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1、第三章第三章 细胞工程的理论基础细胞工程的理论基础2021/7/27 星期二1 细胞培养细胞培养(cell culture)技术技术 即是选用各种细胞的最佳生存即是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究条件对活细胞进行培养和研究的技术，是广泛应用于生命科的技术，是广泛应用于生命科学等研究领域的重要技术。学等研究领域的重要技术。2021/7/27 星期二2n n动物细胞与组织培养（动物细胞与组织培养（cell and tissue culture）是动物细胞工程的重要技术基础。）是动物细胞工程的重要技术基础。n n动物的细胞与组织培养是指从活的机体中动物的细胞与组织培养是指从活的机体中
2、取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，在体外建立无菌、适温和一定营养条件等，使之生长和生存，并维持其结构和功能的使之生长和生存，并维持其结构和功能的技术。技术。2021/7/27 星期二3n n组织培养的概念组织培养的概念n n 组织培养这一名词实际上是一个通用名组织培养这一名词实际上是一个通用名词，习惯上泛指所有的体外培养。根据培词，习惯上泛指所有的体外培养。根据培养物的不同可概括为三个不同概念：细胞养物的不同可概括为三个不同概念：细胞培养、组织培养和器官培养。培养、组织培养和器官培养。2021/7/27 星期二4A：细
3、胞培养：将组织块用机械方法或酶解法：细胞培养：将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养液中呈悬浮状态培养的技术称为细胞培养。养。2021/7/27 星期二5B：组织培养：将活体的一小片组织放在盛有：组织培养：将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称块粘着后，沿底面平面移动生长的过程称为组织培养。为组织培养。从组织块中生长出来的仍然是细胞
4、，细胞在从组织块中生长出来的仍然是细胞，细胞在生长的同时也发生移动，至使组织培养难生长的同时也发生移动，至使组织培养难以长时间维持其原有结构，结果也就成了以长时间维持其原有结构，结果也就成了细胞培养。细胞培养。2021/7/27 星期二6C：器官培养：是指采取某些措施使器官的原：器官培养：是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。术。2021/7/27 星期二7体外培养的种类体外培养的种类2021/7/27 星期二8二、二、细胞培养的现实意义细胞培养的现实意义
5、2021/7/27 星期二9 生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹生物技术上：生产各种生技术产品如：狂犬病、小儿麻痹 症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白症等病毒疫苗，表皮生长因子及干扰素、白 细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。细胞介素等生长因子及单克隆抗体等。科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。科学研究上：在病毒学、免疫
6、学、遗传学、肿瘤学等方面。科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。科学研究上：在病毒学、免疫学、遗传学、肿瘤学等方面。临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾临床医学上：胎儿的遗传性疾病分析，药物筛选及某些疾 病的治疗等病的治疗等病的治疗等病的治疗等2021/7/27 星期二10三、细胞培养的优点三、细胞培养的优点2021/7/27 星期二111.1.研究的对象是活细胞研究的对象是活细胞 在实验过程中，根据要求可始终保在实验过程中，根据要求可始终保持细胞活力，并可长时间监控
7、、检测，甚至持细胞活力，并可长时间监控、检测，甚至定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞定量评估一部分活细胞的情况，包括活细胞的形态、结构、生命活动等。的形态、结构、生命活动等。2021/7/27 星期二122.2.研究条件可以人为控制研究条件可以人为控制 可以根据需要，控制包括可以根据需要，控制包括pHpH、温度、温度、氧气、二氧化碳、张力等物理、化学的条氧气、二氧化碳、张力等物理、化学的条件，同时，可以施加化学、物理、生物等件，同时，可以施加化学、物理、生物等因素作为条件而进行实验观察，这些因素因素作为条件而进行实验观察，这些因素同样可以处于严格控制之下。同样可以处于严格控制之下。2021
