的形成。液体培养中利于体细胞胚胎发生。液体培养中利于体细胞胚胎发生。常用常用IAAIAA、IBAIBA、NAANAA、2,4-D2,4-D。IBAIBA促进生根促进生根细胞分裂素的生理效应细胞分裂素的生理效应细胞分裂素类细胞分裂素类 功能功能 促进细胞分裂和扩促进细胞分裂和扩大，调节器官分化，延缓组大，调节器官分化，延缓组织衰老，增强蛋白质合成。织衰老，增强蛋白质合成。离体培养中，促进不定芽的离体培养中，促进不定芽的发生，与生长素协调作用可发生，与生长素协调作用可有效控制培养物的生长与分

14、有效控制培养物的生长与分化。化。常用常用6-6-BABA、ZTZT、KTKT、2iP2iP。植株的形态建成是植株的形态建成是CTKCTK和和IAAIAA的比值调控的的比值调控的 CTK/IAA CTK/IAA高，诱导愈伤组织形成芽高，诱导愈伤组织形成芽 CTK/IAA CTK/IAA低，诱导愈伤组织形成根低，诱导愈伤组织形成根烟草烟草在不在不同细同细胞分胞分裂素裂素与生与生长素长素浓度浓度下的下的生理生理效应效应赤霉素类赤霉素类 功能功能 促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠以及诱导单性结实等。休眠以及诱导单性结实等。与生长素协调作用对形成层分化

15、有影响，刺激体细胞与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞胚进一步发育成植株。胚进一步发育成植株。有有2020多种，目前主要是赤霉酸多种，目前主要是赤霉酸GAGA3 3。4 4、水、水 离体培养中，既是培养基营养成分的溶剂，又离体培养中，既是培养基营养成分的溶剂，又是培养基的重要组成部分，占培养基成分的是培养基的重要组成部分，占培养基成分的95%95%。原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般应用双蒸水或超纯水应用双蒸水或超纯水 大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净水。水。5 5、其它附加成分、其它附加成

16、分 琼脂琼脂 功能功能 来自海藻的多糖类物质，组织培养中来自海藻的多糖类物质，组织培养中最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支持物。持物。常用量常用量0.6%-1.0%0.6%-1.0%，不是培养基必需成分。，不是培养基必需成分。卡拉胶卡拉胶 海藻提取物，含杂质少纯度更高，海藻提取物，含杂质少纯度更高，凝固后培养基透明，利于材料观察。凝固后培养基透明，利于材料观察。活性炭活性炭 功能功能 常用的吸附剂，某些培养类型中，可常用的吸附剂，某些培养类型中，可以吸附培养过程中产生的一些有毒物质（酚类物以吸附培养过程中产生的一些有毒物质（酚类物质），有利于培

17、养物的生长。常用浓度质），有利于培养物的生长。常用浓度1 15mg/L5mg/L左右左右 其吸附作用选择性较差，使用应慎重。常受其吸附作用选择性较差，使用应慎重。常受温度影响，低温吸附效果好，高温吸附能力降低温度影响，低温吸附效果好，高温吸附能力降低甚至解吸附。甚至解吸附。抗生素抗生素 培养基中添加抗生素可防止菌类污染，常用培养基中添加抗生素可防止菌类污染，常用的抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用的抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量一般为量一般为5 520mg/L20mg/L。大部分抗生素需要过滤除。大部分抗生素需要过滤除菌。菌。抗氧化物抗氧化物 抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸、聚乙

18、烯抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮（吡咯烷酮（PVPPVP）及抗坏血酸（）及抗坏血酸（VcVc），可用），可用5050200mg200mgL L的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤除菌后加入固体培养基的表层。或过滤除菌后加入固体培养基的表层。二、常用培养基的种类、配方及特点二、常用培养基的种类、配方及特点（一）培养基种类（一）培养基种类1 1、根据态相分：、根据态相分：固体培养基固体培养基-加凝固剂的培养基加凝固剂的培养基 液体培养基液体培养基-不加凝固剂的培养基。不加凝固剂的培养基。2 2、根据培养过程分：、根据培养过程分：初代培养基初代培

