医疗器械无菌检查.ppt

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1、1 医疗器械医疗器械-无菌检查无菌检查 江苏省医疗器械检验所江苏省医疗器械检验所 2021/9/10年10月12 主要内容主要内容无菌定义及无菌检查定义无菌定义及无菌检查定义 无菌检验依据无菌检验依据试验主要设备试验主要设备实验环境条件及人员要求实验环境条件及人员要求培养基种类及配制要求培养基种类及配制要求培养基适用性检查培养基适用性检查试验菌种及菌液制备试验菌种及菌液制备无菌检查方法验证无菌检查方法验证供试品无菌检查及结果判断供试品无菌检查及结果判断 2021/9/10年10月23 无菌定义无菌定义:无活微生物的状态。无活微生物的状态。无无菌菌检检查查定定义义 ：无无菌菌检检查查法法系系用用

2、于于检检查查药药典典要要求求无无菌菌的的药药品品、原原料料、辅辅料料及及其其他他品品种种是是否否无无菌菌的的一一种种方方法法。若若供供试试品品符符合合无无菌菌检检查查法法的的规规定定，仅仅表表明明了了供供试试品在该检验条件下未发现微生物污染。品在该检验条件下未发现微生物污染。（1）无菌定义）无菌定义2021/9/10年10月34（2）无菌检验依据无菌检验依据本规范选用于本规范选用于中国药典中国药典20102010年版二年版二部附录部附录XI HXI H无菌检查法。无菌检查法。GB/T 14233.2-2005GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、医用输液、输血、注射器具检验方法注

3、射器具检验方法 ，第二部分：生物，第二部分：生物试验方法中规定的无菌试验方法。试验方法中规定的无菌试验方法。2021/9/10年10月45 （3）试验主要设备）试验主要设备超净工作台超净工作台细菌培养箱细菌培养箱霉菌培养箱霉菌培养箱立式高压蒸汽灭菌器立式高压蒸汽灭菌器台式高压蒸汽灭菌器台式高压蒸汽灭菌器显微镜显微镜生物安全柜生物安全柜电热恒温干燥箱电热恒温干燥箱集菌仪集菌仪2021/9/10年10月56试验仪器（试验仪器（1 1）-超净工作台超净工作台2021/9/10年10月67试验设备试验设备（2）-隔水式恒温培养箱隔水式恒温培养箱2021/9/10年10月78试验设备（试验设备（3 3）

4、-霉菌培养箱霉菌培养箱2021/9/10年10月89试验设备试验设备（4）-立式高压蒸汽灭菌器立式高压蒸汽灭菌器2021/9/10年10月910试验设备（试验设备（5 5）-台式蒸汽灭菌器台式蒸汽灭菌器2021/9/10年10月1011试验设备（试验设备（6 6）-显显 微微 镜镜2021/9/10年10月1112试验设备（试验设备（7 7）-生物安全柜生物安全柜2021/9/10年10月1213试验设备（8）Equinox 全自动无菌检验系统2021/9/10年10月1314（4 4）实验环境条件要求：）实验环境条件要求：无菌检查应在环境洁净度无菌检查应在环境洁净度10 00010 000级

5、下的局级下的局部洁净度部洁净度100100级的单向流空气区域内或隔离级的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操系统中进行，其全过程必须严格遵守无菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、工作作，防止微生物污染。单向流空气区、工作台面及环境应定期按台面及环境应定期按医药工业洁净室医药工业洁净室(区区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的的现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按现行国家标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。须符合无菌检查的要求。2021/9/

6、10年10月1415（4 4）实验人员要求：实验人员要求：菌检人员必须具备微生物专业知识，并菌检人员必须具备微生物专业知识，并 经过无菌技术培训。经过无菌技术培训。2021/9/10年10月1516（5 5）培养基）培养基种类及要求种类及要求 1.硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基2.改良马丁培养基改良马丁培养基2021/9/10年10月162012年12月1717（5 5）培养基）培养基种类及要求种类及要求 n无菌检查：硫乙醇酸盐流体培养基无菌检查：硫乙醇酸盐流体培养基2021/9/10年10月172012年12月1818（5 5）培养基）培养基种类及要求种类及要求 无菌检查无菌检查