8、/7/27 星期二133.研究的样本可以达到比较均一性研究的样本可以达到比较均一性 通过细胞培养一定代数后，所得到的通过细胞培养一定代数后，所得到的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞系则可以达到均一性而属于同一类型的细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞细胞，需要时，可采用克隆化等方法使细胞达到纯化。达到纯化。2021/7/27 星期二144.4.研究内容便于观察、检测和记录研究内容便于观察、检测和记录 采用各种研究技术、记录方法：采用各种研究技术、记录方法：研究研究:倒置生物显微镜、荧光显微镜、倒置生物显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、流式细胞术、激光共焦显微镜、电子显微镜、流式细胞术
9、、激光共焦显微镜、免疫组织化学、原免疫组织化学、原 位杂交、同位素标记位杂交、同位素标记-记录记录:摄影照片、缩时电影、电视摄影照片、缩时电影、电视-2021/7/27 星期二155.5.研究的范围比较广泛研究的范围比较广泛 学科多：学科多：细胞学、免疫学、肿瘤学、生细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等物化学、遗传学、分子生物学等 对象广：对象广：各种动物：低等动物各种动物：低等动物-高等动物高等动物-人类人类 一种动物：不同年龄一种动物：不同年龄-不同组织不同组织-正常或异常（肿瘤正常或异常（肿瘤-）2021/7/27 星期二166.6.研究的费用相对较经济研究的费用相对较
10、经济 可提供大量、同一时期、重复性好的、生可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状相似的实验对象。物学性状相似的实验对象。2021/7/27 星期二17四、细胞培养的缺点四、细胞培养的缺点2021/7/27 星期二18 现人工模拟体内环境的技术已经很高现人工模拟体内环境的技术已经很高现人工模拟体内环境的技术已经很高现人工模拟体内环境的技术已经很高,但但但但,人工所模拟的条件与体内实际情况人工所模拟的条件与体内实际情况人工所模拟的条件与体内实际情况人工所模拟的条件与体内实际情况 仍不完全相同仍不完全相同仍不完全相同仍不完全相同.当细胞被置于体外培养后当细胞被置于体外培养后当细胞被置于体外培养
11、后当细胞被置于体外培养后,生活在缺乏动态平衡的环境中生活在缺乏动态平衡的环境中生活在缺乏动态平衡的环境中生活在缺乏动态平衡的环境中,久了，必然发生变化久了，必然发生变化久了，必然发生变化久了，必然发生变化.2021/7/27 星期二19 因此，对于体外培养的细胞，应该把他们视作一种既能保持动物体内原细胞一定的性状、结构和功能，又具有某些改变的，特定的细胞群体，而不能将之与体内的细胞完全等同。2021/7/27 星期二20五、细胞培养的工作原则五、细胞培养的工作原则2021/7/27 星期二21u有标准化的工作方法有标准化的工作方法 u培养用的液体极多（如培养液、胰蛋白酶、培养用的液体极多（如培
12、养液、胰蛋白酶、HANKSHANKS液及液及 u抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，抗菌素等），应由专人负责，并保证做到按规程行事，配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明配制浓度准确，灭菌可靠，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等。名称、浓度、消毒与否和制备日期等。u一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放。消毒品与未消毒品应分别存放。2021/7/27 星期二22第二
13、节第二节 组织培养的细胞生物学组织培养的细胞生物学2021/7/27 星期二23一、体内外细胞的差异和分化一、体内外细胞的差异和分化2021/7/27 星期二24（一）体内外细胞的差异（一）体内外细胞的差异 培养细胞最多见的表现是：失去原有组培养细胞最多见的表现是：失去原有组织结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现织结构和细胞形态，分化减弱或不显，出现类似类似“反祖反祖”现象；表现为细胞趋单一化，或现象；表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群。2021/7/27 星期二251.与体内主要不同：与体内主要不同：相对孤立、相对单一相对孤立
14、、相对单一 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节调节 和细胞相互间的影响和细胞相互间的影响 2021/7/27 星期二262.2.主要表现主要表现主要表现主要表现 失去原有组织结构和细胞形态失去原有组织结构和细胞形态失去原有组织结构和细胞形态失去原有组织结构和细胞形态 分化减弱或不显分化减弱或不显分化减弱或不显分化减弱或不显 细胞趋向单一化；细胞趋向单一化；细胞趋向单一化；细胞趋向单一化；3.3.提示提示提示提示 要正确认识体外培养细胞要正确认识体外培养细胞要正确认识体外培养细胞要正确认识体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体。是一种特定条件下生长的细