19、养基-初次接种外植体的培养基。初次接种外植体的培养基。继代培养基继代培养基-接种初代培养之后培养物的接种初代培养之后培养物的 培养基。培养基。3 3、根据作用分：、根据作用分：诱导诱导培养基培养基-诱导外植体启动生长诱导外植体启动生长 增殖增殖培养基培养基-诱导离体培养苗扩大繁殖。诱导离体培养苗扩大繁殖。生根生根培养基培养基-诱导离体培养苗生根诱导离体培养苗生根4 4、根据营养水平分：、根据营养水平分：基本基本培养基培养基-包含无机盐等基本营养成分。包含无机盐等基本营养成分。完全完全培养基培养基-包含使植物离体生长全面营养。包含使植物离体生长全面营养。（二）几种常用培养基（二）几种常用培养基细

20、胞工程常用的基本培养基有：细胞工程常用的基本培养基有：MSMS、MTMT、WhiteWhite、NitschNitsch、BlaydesBlaydes、N N6 6、B B5 5、NTNT、SHSH、MillerMiller、HellerHeller等。等。（三）几种常见培养基的特点（三）几种常见培养基的特点1 1、富盐平衡培养基、富盐平衡培养基 无无机机盐盐浓浓度度高高，元元素素比比例例适适当当，离离子子平平衡衡好好，具具有有较较强强的的缓缓冲冲性性，培培养养中中维维持持较较好好的的稳稳定定性性，含含高高量量氮氮、钾钾，营营养养丰丰富富，元元素素种种类类齐齐全全，MSMS培培养养基使用最广泛

21、。基使用最广泛。2 2、低盐培养基、低盐培养基 无机盐浓度低，有机成分含量低，多数作为无机盐浓度低，有机成分含量低，多数作为生根培养基、胚胎培养使用，常用生根培养基、胚胎培养使用，常用WhiteWhite培养基。培养基。3 3、高硝态盐培养基、高硝态盐培养基 较低铵盐，高硝酸盐和盐酸硫胺素较低铵盐，高硝酸盐和盐酸硫胺素B5B5培养基培养基适合双子叶植物特别是木本植物的生长。适合双子叶植物特别是木本植物的生长。N N6 6培养基为水稻等禾谷类花药培养设计，培养基为水稻等禾谷类花药培养设计，KNOKNO3 3和（和（NHNH4 4）2 2SOSO4 4含量高含量高,不含钼。不含钼。SHSH培养基培

22、养基 (NHNH4 4)H)H2 2POPO4 4代替（代替（NHNH4 4）2 2SOSO4 4,矿质浓度较高，矿质浓度较高，多数单子叶和双子叶植物上使用较好多数单子叶和双子叶植物上使用较好。4 4、中盐培养基、中盐培养基 大量元素无机盐为大量元素无机盐为MSMS的的1/21/2，微量元素种类，微量元素种类减少含量增高，无肌醇维生素种类多，增加生减少含量增高，无肌醇维生素种类多，增加生物素、叶酸，有物素、叶酸，有H H、HitschHitsch、MillerMiller、BlaydesBlaydes等培养基，适用于特殊细胞培养。等培养基，适用于特殊细胞培养。第二节第二节 培养基的制备培养基的

23、制备 制制作作一一升升培培养养基基所所需需药药品品2020多多种种，为为节节省省时时间间和和配配制制的的准准确确，需需将将各各种种药药品品浓浓缩缩成成一一定定倍倍数数，并并且且混混合合成成一一定定母母液液，进进行行保保存存。制制作作培培养养基基时时根根据据需需求制培养基数量取用母液。求制培养基数量取用母液。一、培养基母液的配制一、培养基母液的配制 （一）营养成分的配制（一）营养成分的配制 根据药品性质将母液配制成以下四类：根据药品性质将母液配制成以下四类：1 1、大量元素、大量元素 可可以以混混在在一一起起配配制制成成10102020倍倍液液，硫硫酸酸镁镁和和氯氯化化钙钙CaCa+和和MgMg

24、2+2+会会与与磷磷酸酸盐盐混混合合，产产生生不不溶溶性性沉沉淀淀，要要分分别别单单独独配配制制CaCa+与与POPO4-4-一一起起混混合合易易沉沉淀淀，定定容容后消失。后消失。2 2、微量元素、微量元素可配成可配成100100200200倍混合母液，倍混合母液，KIKI可单独配。可单独配。3 3、铁盐、铁盐硫硫酸酸亚亚铁铁和和EDTAEDTA钠钠盐盐易易沉沉淀淀，需需单单独独配配制制，配配成成100100200200倍鳌合剂不易沉淀。倍鳌合剂不易沉淀。4 4、有机化合物、有机化合物维维生生素素、肌肌醇醇、氨氨基基酸酸等等一一起起配配成成100100或或200200倍倍液液，也可分别配制。也