7、：改良马丁培养基：改良马丁培养基：2021/9/10年10月1819（5 5）培养基）培养基种类及要求种类及要求 保存时间：保存时间：制备好的培养基应保存在：制备好的培养基应保存在：2 2 2525、避光避光 n 非密闭容器中：一般在三周内使用非密闭容器中：一般在三周内使用n 密闭容器中：一般可在一年内使用密闭容器中：一般可在一年内使用2021/9/10年10月1920（5 5）培养基）培养基种类及要求种类及要求 一般采用商品脱水培养基一般采用商品脱水培养基，临用时按照临用时按照使用说明书进行配制，配制时须迅速，使用说明书进行配制，配制时须迅速，以免吸潮影响称量的准确性，同时需注以免吸潮影响称

8、量的准确性，同时需注意灭菌后培养基的意灭菌后培养基的pHpH值值应符合规定，否应符合规定，否则必须校正后灭菌使用。则必须校正后灭菌使用。新鲜配制的培养基，应符合新鲜配制的培养基，应符合中国药典中国药典规定的配方，对培养基进行挑选。规定的配方，对培养基进行挑选。2021/9/10年10月2021（5 5）培养基）培养基种类及要求种类及要求 硫乙醇酸盐培养基：硫乙醇酸盐培养基：属于流体培养基，属于流体培养基，即在液体培养基中加入即在液体培养基中加入0.05%0.05%0.07%0.07%的的琼脂琼脂，增加了培养基的粘度，降低培养，增加了培养基的粘度，降低培养基中的含氧量，使培养基在一段时间内基中的

9、含氧量，使培养基在一段时间内保持厌氧的条件，有利于厌氧菌的生长。保持厌氧的条件，有利于厌氧菌的生长。硫乙醇酸盐培养基分装在适宜的容器中，硫乙醇酸盐培养基分装在适宜的容器中，其粉红色的其粉红色的氧化层氧化层适合需气菌的生长，适合需气菌的生长，在供试品接种前，培养基的氧化层的颜在供试品接种前，培养基的氧化层的颜色不得超过培养基深度的色不得超过培养基深度的1 15 5，调，调PHPH值值灭菌后为灭菌后为7.10.27.10.2，分装，灭菌。，分装，灭菌。硫乙醇酸盐培养管置：硫乙醇酸盐培养管置：30303535培养培养1414天。天。2021/9/10年10月2122（5 5）培养基）培养基种类及要求

10、种类及要求 n改良马丁培养基：改良马丁培养基：取培养基成分混合，微取培养基成分混合，微温溶解，调节温溶解，调节PHPH值约为值约为6.86.8，煮沸，摇匀，煮沸，摇匀，调调PHPH值灭菌后为值灭菌后为6.40.26.40.2，分装，灭菌。，分装，灭菌。n 改良马丁培养基：改良马丁培养基：置置23232828培养培养1414天。天。2021/9/10年10月2223（5 5）培养基）培养基种类及要求种类及要求 培养基装量培养基装量：n对于采用直接接种法检查的对于采用直接接种法检查的液体液体样品，培样品，培养基的装量与供试品装量相关，应根据供养基的装量与供试品装量相关，应根据供试品接种量确定培养基

11、的装量，使供试品试品接种量确定培养基的装量，使供试品接种体积不大于培养基的接种体积不大于培养基的10%10%。n对于采用直接接种法检查的对于采用直接接种法检查的固体固体样品，培样品，培养基的装量均为养基的装量均为100ml100ml；一次性医用材料；一次性医用材料及医疗器具，若医疗器具体积过大，培养及医疗器具，若医疗器具体积过大，培养基的装量可基的装量可2000ml2000ml以上，已将其完全浸没以上，已将其完全浸没为准。为准。n对于采用对于采用薄膜过滤法薄膜过滤法检查的样品，封闭式检查的样品，封闭式薄膜滤器的培养基装量为薄膜滤器的培养基装量为100ml 100ml。2021/9/10年10月