15、胞群体。是一种特定条件下生长的细胞群体。是一种特定条件下生长的细胞群体。2021/7/27 星期二27（二）培养细胞的（二）培养细胞的 分化分化 1不适应不适应(Deadaption)：表现为，细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，表现为，细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，如肝细胞产生酪氨酸转移酶如肝细胞产生酪氨酸转移酶(Tyrosine Aminotranserase)特性特性的丧失的丧失.2脱分化或去分化脱分化或去分化(Dedifferentiation)细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化的能力。化的能力。2021/7
16、/27 星期二282021/7/27 星期二29二、培养细胞形态分类二、培养细胞形态分类2021/7/27 星期二30体外细胞培养物的生长类型 按生长方式按生长方式:2型型 粘粘附附型型细细胞胞:附附着着在在某某一一固固相相支支持持物物表表面面才才能生长的细胞。能生长的细胞。悬悬浮浮型型细细胞胞:不不必必附附着着于于固固相相支支持持物物表表面面，而而在悬浮状态下即可生长的细胞。在悬浮状态下即可生长的细胞。绝绝大大多多数数有有机机体体细细胞胞属属粘粘附附型型细细胞胞，只只有有少少数数细细胞胞类类型型如如某某些些肿肿瘤瘤细细胞胞和和白白细细胞胞可可在在悬浮状态下生长。悬浮状态下生长。2021/7/
17、27 星期二31体外培养细胞的分型 2021/7/27 星期二32贴附(粘附)型细胞 粘附粘附:是大多数有机体细胞在体内是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在方式生存和生长发育的基本存在方式含义含义 两方面两方面结果结果 基于粘附特性，使细胞与细胞之间基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织，相互结合形成组织，有机体的绝大多数细胞必须有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面粘附于一固相表面 才能生存和生长。才能生存和生长。2021/7/27 星期二33培养时：这些细胞被放到体外环境中以后培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同同样需要粘附于某一固相表面才能生存和生长，样需要
18、粘附于某一固相表面才能生存和生长，因而属于粘附型细胞。因而属于粘附型细胞。粘附粘附(锚定或锚着锚定或锚着)依赖型依赖型(性性)细胞：唯有粘附细胞：唯有粘附于固相表面才能生存的细胞于固相表面才能生存的细胞2021/7/27 星期二34 类型类型类型类型 细胞在体内、外的粘附方式：存在差异细胞在体内、外的粘附方式：存在差异细胞在体内、外的粘附方式：存在差异细胞在体内、外的粘附方式：存在差异 体内：粘附是全方位体内：粘附是全方位体内：粘附是全方位体内：粘附是全方位 外形具有复杂的立体特征外形具有复杂的立体特征外形具有复杂的立体特征外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面体外：多数
19、情况，细胞只有一个附着平面体外：多数情况，细胞只有一个附着平面体外：多数情况，细胞只有一个附着平面 外形一般与体内时明显不同外形一般与体内时明显不同外形一般与体内时明显不同外形一般与体内时明显不同 按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为几大类按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为几大类按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为几大类按照培养细胞粘附生长时的主要形态，可分为几大类型型型型 2021/7/27 星期二35分类分类 根据形态大致的不同，主要根据形态大致的不同，主要2类：类：上皮细胞型上皮细胞型 成纤维细胞型成纤维细胞型 其它，不定型其它，不定型2021/7/27 星期二36上皮细胞
20、型 名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于名称：仅形态上似体内，实际上不完全等于-来源：来源于外胚层，内胚层细胞来源：来源于外胚层，内胚层细胞来源：来源于外胚层，内胚层细胞来源：来源于外胚层，内胚层细胞 如：皮肤及其衍生物如：皮肤及其衍生物如：皮肤及其衍生物如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤上皮性肿瘤上皮性肿瘤上皮性肿瘤形态：类似体内的上皮细胞形态：类似体内的上皮细胞形态：类似体内的上皮细胞形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核扁平
21、，不规则多角形，中有圆形核扁平，不规则多角形，中有圆形核扁平，不规则多角形，中有圆形核 2021/7/27 星期二37生长特点生长特点生长特点生长特点 易相连成片易相连成片易相连成片易相连成片 相相相相靠靠靠靠紧紧紧紧密密密密相相相相连连连连成成成成 薄薄薄薄 层层层层-铺石状铺石状铺石状铺石状 生长时呈膜状移动生长时呈膜状移动生长时呈膜状移动生长时呈膜状移动 很很很很少少少少脱脱脱脱离离离离细细细细胞胞胞胞群群群群而而而而单个活动单个活动单个活动单个活动 体外培养细胞类型（体外培养细胞类型（1）上皮细胞型上皮细胞型2021/7/27 星期二38成纤维细胞型 名名称称：凡凡在在培培养养中中形形