25、可分别配制。（二）植物生长调节物质的配制（二）植物生长调节物质的配制 植植物物生生长长调调节节物物质质分分别别配配成成母母液液储储于于冰冰箱箱，浓度一般为浓度一般为0.50.51 1mg/mlmg/ml。1 1、IAAIAA、NAANAA：先用少量先用少量95%95%酒精使之充分溶解。酒精使之充分溶解。2 2、2,42,4D D：可可用用少少量量0.10.1mol/Lmol/L的的NaOHNaOH溶溶液液充充分分溶溶解解，再再缓缓缓缓加蒸馏水定容至需要的体积。加蒸馏水定容至需要的体积。3 3、KTKT和和BABA等等细胞分裂素类：细胞分裂素类：先先用用少少量量0.10.1mol/L mol/L

26、 的的HClHCl溶溶解解，再再用用蒸蒸馏馏水水定定容至需要的体积。容至需要的体积。（三）（三）药品用量药品用量的计算：的计算：配制母液时药品用量配制母液时药品用量(mg)=mg)=配方用量配方用量(mg)mg)浓浓缩倍数缩倍数制备容量（制备容量（L L）二、培养基的制作二、培养基的制作（一）母液取用量的计算（一）母液取用量的计算 制制 备备 培培 养养 基基 时时 母母 液液 取取 用用 量量（mlml）=1000=1000浓浓缩缩倍倍数数制制备备培培养养基基数数量（量（L L）（二）培养基制作程序（二）培养基制作程序 1 1、按按大大量量元元素素、微微量量元元素素、铁铁盐盐、有有机成分顺序

27、将机成分顺序将母液母液取出，混合。取出，混合。2 2、适适量量蒸蒸馏馏水水放放入入加加热热容容器器，蒸蒸馏馏水水应应少少于于所所制制培培养养基基数数量量，约约终终体体积积的的2/3-2/3-3/43/4，接通电源加热。，接通电源加热。3 3、向向加加热热容容器器中中加加入入称称量量好好的的琼琼脂脂（0.6-0.8%0.6-0.8%），搅拌加热，至完全溶化。），搅拌加热，至完全溶化。培养基制作程序图培养基制作程序图4 4、琼琼脂脂熬熬化化后后，称称取取相相应应量量的的蔗蔗糖糖（2-3%2-3%），加入加热容器中至溶解。加入加热容器中至溶解。5 5、将将母母液液混混合合液液加加入入到到加加热热容容

28、器器中中，搅搅拌拌混混匀。匀。6 6、蒸馏水、蒸馏水定容定容至所需体积。至所需体积。7 7、测测试试培培养养基基溶溶液液的的PHPH值值(5.8-6.0)(5.8-6.0)，过过高高滴滴加加0.10.1mol/Lmol/L的的HCLHCL调调整整，过过低低滴滴加加0.10.1mol/Lmol/L的的NaOHNaOH调整。调整。8 8、迅速、迅速分装分装到培养瓶中，备用到培养瓶中，备用。培培养养基基是是离离体体培培养养物物赖赖以以生生存存和和生生长长的的人人工工环环境境的的重重要要组组成成部部分分，常常用用的的培培养养基基依依据据其其物物理理状状态态的的不同分为固态培养基和液态培养基。不同分为固

29、态培养基和液态培养基。固态培养基一般使用琼脂为凝固剂，也有使用固态培养基一般使用琼脂为凝固剂，也有使用卡拉胶或魔芋粉为凝固剂的。卡拉胶或魔芋粉为凝固剂的。液态培养基不使用凝固剂，但需要在容器中液态培养基不使用凝固剂，但需要在容器中置入适当的支撑物，试管为培养容器的支撑物可置入适当的支撑物，试管为培养容器的支撑物可用滤纸桥，底面积较大的培养容器，支撑物可选用滤纸桥，底面积较大的培养容器，支撑物可选用脱脂棉等。用脱脂棉等。固体培养基固体培养基三、培养基及培养器械的灭菌三、培养基及培养器械的灭菌 制制备备好好的的培培养养基基如如果果带带菌菌，会会导导致致植植物物离离体体培养失败，因而还要对培养基进行