12、2324（6）培养基适用性检查培养基适用性检查n新购的培养基或自配的新鲜培养基要求：新购的培养基或自配的新鲜培养基要求：n无菌性检查：无菌性检查：n每批培养基随机取不少于每批培养基随机取不少于5 5支（瓶），培养支（瓶），培养1414天，应天，应无菌生长。无菌生长。n灵敏度检查：灵敏度检查：n其质量均应符合其质量均应符合灵敏度检查要求灵敏度检查要求。用于培养基灵敏。用于培养基灵敏度检查的菌种如下：菌种的传代的次数不得超过度检查的菌种如下：菌种的传代的次数不得超过5 5代代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为0 0代代）。）。2021/9/10年10月2425

13、（6）培养基适用性检查培养基适用性检查菌种：试验用菌株及菌液制备：菌种：试验用菌株及菌液制备：金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003CMCC(B)26003铜绿色假单胞菌铜绿色假单胞菌CMCC(B)10104 CMCC(B)10104 大肠埃希菌大肠埃希菌CMCC(B)44102CMCC(B)44102枯草杆菌枯草杆菌CMCC(B)63501 CMCC(B)63501 生孢梭菌生孢梭菌CMCC(B)64941 CMCC(B)64941 白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F)98001 CMCC(F)98001 黑曲霉黑曲霉CMCC(F)98003 CMCC(F)98003 菌种的要求

14、：菌种的要求：不得超过不得超过5 5代。采用适代。采用适宜的方法保存；并以保证试验菌宜的方法保存；并以保证试验菌株的生物学特性。株的生物学特性。2021/9/10年10月2526（6）培养基适用性检查培养基适用性检查 菌液制备菌液制备 n一般当日使用。一般当日使用。n取取金黄金黄色葡萄球菌、色葡萄球菌、铜绿铜绿假单胞菌、假单胞菌、枯草枯草芽孢杆菌，少许接种芽孢杆菌，少许接种至营养肉汤基中，至营养肉汤基中，生孢生孢梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸梭菌的新鲜培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，盐流体培养基中，30303535培养培养18 18 24h24h；n白色白色念珠菌的新鲜培养物接种改

15、良马丁培养基中，念珠菌的新鲜培养物接种改良马丁培养基中，23232828培养培养24 24 48h48h，上述培养物用，上述培养物用0.9%0.9%无菌氯化钠溶液制成含菌量无菌氯化钠溶液制成含菌量小于小于100cfu/ml100cfu/ml菌悬液；菌悬液；n黑曲黑曲霉霉 菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基菌斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，上，23232828培养培养5 5 7 7天，使大量的孢子成熟。加入天，使大量的孢子成熟。加入3 3 5ml5ml含含0.05%0.05%（ml/mlml/ml）聚山梨酯）聚山梨酯8080的的0.9%0.9%无菌氯化钠溶液，将无菌氯

16、化钠溶液，将孢子洗脱。然后用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用孢子洗脱。然后用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管中，用含含0.05%0.05%（ml/mlml/ml）聚山梨酯）聚山梨酯8080的的0.9%0.9%无菌氯化钠溶液制成小于无菌氯化钠溶液制成小于100cfu/ml 100cfu/ml 的孢子悬液。（见表）的孢子悬液。（见表）2021/9/10年10月2627 （6）培养基适用性检查培养基适用性检查 中国药典中国药典20102010年无菌检查验证试验中使用年无菌检查验证试验中使用7 7株菌见下表株菌见下表菌菌 种种 接种培养基接种培养基 培养温度培养温度 培养时间培养时间金黄色葡萄球