22、态态与与成成纤纤维维细细胞胞类类似似的的来源：由中胚层间充质组织起源的组织来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞如：真正的成纤维细胞 心心肌肌，平平滑滑肌肌，成成骨骨细细胞胞，血管内皮血管内皮形态：似体内成纤维细胞的形态形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形胞体梭形或不规则三角形 胞胞质质向向外外伸伸出出23个个长长短短不不等等的的突起突起 中有卵圆形核中有卵圆形核2021/7/27 星期二39生长特点：生长特点：生长特点：生长特点：排列成放射状，排列成放射状，排列成放射状，排列成放射状，漩涡状漩涡状漩涡状漩涡状 并不紧靠连成并不紧靠连成并不紧靠连成并不紧靠连成
23、片，片，片，片，细胞细胞细胞细胞细胞接触易断细胞接触易断细胞接触易断细胞接触易断开而开而开而开而 单独行单独行单独行单独行动动动动 游离的单独的游离的单独的游离的单独的游离的单独的成纤维样细胞，成纤维样细胞，成纤维样细胞，成纤维样细胞，常有几个伸长常有几个伸长常有几个伸长常有几个伸长的细胞突起的细胞突起的细胞突起的细胞突起体外培养细胞类型（体外培养细胞类型（2）成纤维细胞型成纤维细胞型2021/7/27 星期二40贴附生长型贴附生长型-类型类型1.与体内同名的细胞不完全相同与体内同名的细胞不完全相同 如如：形形态态相相似似的的成成纤纤维维细细胞胞，可可不不同同来来源源 自自同同一一动动物物不不
24、同同组组织织的的成成纤纤维维样样细细胞胞相相似似但但 发展趋向不同发展趋向不同2.培养细胞的形态不稳定培养细胞的形态不稳定 条件改变，细胞形态可有变化条件改变，细胞形态可有变化 2021/7/27 星期二41培养细胞形态不稳定培养细胞形态不稳定培养细胞形态不稳定培养细胞形态不稳定血清血清血清血清 Hela Hela 高血清高血清高血清高血清 低血清低血清低血清低血清 成纤维细胞样成纤维细胞样成纤维细胞样成纤维细胞样 上皮样细上皮样细上皮样细上皮样细胞胞胞胞 pH Hela pH Hela 太酸或太碱太酸或太碱太酸或太碱太酸或太碱 标准标准标准标准pHpH 成纤维细胞样成纤维细胞样成纤维细胞样成
25、纤维细胞样 上皮样细上皮样细上皮样细上皮样细胞胞胞胞 细胞密度细胞密度细胞密度细胞密度 3T3 3T3 低密度低密度低密度低密度 高密度高密度高密度高密度 成纤维细胞样成纤维细胞样成纤维细胞样成纤维细胞样 上皮样细上皮样细上皮样细上皮样细胞胞胞胞 生长状态改变生长状态改变生长状态改变生长状态改变 悬浮或贴附悬浮或贴附悬浮或贴附悬浮或贴附 悬浮悬浮悬浮悬浮 贴附贴附贴附贴附 圆形圆形圆形圆形 成纤维或上成纤维或上成纤维或上成纤维或上皮样皮样皮样皮样 转化与否转化与否转化与否转化与否 未转化未转化未转化未转化 转化后转化后转化后转化后 成纤维样成纤维样成纤维样成纤维样 可成上皮可成上皮可成上皮可成
26、上皮样样样样 2021/7/27 星期二42悬浮生长型概念概念概念概念 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 或以机械方法使保持悬浮状态下生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长来源来源来源来源 自血，脾或骨髓，自血，脾或骨髓，自血，脾或骨髓，自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞尤以血中白细胞尤以血中白细胞尤以血中白细胞 癌肿细胞也可能癌肿细胞也可能癌肿细胞也可能癌肿细胞也可能特点特点特点特点 在悬浮中生长良好在悬浮中生长良好在悬浮中生长良好
27、在悬浮中生长良好 细胞圆形，单个或小细胞团细胞圆形，单个或小细胞团细胞圆形，单个或小细胞团细胞圆形，单个或小细胞团2021/7/27 星期二43优点优点优点优点 生存空间大，提供数量大生存空间大，提供数量大生存空间大，提供数量大生存空间大，提供数量大 传代方便传代方便传代方便传代方便(不需消化不需消化不需消化不需消化)易于收获易于收获易于收获易于收获 可获得稳定状态可获得稳定状态可获得稳定状态可获得稳定状态缺点缺点缺点缺点 观察不方便观察不方便观察不方便观察不方便 很多细胞不能悬浮生长很多细胞不能悬浮生长很多细胞不能悬浮生长很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞尤以正常细胞尤以正常细胞尤以正常细胞
28、)2021/7/27 星期二44悬浮型概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞来源：自血，脾或骨髓，尤以血中白细胞癌肿细胞特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团优点：生存空间大，提供数量大，传代方便优点