30、灭菌处理。培养失败，因而还要对培养基进行灭菌处理。（一）高压蒸汽灭菌（一）高压蒸汽灭菌培养基的灭菌一般采用湿热灭菌法：培养基的灭菌一般采用湿热灭菌法：1 1、培养瓶及培养器械放入高压灭菌锅。、培养瓶及培养器械放入高压灭菌锅。2 2、灭菌锅加水至淹没电热丝。、灭菌锅加水至淹没电热丝。3 3、封闭高压灭菌锅各出气口。、封闭高压灭菌锅各出气口。4 4、接通电源、接通电源加压加压至至4949kPakPa（0.05MPa0.05MPa）5 5、打开排气阀，打开排气阀，排冷气排冷气至压力至压力0 0 kPakPa。6 6、继继 续续 加加 压压 至至 108108kPakPa（0.11mPa-0.12Mp

31、a0.11mPa-0.12Mpa，即即121121）7 7、压压力力至至108108kPakPa（0.11mPa-0.12Mpa0.11mPa-0.12Mpa，即即121121）时时，稳压稳压在此压力在此压力15-2015-20minmin。8 8、关闭电源自然冷却至压力为关闭电源自然冷却至压力为0 0 kPakPa。9 9、取出培养基和器械冷却，贮存于取出培养基和器械冷却，贮存于3030以下室内。以下室内。（二）干热灭菌（二）干热灭菌 培培养养瓶瓶、三三角角瓶瓶、试试管管等等玻玻璃璃器器皿皿及及接接种种器械，可以进行干热灭菌。器械，可以进行干热灭菌。即即将将洗洗涤涤干干净净的的玻玻璃璃器器皿

32、皿放放到到烘烘箱箱中中，在在150150温温度度下下，干干热热灭灭菌菌1 1小小时时，或或120120下下灭灭菌菌2 2小时。小时。灭菌完毕冷却后取出器械贮存。灭菌完毕冷却后取出器械贮存。贮贮存存室室要要保保持持无无菌菌、干干燥燥、以以免免造造成成培培养养基基的的二次污染。二次污染。灭灭菌菌后后的的培培养养基基一一般般应应在在2 2周周内内使使用用，时时间间过过长易造成潜在的污染。长易造成潜在的污染。培培养养基基灭灭菌菌后后如如果果出出现现过过多多沉沉淀淀或或琼琼脂脂不不凝凝固固等等现现象象，该该培培养养基基不不能能继继续续使使用用，应应查查明明原原因因重新配制。重新配制。第三节第三节 外植体

33、无菌接种外植体无菌接种 一般来说，无论何种类型的细胞工程技一般来说，无论何种类型的细胞工程技术，起始阶段均涉及外植体取材、灭菌、接术，起始阶段均涉及外植体取材、灭菌、接种与培养等基本过程。种与培养等基本过程。一、植物材料的培养与取材一、植物材料的培养与取材 外植体外植体是指用于离体培养的活的植物是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料，是植物离体培养的基础组织、器官等材料，是植物离体培养的基础材料。材料。1 1、外植体的来源、外植体的来源 -生长在自然环境下的植物生长在自然环境下的植物 -有有目目的的地地培培育育在在温温室室控控制制条条件件下下生生长长的的植植物物 -无菌环境下已经过离体培养

34、的植物无菌环境下已经过离体培养的植物 自自然然环环境境中中生生长长的的植植株株，一一般般带带有有微微生生物物，甚甚至至与与某某些些微微生生物物具具有有寄寄生生关关系系，使使植植株株具具有有内内生生菌菌。取取自自这这些些植植物物的的外外植植体体，在在培培养养过过程程中中会会有有微微生物滋生，从而影响培养效果。生物滋生，从而影响培养效果。已离体培养植株已离体培养植株 多数情况下，应尽量使用温室或人工气候多数情况下，应尽量使用温室或人工气候室控制培养的植物材料作为外植体来源，室控制培养的植物材料作为外植体来源，减少培养过程中的微生物感染概率。同时，减少培养过程中的微生物感染概率。同时，生长在控制条件