17、菌金黄色葡萄球菌 营养肉汤或者普通营养肉汤或者普通斜面斜面 30303535 181824h24h铜绿假单孢菌铜绿假单孢菌 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 大肠埃希菌大肠埃希菌（无）（无）生孢梭菌生孢梭菌硫乙醇酸盐培养基硫乙醇酸盐培养基白色念珠菌白色念珠菌 改良马丁或者普通改良马丁或者普通斜面斜面 23232828 242448h48h黑曲霉黑曲霉 改良马丁斜面改良马丁斜面 232328285 57d 7d 2021/9/10年10月2728（6）培养基适用性检查培养基适用性检查 培养基接种培养基接种 金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌2 2支支 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌2 2支支硫乙醇酸盐流体培养基硫乙

18、醇酸盐流体培养基 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌2 2支支 生孢梭菌生孢梭菌2 2支支 9 9支培养基装量支培养基装量12ml12ml，空白对照空白对照1 1支。支。分别接种小于分别接种小于100cfu/ml100cfu/ml金葡、铜绿、枯草、生孢金葡、铜绿、枯草、生孢各各2 2管管，另，另1 1支不接种做空白对照，支不接种做空白对照，培养培养3 3天，逐日观察天，逐日观察结果。结果。2021/9/10年10月2829（5）培养基适用性检查培养基适用性检查 培养基接种培养基接种 白色念株菌白色念株菌2 2支支改良马丁培养改良马丁培养 黑曲霉黑曲霉2 2支支 （5 5支培养基装量支培养基装量9ml9m

19、l，其中，其中1 1支做空白对照）支做空白对照）分别接种小于分别接种小于100cfu/ml100cfu/ml白色、黑曲各两支白色、黑曲各两支，另另1 1支不接种做空白对照。支不接种做空白对照。培养培养5 5天，逐日观察结天，逐日观察结果。果。2021/9/10年10月2930（6）培养基适用性检查培养基适用性检查结果判断结果判断 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养管均生空白对照管应无菌生长，若加菌的培养管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。2021/9/10年10月3031（7）试验）试验(验证验证)菌种及菌液制备菌种及菌液制备菌种：试验用菌株及

20、菌液制备：菌种：试验用菌株及菌液制备：金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003CMCC(B)26003大肠埃希菌大肠埃希菌CMCC(B)44102CMCC(B)44102枯草杆菌枯草杆菌CMCC(B)63501 CMCC(B)63501 生孢梭菌生孢梭菌CMCC(B)64941 CMCC(B)64941 白色念珠菌白色念珠菌CMCC(F)98001 CMCC(F)98001 黑曲霉黑曲霉CMCC(F)98003 CMCC(F)98003 2021/9/10年10月3132（6）试验菌种及菌液制备）试验菌种及菌液制备n1010倍梯度稀释倍梯度稀释n选择适宜的选择适宜的3 3个稀释级别

21、个稀释级别n要求要求100cfu/ml100cfu/ml2021/9/10年10月3233（7）无菌检查方法验证）无菌检查方法验证n验证准备条件：验证准备条件：1.1.稀释液、冲洗液及其制备方法稀释液、冲洗液及其制备方法2.2.0.10.1蛋白胨水溶液蛋白胨水溶液3.3.pH7.0pH7.0氯化钠氯化钠蛋白胨缓冲液蛋白胨缓冲液4.4.制备的菌液，应当日使用。制备的菌液，应当日使用。2021/9/10年10月3334（7）无菌检查方法验证）无菌检查方法验证 目的目的:1.1.证明所采用的方法适合于该供试品的无菌检查证明所采用的方法适合于该供试品的无菌检查2.2.确认供试品在该实验条件下无抑菌活性