29、：生存空间大，提供数量大，传代方便优点：生存空间大，提供数量大，传代方便优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化不需消化不需消化不需消化)，易于收获，可获得稳定状态易于收获，可获得稳定状态易于收获，可获得稳定状态易于收获，可获得稳定状态缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细尤以正常细尤以正常细尤以正常细胞胞胞胞)2021/7/27 星期二45 HL-60 分化细胞分化细胞Giemsa染色染色1.细胞种类：细胞种类：HL-60；2.培养的天数：培养的天数：ATRA
30、 1微摩尔作用微摩尔作用5天；天；3.放大倍速：倒置显微镜放大倍速：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：培养基种类：1640+8胎牛血清；胎牛血清；5.细胞状态与特征简述：悬浮细胞，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或细胞状态与特征简述：悬浮细胞，分化的细胞核浆比例减小，核仁减少或 消失，胞核呈杆状或分叶状。消失，胞核呈杆状或分叶状。2021/7/27 星期二46 KU8121.细胞种类：人嗜碱细胞性白血病细胞系；2.培养的天数：5d；3.放大倍速：倒置显微镜 X20；4.培养基种类：RPMI1640+10%新生牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈圆形，悬浮生长。2021/7/27 星期二47
31、 HeLa细胞1.细胞种类：人HeLa细胞传代培养；2.培养的天数：7d；3.放大倍速：倒置显微镜 X200；4.培养基种类：DMEM+10%小牛血清；5.细胞状态与特征简述：细胞呈多角形，贴壁生长。2021/7/27 星期二48 K562细胞1.细胞种类：K562（人慢性红白血病细胞株）；2.培养的天数：传代后2天；3.放大倍数：倒置显微镜 X10；4.培养基种类：RPMI1640+10%胎牛血清，4mM Glutamine；5.细胞状态与特征简介：悬浮生长，少数贴壁，喜爱成团悬浮。2021/7/27 星期二49三、培养细胞的生长特点三、培养细胞的生长特点2021/7/27 星期二50（一）
32、贴附（一）贴附（二）接触抑制（二）接触抑制（三）密度抑制（三）密度抑制2021/7/27 星期二51四、培养细胞的生长和增殖过程四、培养细胞的生长和增殖过程2021/7/27 星期二52（一）组织培养细胞生命期（一）组织培养细胞生命期(Life Span of Culture Cells)培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括原代培养期、传代培殖和生长的时间。包括原代培养期、传代培养期及衰退期。养期及衰退期。2021/7/27 星期二53正常培养的细胞周期2021/7/27 星期二54n n游离期游离期n n 悬浮，胞质回缩，全部细胞变
33、为圆球形。悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。n n吸附期吸附期n n 贴附底物，一般贴附底物，一般24小时内贴壁。小时内贴壁。n n潜伏期潜伏期n n 此时细胞有生长活动，基本无增殖。此时细胞有生长活动，基本无增殖。n n 细胞株潜伏期一般为细胞株潜伏期一般为624小时。小时。n n对数生长期对数生长期n n 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进最适合进 n n 行实验研究。行实验研究。n n停止期（平台期）停止期（平台期）n n 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂裂n n 机制：接触抑制、密度依赖性机制：接
34、触抑制、密度依赖性2021/7/27 星期二55u原代培养原代培养(Primary Culture)期期也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续次传代阶段，一般持续1-4周。周。特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与特点：细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。与 体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。2021/7/27 星期二56u传代期传代期特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺特点：在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺 盛，并能维持二倍体核型。盛，并
35、能维持二倍体核型。传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系过程叫传代。初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。）。2021/7/27 星期二57u衰退期衰退期u特点：此