35、下的植物可以保持培养料生长在控制条件下的植物可以保持培养料间的一致性，提高实验的可重复性，也便间的一致性，提高实验的可重复性，也便于培养技术的规范。于培养技术的规范。某些多年生植物或特殊材料，必须取自某些多年生植物或特殊材料，必须取自自然生长的植物，就需要尽可能避免使用那自然生长的植物，就需要尽可能避免使用那些生长过于潮湿和不洁净环境中的植物。对些生长过于潮湿和不洁净环境中的植物。对于培养过程中可能出现内生菌污染的材料，于培养过程中可能出现内生菌污染的材料，应尽量取生长旺盛期的生长点部位作为起始应尽量取生长旺盛期的生长点部位作为起始培养的材料。培养的材料。2 2、供体植株的管理、供体植株的管理

36、 取取自自室室外外的的外外植植体体材材料料，供供体体植植株株的的管管理理十十分分重重要要，这这与与外外植植体体培培养养时时的的污污染染率率密密切相关。植株管理中应注意：切相关。植株管理中应注意：避避免免昆昆虫虫危危害害 许许多多昆昆虫虫如如蚜蚜虫虫、螨螨类类和和飞飞虱虱是是许许多多植植物物病病虫虫害害的的传传播播媒媒介介，会会引引起植物组织的潜在感染。起植物组织的潜在感染。注意防病注意防病 尤其是真菌和细菌病害的侵尤其是真菌和细菌病害的侵染，取自感病植株的外植体，在培养中的染，取自感病植株的外植体，在培养中的污染率远远高于来自健康植株的外植体，污染率远远高于来自健康植株的外植体，必要时需使用化

37、学药剂防治病害。必要时需使用化学药剂防治病害。控制湿度控制湿度 给供体植株浇水时应从根部给供体植株浇水时应从根部给水，避免从上部浇水，以免上部形成易给水，避免从上部浇水，以免上部形成易于病原侵染的湿度环境；尽可能降低温室于病原侵染的湿度环境；尽可能降低温室湿度；取材前尽可能保持植株干爽。湿度；取材前尽可能保持植株干爽。1 1、材料取材、材料取材 材料选择材料选择 培培养养材材料料应应选选择择有有代代表表性性的的主主要要植植物物、选选择择性性状状优优良良的的种种质质或或特特殊殊的的基基因因型。型。快快速速繁繁殖殖时时应应在在植植株株生生长长的的最最适适时时期期取取材材，花花药药培培养养应应在在花

38、花粉粉发发育育到到单单核核期取材。期取材。cmcm之之间间。胚胚胎胎培培养养或或脱脱毒毒在在0.50.5cmcm以以下下。材材料太大易污染，材料太小难于成活。料太大易污染，材料太小难于成活。采收采收 从从生生长长健健壮壮的的无无病病虫虫害害的的植植株株上上选选取取发发育育正正常常的的器器官官和和组组织织。最最好好采采用用茎茎尖尖，后后代代性状较稳定，携带细菌较少。性状较稳定，携带细菌较少。二、预处理与表面灭菌二、预处理与表面灭菌 1 1、预处理、预处理 先对植物材料进行修剪整理，去掉不需先对植物材料进行修剪整理，去掉不需要部分，将准备使用的植物材料（外植体）要部分，将准备使用的植物材料（外植体

39、）在流水中冲洗在流水中冲洗20-6020-60分钟，备用。如特别不洁分钟，备用。如特别不洁的外植体，可先用加有洗涤剂的水清洗的外植体，可先用加有洗涤剂的水清洗10-1510-15分钟，再用流水冲洗干净。分钟，再用流水冲洗干净。2 2、表面灭菌、表面灭菌（1 1）操操作作人人员员穿穿戴戴灭灭菌菌过过的的工工作作服服、口口罩罩。进进入入接接种种室室前前双双手手用用洗洗涤涤剂剂清清洗洗干干净净，操作前再用操作前再用70%70%酒精或消毒剂擦洗双手。酒精或消毒剂擦洗双手。（2 2）操操作作期期间间双双手手和和台台面面常常用用70%70%酒酒精精或或消消毒毒剂剂擦擦拭拭。超超净净工工作作台台使使用用前前