22、或其抑菌活性确认供试品在该实验条件下无抑菌活性或其抑菌活性可以忽略不计。可以忽略不计。3.3.确保在实际检验条件下，该供试品的无菌检查法的准确保在实际检验条件下，该供试品的无菌检查法的准确性、有效性和重现性。确性、有效性和重现性。验证时，按验证时，按“供试品的无菌供试品的无菌检查检查”的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应的规定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进行验证。逐一进行验证。2021/9/10年10月3435（7）无菌检查方法验证）无菌检查方法验证菌种及菌液制备菌种及菌液制备 ：除大肠埃希菌除大肠埃希菌（Escherichia coli）CMCC(B)4 4102外，外，金黄色

23、葡萄球菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。方法验证试验与灵敏度检验所有菌种区别：方法验证试验与灵敏度检验所有菌种区别：大大肠埃希菌代替肠埃希菌代替铜绿假单胞菌。铜绿假单胞菌。2021/9/10年10月3536（7）无菌检查方法验证）无菌检查方法验证n菌液制备：菌液制备：n金黄色葡萄球菌（大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌金黄色葡萄球菌（大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌)接种营接种营养肉汤（或营养琼脂培养基）养肉汤（或营养琼脂培养基）n

24、生孢梭菌接种硫乙醇酸盐流体培养基生孢梭菌接种硫乙醇酸盐流体培养基 30303535培养培养18182424小时；小时；n白色念珠菌接种改良马丁培养基（或改良马丁琼脂培养白色念珠菌接种改良马丁培养基（或改良马丁琼脂培养基）基）23232828培养培养24244848小时小时n上述培养物上述培养物 用用0.90.9无菌氯化钠溶液制成每无菌氯化钠溶液制成每1ml1ml含菌数小含菌数小于于l00cfu(l00cfu(菌落形成单位菌落形成单位)的菌悬液。的菌悬液。n 黑曲霉接种改良马丁琼脂斜面培养基上，黑曲霉接种改良马丁琼脂斜面培养基上，23232828培养培养5 57 7天，加入天，加入3 35ml

25、0.95ml 0.9无菌氯化钠溶液，将孢子洗无菌氯化钠溶液，将孢子洗 吸出孢子悬液吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌用管口带有薄的无菌棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管丝的无菌毛细吸管)至无菌试管内用至无菌试管内用0.90.9无菌氯化钠溶无菌氯化钠溶液制成每液制成每lmllml含孢子数小于含孢子数小于l00cful00cfu的孢子悬液。的孢子悬液。2021/9/10年10月3637（7）无菌检查方法验证）无菌检查方法验证n薄膜过滤法薄膜过滤法n将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入试验菌（小于在最后一次的冲洗液中

26、加入试验菌（小于100cfu100cfu），过滤。取出滤膜接种至相应的培养），过滤。取出滤膜接种至相应的培养基中，或将培养基加至滤筒内。另取一滤桶，基中，或将培养基加至滤筒内。另取一滤桶，不过滤供试品，其它操作同上，作为对照不过滤供试品，其它操作同上，作为对照.将将含培养基的容器按规定温度培养含培养基的容器按规定温度培养3 35 5天。天。各各试验菌及相应的培养基逐一进行验证。试验菌及相应的培养基逐一进行验证。n（如下图示）（如下图示）2021/9/10年10月3738（7）无菌检查方法验证）无菌检查方法验证薄膜过滤法薄膜过滤法 规定量的供试品规定量的供试品 过滤过滤 硫乙醇酸盐流体培养基硫乙

27、醇酸盐流体培养基 滤膜滤膜 接种接种 改良马丁培养基改良马丁培养基冲洗冲洗 每种菌均作每种菌均作1 1管不含供试品管作为对照管不含供试品管作为对照加入试验菌加入试验菌过滤过滤2021/9/10年10月3839（7）无菌检查方法验证）无菌检查方法验证n 直接接种法直接接种法 n 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基酸盐流体培养基8 8管，分别接人小于管，分别接人小于l00cful00cfu的的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各菌、生孢梭菌各2 2管；取符合直接接种法培养管；取符合直接