36、期细胞仍然生存，但增殖很慢或特点：此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，不增殖，u 最后衰退凋亡。最后衰退凋亡。2021/7/27 星期二58（二）体外培养细胞一代生存期（二）体外培养细胞一代生存期潜伏期潜伏期指数增生期指数增生期停滞期停滞期所谓细胞的所谓细胞的“一代一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。2021/7/27 星期二59（三）单个细胞的生长过程（三）单个细胞的生长过程2021/7/27 星期二60（四）（四）、体外培养细胞的遗传学特征、体外培养细胞的遗传学特征（1）核型变化）核型变化（2）永生化和恶变）永生化和恶变（3）细胞性别）细胞性
37、别2021/7/27 星期二61（五）（五）、体外培养细胞的生存环境、体外培养细胞的生存环境（一）无污染环境（一）无污染环境（二）温度（二）温度（三）气体环境和氢离子浓度（三）气体环境和氢离子浓度2021/7/27 星期二62（六）（六）、体外培养细胞生存所需基本物质、体外培养细胞生存所需基本物质（1）糖）糖（2）氨基酸）氨基酸（3）维生素）维生素（4）促生长因子）促生长因子（5）其它物质）其它物质2021/7/27 星期二63（七）（七）细胞冻存和复苏细胞冻存和复苏n n细胞深低温保存的基本原理是：细胞深低温保存的基本原理是：n n 在在70以下时，细胞内的酶活性均己停以下时，细胞内的酶活性
38、均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。期保存。n n细胞低温保存的关键：细胞低温保存的关键：n n 在于通过在于通过020阶段的处理过程。在此温阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。严重损伤。2021/7/27 星期二642021/7/27 星期二65冻存和复苏的原则：慢冻快融n n慢冻程序慢冻程序 n n 4 10 分钟分钟n n 20 30 分钟分钟n n 80 16-18 小时小时(或隔夜或隔夜)n n 液氮罐长期储存。液氮罐长期储存。2021/7/27 星期二66n n冻存
39、管冻存管n n1.2ml n n2ml，n n5ml2021/7/27 星期二67液氮罐2021/7/27 星期二682021/7/27 星期二69细胞复苏方法（1 1 1 1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入）从液氮中取出冷冻管，迅速投入）从液氮中取出冷冻管，迅速投入）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37373737 38 38 38 38水浴中，使其融化（水浴中，使其融化（水浴中，使其融化（水浴中，使其融化（1 1 1 1分钟左右）；分钟左右）；分钟左右）；分钟左右）；（2 2 2 2）5 5 5 5分钟内用培养液稀释至原体积的分钟内用培养液稀释至原体积的分钟内用培养液稀释至原体积的分钟内用培养液
40、稀释至原体积的10101010倍以上；倍以上；倍以上；倍以上；（3 3 3 3）低速离心）低速离心）低速离心）低速离心10101010分钟；分钟；分钟；分钟；（4 4 4 4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。2021/7/27 星期二702021/7/27 星期二71低温保护剂的应用n n在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻
41、存效果。n n常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是DMSODMSODMSODMSO，它是一种渗透性保护剂。，它是一种渗透性保护剂。，它是一种渗透性保护剂。，它是一种渗透性保护剂。n n也有用甘油的也有用甘油的也有用甘油的也有用甘油的n n冻存液：冻存液：冻存液：冻存液：n n 含含含含20%20%20%20%血清培养基血清培养基血清培养基血清培养基n n 10%DMSO 10%DMSO 10%DMSO 10%DMSO（或（或（或（或10101010甘油）甘油）甘油）甘油）n n DMSO DMSO DMSO DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细
42、胞。液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。2021/7/27 星期二72细胞欲冷冻保存时，细胞浓度应该多少？n n冷冻管内细胞数目一般为冷冻管内细胞数目一般为1106 cells/ml n n融合瘤细胞则以融合瘤细胞则以5106 cells/ml 为宜。为宜。2021/7/27 星期二73细胞的运输技术细胞的运输技术2021/7/27 星期二74（八）细胞培养的污染和检测（八）细胞培养的污染和检测uu细胞污染的种类细胞污染的种类:uu 细菌、酵母菌、霉菌和病细菌、酵母菌、霉菌和病毒毒uu污染源污
43、染源:uu 无菌操作技术不当无菌操作技术不当;uu 操作室环境不佳操作室环境不佳;uu 污染之血清污染之血清;uu 污染之细胞污染之细胞.2021/7/27 星期二75 细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。洋葱佰克霍尔德菌（洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单）原属假单胞菌属，是植物病原菌。胞菌属，是植物病原菌。2021/7/27 星期二76白色念珠菌污染白色念珠菌污染 2021/7/27 星期二77真菌感染真菌感染2021/7/27 星期二78支原体污染电镜照片支原体污染电镜照片,煎蛋状和其他形状煎蛋状和其他形状 2021/7