40、必必须须用用紫紫外灯照射杀菌，然后开启风机。外灯照射杀菌，然后开启风机。（3 3）接种用工具（解剖刀、剪刀、镊子）接种用工具（解剖刀、剪刀、镊子）可放入可放入70-75%70-75%酒精中，使用时需火焰灼烧灭酒精中，使用时需火焰灼烧灭菌，冷却后使用。菌，冷却后使用。（4 4）外植体放入超净工作台内，置）外植体放入超净工作台内，置70-70-75%75%酒精中酒精中5-60 5-60 秒，秒，0.10.1氯化汞氯化汞6-106-10分钟，或分钟，或10%10%的漂白粉上清液中的漂白粉上清液中10-1510-15分钟，然后用无分钟，然后用无菌水冲洗菌水冲洗3-53-5次。灭菌时需进行搅动。次。灭菌

41、时需进行搅动。表面灭菌剂种类较多，可选取表面灭菌剂种类较多，可选取1-21-2种使用。种使用。常用灭菌剂使用浓度及效果比较表常用灭菌剂使用浓度及效果比较表灭菌剂灭菌剂 使用浓度使用浓度 持续时间持续时间 去除的难易去除的难易 效果效果次氯酸钙次氯酸钙 9-10 9-10 5-30 5-30分钟分钟 易易 很好很好次氯酸钠次氯酸钠 2 2 5-30 5-30分钟分钟 易易 很好很好氯化汞氯化汞 0.1-1 0.1-1 5-10 5-10分钟分钟 较难较难 最好最好抗菌素抗菌素 4-50 4-50mgmgL 30-60L 30-60分钟分钟 中中 较好较好酒精酒精 70-75%0.2-2 70-7

42、5%0.2-2分钟分钟 易易 好好过氧化氢过氧化氢 10-12%5-15 10-12%5-15分钟分钟 最易最易 好好三、外植体的接种三、外植体的接种无菌接种无菌接种 外植体的接种是把经过表面灭菌后的外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞、植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞、转放到无菌培养基上的全部操作过程。整转放到无菌培养基上的全部操作过程。整个过程均需无菌操作。个过程均需无菌操作。（1 1）借助接种用工具将材料切割分离。）借助接种用工具将材料切割分离。（2 2）将将培培养养基基放放入入超超净净工工作作台台内内，火火焰焰灼灼烧烧培培养养基基瓶瓶口口，然然后后打

43、打开开培培养养瓶瓶口口，置置培培养养瓶为斜角，避免灰尘落入平中。瓶为斜角，避免灰尘落入平中。（3 3）迅迅速速将将切切割割分分离离下下的的所所需需组组织织、细细胞胞、器官，放入培养基上，及时盖上瓶盖。器官，放入培养基上，及时盖上瓶盖。（4 4）工具用后应及时灭菌，避免交叉污染。）工具用后应及时灭菌，避免交叉污染。（5 5）工作人员操作时禁止不必要的谈话。）工作人员操作时禁止不必要的谈话。第四节第四节 外植体的培养外植体的培养 接接种种只只是是完完成成了了离离体体培培养养的的第第一一步步，植植物物离离体体培培养养和和栽栽培培植植物物一一样样，生生长长过过程程中中也也受受到到各各种种环环境境因因素

44、素的的影影响响。培培养养条条件件是是离离体体培培养养能能否否成成功功的的关关键键。在在培培养养基基条条件件适适宜宜的的基基础础上上，影影响响试试管管苗苗生生长长的的主主要要因因素素有有光光照照、温温度度、湿湿度度、氧氧气。气。一、外植体的培养条件一、外植体的培养条件1 1、光照、光照 光光照照对对植植物物生生长长发发育育有有重重要要作作用用，是是离离体体培培养养中中非非常常重重要要的的环环境境因因素素。光光照照强强度度、光光质质以以及及光光照照时时间间，对对细细胞胞的的增增殖殖、器器官官的的分分化化都都有有很很大大影影响响。除除特特殊殊要要求求外外，一一般般都都采采用用日日光光灯灯作作光光源源

45、，光光照照强强度度1000-50001000-5000LxLx，根根据据不不同同植植物物或或器器官官需需要要，可可以以每每天天连连续续光光照照12-1612-16小小时时，也也可可每每天天光光照照1616小小时时，8 8小时黑暗。小时黑暗。2 2、温度、温度 离离体体培培养养中中对对温温度度的的控控制制比比光光照照更更为为重重要要，大大所所数数植植物物最最适适温温度度在在23-3223-32之之间间。培培养养室室温温度度是是252252。低低于于1515时时，培培养养的的组组织织生生长长停停顿顿，高高于于3535对对生生长长也也不不利利。因因此此，培培养养室室应应安安装装空空调机或其他的控温设