28、接种法培养基用量要求的改良马丁培养基基用量要求的改良马丁培养基4 4管，分别接入管，分别接入小于小于l00cful00cfu的白色念珠菌、黑曲霉各的白色念珠菌、黑曲霉各2 2管。其管。其中中1 1管接人规定量的供试品，另管接人规定量的供试品，另1 1管作为对照，管作为对照，按规定的温度培养按规定的温度培养3 35 5天。（如下表）天。（如下表）2021/9/10年10月3940（7）无菌检查方法验证）无菌检查方法验证-直接接种法直接接种法方法验证所用菌种（药典方法验证所用菌种（药典2010版规定）版规定）金黄色葡萄球金黄色葡萄球菌菌分别接种各菌分别接种各菌种新鲜培养物种新鲜培养物至相应培养基至

29、相应培养基中培养，将培中培养，将培养物用养物用0.9%无菌氯化钠溶无菌氯化钠溶液制成菌悬液，液制成菌悬液，浓度小浓度小100cfu/mL硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基8支：支：分分别接种小于别接种小于100cfu的金葡、大的金葡、大肠、枯草、生孢各肠、枯草、生孢各2支，其中支，其中1管接入每支培养基规定的供试品管接入每支培养基规定的供试品接种量，另接种量，另1管作为对照，培养管作为对照，培养3天。天。大肠埃希菌大肠埃希菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌生孢梭菌生孢梭菌白色念珠菌白色念珠菌改良马丁培养基改良马丁培养基4支支：分别接种：分别接种小于小于100cfu的白念、黑曲霉各的白念、黑曲霉各

30、2支，其中支，其中1管接入每支培养基规管接入每支培养基规定的供试品接种量，另定的供试品接种量，另1管作为管作为对照，培养对照，培养5天。天。黑曲霉黑曲霉2021/9/10年10月4041（7）无菌检查方法验证）无菌检查方法验证n结果判断 n与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检验条件进行供试品的无菌检查。如含供查法和检验条件进行供试品的无菌检查。如含供试品的任一容器中微生物生

31、长微弱、缓慢或不生试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌长，则供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用。可采用：作用。可采用：1)1)增加冲洗量，或增加培养基的用量；增加冲洗量，或增加培养基的用量；2)2)使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消使用中和剂或灭活剂、更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。2021/9/10年10月4142（8）供试品无菌检查）供试品无菌检查n在在100100级超净台内，应在酒精灯火焰周围，以无菌操作级超净台内，应在酒精灯火焰周围，以无菌操作法将规定量的

32、供试品分别接种至含硫乙醇酸盐流体培法将规定量的供试品分别接种至含硫乙醇酸盐流体培养基（不少于养基（不少于15ml/15ml/管）和改良马丁培养基（不少于管）和改良马丁培养基（不少于10ml/10ml/管）的容器中。管）的容器中。n注意事项：注意事项：1.1.严格遵守无菌技术操作，切勿人为造成污染；严格遵守无菌技术操作，切勿人为造成污染；2.2.试验器具温度不可过高以免将可能存在的菌烫死试验器具温度不可过高以免将可能存在的菌烫死。2021/9/10年10月4243（8）供试品无菌检查）供试品无菌检查供试品包装须完好无损，尤其是只有一层包装的供试品包装须完好无损，尤其是只有一层包装的样品。样品。供

33、试品若有两层（或两层以上）包装的，进入无供试品若有两层（或两层以上）包装的，进入无菌检验室需将外包装在传递窗（或缓冲间）拆除菌检验室需将外包装在传递窗（或缓冲间）拆除后，传入实验室。后，传入实验室。开启洁净区紫外灯和空气过滤装置并其工作开启洁净区紫外灯和空气过滤装置并其工作1 1小小时以上。时以上。操作人员准备：带口罩、帽子、穿专用无菌服、操作人员准备：带口罩、帽子、穿专用无菌服、鞋进入无菌室。鞋进入无菌室。每次试验中所用物品必须计划好，并有备用每次试验中所用物品必须计划好，并有备用2021/9/10年10月4344（8）供试品无菌检查）供试品无菌检查无菌检查法包括：无菌检查法包括：薄膜过滤法