44、/27 星期二792021/7/27 星期二80 I.细菌和真菌的污染和检测n n肉眼直接观察法肉眼直接观察法n n培养检查法培养检查法n n显微镜观察法显微镜观察法2021/7/27 星期二81.支原体的污染和检测HayflickHayflick培养基直接培养法培养基直接培养法DNADNA荧光染色法荧光染色法PCRPCR方法方法相差显微镜观察法相差显微镜观察法测出细胞株有支原体污染时，测出细胞株有支原体污染时，应应直接灭菌后丢弃，以避免污染直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。其它细胞株。2021/7/27 星期二82III.病毒的污染和检测病毒的污染和检测n n细胞的直接观察细胞的直接观察
45、n n动物接种检查动物接种检查n n电子显微镜观察电子显微镜观察n n免疫学检查免疫学检查n nPCR技术技术2021/7/27 星期二83第三节第三节 建立细胞系或细胞株建立细胞系或细胞株2021/7/27 星期二84一、体外培养细胞的种类和命名一、体外培养细胞的种类和命名（一）初代培养（一）初代培养(原代培养原代培养)初代培养又称原代培养，即直接从体内取初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养一旦已进行传代培养(subculture)的细胞，的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。便不再称
46、为初代培养，而改称为细胞系。2021/7/27 星期二85原代培养n n直接从体内取出的细胞进行的第一次培直接从体内取出的细胞进行的第一次培直接从体内取出的细胞进行的第一次培直接从体内取出的细胞进行的第一次培养物。养物。养物。养物。n n优点：优点：优点：优点：n n 组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体生较大变化，在一定程度上能够反映体生较大变化，在一定程度上能够反映体生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。内的状态。内的状态。内的状态。大鼠肝细胞原代培养
47、1.细胞种类：大鼠原代肝细胞；2.培养的天数：刚分离，未经培养；细胞状态与特征简述：刚分离时球形透亮，贴壁 后呈不规则。2021/7/27 星期二862021/7/27 星期二872021/7/27 星期二88(二）传代培养二）传代培养n n将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养称为传代培养n n原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代
48、培养。即传代或称为传代培养。HepG2细胞 细胞种类：人肝肿瘤细胞；培养的天数：传代培养2天；细胞状态与特征简述：呈多角型、不规则 贴壁生长，成团聚集。2021/7/27 星期二892021/7/27 星期二902021/7/27 星期二91根据细胞生长的恃点，传代方法有根据细胞生长的恃点，传代方法有根据细胞生长的恃点，传代方法有根据细胞生长的恃点，传代方法有3 3 3 3种：种：种：种：1 1 1 1悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（离心法传代：离心（离心法传代：离心（离心法传代：离心（1000100010001000转转转转/分）去上清，沉
49、淀物加新分）去上清，沉淀物加新分）去上清，沉淀物加新分）去上清，沉淀物加新 培养液后再混匀传代。培养液后再混匀传代。培养液后再混匀传代。培养液后再混匀传代。2 2 2 2半悬浮生长细胞传代（半悬浮生长细胞传代（半悬浮生长细胞传代（半悬浮生长细胞传代（HelaHelaHelaHela细胞）细胞）细胞）细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用 直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。直接吹打法使细胞从瓶壁脱
50、落下来，进行传代。直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3 3 3 3贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。采用酶消化法传代。采用酶消化法传代。采用酶消化法传代。常用的消化液有常用的消化液有常用的消化液有常用的消化液有0.250.250.250.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。细胞传代方法细胞传代方法2021/7/27 星期二92首次传代注意事项细胞生长密度不高时，不能急于传代；原代培养的贴壁细胞需控制消化时间；吹打已消化的细胞应减少机械损伤；首次传代时细胞接种数量要多一些；首次传代培养的pH应偏低些；小牛血清浓度可