46、备。调机或其他的控温设备。3 3、湿度、湿度 培养瓶内相对湿度通常是培养瓶内相对湿度通常是100%100%，而环境中的，而环境中的相对湿度会直接影响培养基的水分蒸发。因此，相对湿度会直接影响培养基的水分蒸发。因此，培养过程中，培养室一般要求相对湿度保持在培养过程中，培养室一般要求相对湿度保持在70-80%70-80%，相对湿度过低影响培养物生长和分化，相对湿度过低影响培养物生长和分化，应向室内喷洒水，以提高湿度；过高杂菌滋生，应向室内喷洒水，以提高湿度；过高杂菌滋生，大量污染，应及时地通风除湿。大量污染，应及时地通风除湿。4 4、氧气、氧气 离离体体培培养养的的试试管管苗苗是是需需要要氧氧气气

47、的的，在在固固体体培培养养或或液液体体静静置置培培养养时时，如如果果组组织织完完全全浸浸入入培培养养基基中中，与与氧氧气气隔隔绝绝，就就会会停停止止生生长长。因因此此，接接种种时时要要有有部部分分组组织织合合空空气气接接触触。振振荡荡培培养养是是解解决决通通气气的的良良好好办办法法。固固体体培培养养中中，如如瓶瓶塞塞不不透透气气，培培养养物物也也不不能能生生长长，要要选选择择通通气气性性好好的的培培养养瓶瓶盖盖，增增加加可可利利用用的的氧氧气气，迅迅速速除除去去释释放放出出来来的的COCO2 2，有有利利于外植体外层细胞开始分裂。于外植体外层细胞开始分裂。二、外植体的成苗途径二、外植体的成苗途

48、径外植体的成苗途径有三种：外植体的成苗途径有三种：（一）外植体（一）外植体-愈伤组织愈伤组织-完整植株。完整植株。具体又可分为三种：具体又可分为三种：1 1、愈伤组织、愈伤组织-同时长芽和根同时长芽和根-植株。植株。2 2、愈伤组织、愈伤组织-茎茎-根根-植株。植株。3 3、愈伤组织、愈伤组织-根根-芽芽-植株。植株。（二二）外外植植体体-胚胚状状体体-植植株株。可可从从以以下下几几种种培培养养物物中产生：中产生：1 1、器官上发生。、器官上发生。2 2、愈伤组织上发生。、愈伤组织上发生。3 3、游离单细胞发生。、游离单细胞发生。4 4、小孢子发生。、小孢子发生。诱导胚状体比诱导芽数量多、速度

49、快、结构完整。诱导胚状体比诱导芽数量多、速度快、结构完整。（三）外植体（三）外植体-直接形成根与芽直接形成根与芽-植株。如茎尖培养植株。如茎尖培养 三、培养中常见问题三、培养中常见问题（一）（一）污染污染的原因及其预防措施的原因及其预防措施1 1、污染原因、污染原因 污染是指在组织培养过程中培养基和污染是指在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。病原菌：细菌及真菌两大类。病原菌：细菌及真菌两大类。细菌污染特点细菌污染特点-菌斑呈黏液状，接种后菌斑呈黏液状，接种后1-21-2天发现。天发现。污染途径：污染途径：外植体带菌外植体带菌 培养

50、基及器皿灭菌不彻底培养基及器皿灭菌不彻底 操作人员未遵守操作规程操作人员未遵守操作规程 真菌污染的特点真菌污染的特点-污染部分长有不同污染部分长有不同颜色的霉菌，接种后颜色的霉菌，接种后3-103-10天发现。天发现。污染途径：污染途径：周围环境不清洁周围环境不清洁 超净工作台过滤装置失效超净工作台过滤装置失效 培养瓶的口径过大培养瓶的口径过大2 2、污染的预防措施、污染的预防措施防止材料带菌的措施防止材料带菌的措施-茎尖作外植体时，进行预培养（无糖）或茎尖作外植体时，进行预培养（无糖）或暗培养。无糖营养液或自来水使枝条抽枝，暗培养。无糖营养液或自来水使枝条抽枝，以新抽嫩枝作外植体。以新抽嫩枝