34、和直接接种法。薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品性状允许，应采用薄膜只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。进行供试品无菌检查时，过滤法。进行供试品无菌检查时，所采用的检验方法和检验条件应与所采用的检验方法和检验条件应与验证的方法相同。验证的方法相同。2021/9/10年10月4445（8）供试品无菌检查）供试品无菌检查细菌检测管：细菌检测管：硫乙醇酸盐流体培养基硫乙醇酸盐流体培养基+供试品供试品真菌检测管：真菌检测管：改良马丁培养基改良马丁培养基+供试品供试品阳性对照管：阳性对照管：对应阳性菌对应阳性菌+对应培养基对应培养基+供试品供试品阴性对照管：阴性对照管：应取相应的溶剂和稀释液或冲洗液应

35、取相应的溶剂和稀释液或冲洗液 +培养基培养基 2021/9/10年10月4546（8）供试品无菌检查）供试品无菌检查 检验数量：检验数量：n 是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。是指一次试验所用供试品最小包装容器的数量。n 一般情况下，供试品无菌检查若采用一般情况下，供试品无菌检查若采用薄膜过滤法薄膜过滤法，应增加最小检验数量的应增加最小检验数量的1/21/2作阳性对照用；若采用作阳性对照用；若采用直接接种法，应增加供试品无菌检查时每个培养基直接接种法，应增加供试品无菌检查时每个培养基容器接种的样品量做阳性对照用。容器接种的样品量做阳性对照用。2021/9/10年10月4647（8）供试

36、品无菌检查）供试品无菌检查检验量：检验量：是指一次试验所用的供试品总量（是指一次试验所用的供试品总量（g g或或mlml）。）。采用直接接种法时：采用直接接种法时：若每支（瓶）供试品的装量按若每支（瓶）供试品的装量按规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸规定足够接种两份培养基，则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基。盐流体培养基和改良马丁培养基。采用薄膜过滤法时：采用薄膜过滤法时：检验量应不少于直接接种法的检验量应不少于直接接种法的供试品总接种量，只要供试品特性允许，应将所有供试品总接种量，只要供试品特性允许，应将所有容器内的全部内容物过滤。容器内的全部内容物过滤。2021/9

37、/10年10月4748（8）供试品无菌检查）供试品无菌检查 直接接种法：直接接种法：每个容器中培养基的用量应符合接种的每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的供试品体积不得大于培养基体积的1010，同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于于15ml15ml，改良马丁培养基每管装量不少于，改良马丁培养基每管装量不少于10ml10ml。培养基的用量和高度同方法验证试。培养基的用量和高度同方法验证试验；每种培养基接种的管数同供试品的检验；每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。验数量。2021/9/10年10月484949（8）供试品无菌检查

38、）供试品无菌检查 n阴性对照：阴性对照：供试品无菌检查时，应取相应溶剂和供试品无菌检查时，应取相应溶剂和稀释液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得稀释液同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。有菌生长。n阴性对照：阴性对照：目的是验证相应溶剂和稀释液本身是目的是验证相应溶剂和稀释液本身是否存在污染，防止假阳性。否存在污染，防止假阳性。2021/9/10年10月495050（8）供试品无菌检查）供试品无菌检查阳性对照阳性对照：应根据供试品特性选择阳性对照菌；无抑应根据供试品特性选择阳性对照菌；无抑菌作用供试品以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。阳性菌作用供试品以金黄色葡萄球菌为阳性对照菌。阳性对

39、照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于对照试验的菌液制备同方法验证试验，加菌量小于100cfu/ml100cfu/ml，供试品用量同供试品无菌检查每份接种，供试品用量同供试品无菌检查每份接种量相同。阳性对照管培养量相同。阳性对照管培养48 48 72 72小时应生长良好。小时应生长良好。阳性对照：阳性对照：目的是验证试验结果可靠性，防止假阴性。目的是验证试验结果可靠性，防止假阴性。2021/9/10年10月505151（8）供试品无菌检查）供试品无菌检查 薄膜过滤法：薄膜过滤法：n20102010年版年版中国药典中国药典规定规定:只要供试品性状允许，只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法。供

40、试品无菌检查所采用的检查应采用薄膜过滤法。供试品无菌检查所采用的检查方法和检验条件应与验证的方法相同。方法和检验条件应与验证的方法相同。n在蠕动泵的作用下，被测产品通过装有带空气过滤器在蠕动泵的作用下，被测产品通过装有带空气过滤器的针头及无菌管路直接从样品容器中进入滤筒中，的针头及无菌管路直接从样品容器中进入滤筒中，免去了通常膜转移过程中易产生的污染。免去了通常膜转移过程中易产生的污染。n无菌检查法中薄膜过滤法所用的滤膜孔径应不大于无菌检查法中薄膜过滤法所用的滤膜孔径应不大于0.45m0.45m，直径约为，直径约为50mm50mm。2021/9/10年10月515252（8）供试品无菌检查）供

41、试品无菌检查水溶液供试品水溶液供试品取规定量的供试液，直接过滤，或混合至适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。取规定量的供试液，直接过滤，或混合至适量稀释液的无菌容器内，混匀，立即过滤。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100ml，总冲洗量不得超过，总冲洗量不得超过1000mL，以免滤膜上微生物受损伤。，以免滤膜上微生物受损伤。冲洗后分别将冲洗后分别将100mL硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内，硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基加入相应的滤筒内，进行培养。进行培养。2021/9

42、/10年10月525353（8）供试品无菌检查）供试品无菌检查n直接接种与薄膜过滤培养结果：直接接种与薄膜过滤培养结果：2021/9/10年10月5354表2 上市抽验样品(液体制剂)的最少检验量2021/9/10年10月5455表3 上市抽验样品（固体制剂）的最少检验量2021/9/10年10月5556（8）无菌检查结果判断）无菌检查结果判断 培养及观察培养及观察n按规定的温度培养按规定的温度培养1414天天 。n培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。培养期间应逐日观察并记录是否有菌生长。n结果判断：阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得结果判断：阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长，

43、否则试验无效。有菌生长，否则试验无效。n澄清澄清 无菌生长无菌生长n浑浊浑浊 有菌生长有菌生长n若浑浊：可取培养液适量转种同种新鲜培养基，细菌若浑浊：可取培养液适量转种同种新鲜培养基，细菌2 2天，真菌天，真菌3 3天，观察是否再出现浑浊。天，观察是否再出现浑浊。n或取培养液涂片，染色，镜检，判定是否有菌。或取培养液涂片，染色，镜检，判定是否有菌。2021/9/10年10月5657（8）无菌检查结果判断）无菌检查结果判断 结果判断结果判断 n若供试品均澄清，或虽显浑浊但经确证若供试品均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；无菌生长，判供试品符合规定；n若供试品管中任何一管显浑浊并

44、确证有若供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定。菌生长，判供试品不符合规定。2021/9/10年10月5758（8）无菌检查结果判断）无菌检查结果判断n结果判断结果判断 符合下列任何一个条件，符合下列任何一个条件，可判试验结果无效：可判试验结果无效：无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；无菌检查法的要求；回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素。阴性对照管有菌生长；阴性对照管有菌生长；供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中供试

45、品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。所使用的物品和（或）无菌操作技术不当引起的。2021/9/10年10月5859（8）无菌检查结果判断）无菌检查结果判断n结果判断结果判断 试验若经确认无效，应重试。重试时，试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。生长，判供试品不符合规定。2021/9/10年10月5960谢谢大家！谢谢大家！谢谢大家！谢谢大家！Thank youThank you 2021/9/10年10月60