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1、第 四 章生物化工产品的开发及生产技术 n有机酸有机酸n氨基酸氨基酸n生物可降解塑料生物可降解塑料n功能性食品添加剂功能性食品添加剂n生物农药与生物肥料生物农药与生物肥料n生物药物及其他生物产品生物药物及其他生物产品1 1、柠檬酸：、柠檬酸：n柠檬酸(“枸椽酸”)：第一有机酸，2008年全球柠檬酸总销量高达115万吨，食品用途约占6成，医药和其它工业用途（化妆品，洗涤剂等）约占4成。我国是世界主要柠檬酸生产国与出口国，出口量高达15万吨以上。n 第一节第一节 有机酸有机酸一、重要的有机酸一、重要的有机酸n n国内主要生产商有蚌埠丰源集团、无锡中亚罗氏公司以及青岛扶桑化学公司等。其总产量即达20
2、万吨左右。墨西哥、日本和美国的生产企业相继关闭其柠檬酸生产线，我国柠檬酸将在国际市场上占主导地位。n柠檬酸的产品主要是：无水柠檬酸、一水柠檬酸、柠檬酸钠盐、柠檬酸钾盐、柠檬酸铝盐、柠檬酸胺盐。柠檬酸的消费领域：饮料行业占4045 食品添加剂等占1520 洗涤剂占2030 医药占5 其它占10n具有广泛用途的有机酸。世界乳酸的总产量约为20万吨左右，日本和美国两国的乳酸需求量3.5万吨。我国的乳酸目前已形成了约4万吨的生产能力。n青岛扶桑化学公司是国内最大的精制(发酵)乳酸出口企业。n 2 2、乳酸、乳酸聚乳酸牵头发展聚乳酸牵头发展n PLA为一种无毒高分子新材料，在环境中可自动降解，可用于生产
3、医用塑料制品和食品包装等。产业界认定为新世纪最有发展前途的新型材料。由于我国原料玉米丰富，发展乳酸及聚乳酸产业的前景广阔。目前，乳酸生产成本偏高以及聚乳酸聚合难题成为制约乳酸工业发展的瓶颈。n n n发酵法生产的乳酸有L乳酸和D乳酸。我国用德氏杆菌厌氧发酵生产的乳酸96为D型，L型只有4。化学合成法生产的乳酸D型和L型个50。称DL乳酸。n苹果酸在饮料中使用较多。但由于价格较贵，故苹果酸的用途受到了一定的限制。全球苹果酸的年产销量约在3万吨左右。苹果酸有清除牙齿色斑和牙垢(牙石)的美容作用。故日本花王等日化产品厂商均已在牙膏、牙粉等洁齿产品中添加苹果酸。3 3、苹果酸、苹果酸生产成本较高生产成
4、本较高n 而L苹果酸可用于医药工业的输液、pH调节剂和某些药物的中间体。每吨纯品6570万元人民币。生产成本高,出口数量少。我国采用固定化菌体将富马酸转化为L苹果酸，因技术不过关，富马酸残留高，出口困难。而发酵法生产L苹果酸仍处于研究阶段。葡糖酸是唯一具有促进双歧杆菌等“益生菌”生长作用的有机酸。蜂蜜、酿造醋等产品均含有一定量的天然葡糖酸。酸味为柠檬酸的1/3。葡糖酸作为食品和医药原料(如用于生产“葡糖酸钙)的用量正在逐年上升。4 4、葡糖酸、葡糖酸有保健新用途有保健新用途 全球葡糖酸的产销量约在2万吨左右，其中90%用于食品加工(如作为豆腐凝固剂)，用于医药的仅占1成。主要产品葡萄糖酸、葡萄
5、糖酸钙、葡萄糖酸内酯,其次，葡萄糖酸的钙、钠、铵、葡萄糖酸的钙、钠、铵、铁等盐类广泛地用于医药、食品、纺织、皮革等铁等盐类广泛地用于医药、食品、纺织、皮革等工业上工业上。主要来源是葡萄酒生产厂。酒石酸在食品工业中应用远远不如柠檬酸那样广泛，但它却是医药工业的重要原料。许多难溶药物均可加工成为水溶性极佳的酒石酸盐(如经典药物“酒石酸锑钾”)。欧洲各大葡萄酒厂是世界最大的酒石酸生产基地，全球80%的酒石酸产自欧洲。发酵法生产酒石酸仍在研究中。5 5、酒石酸、酒石酸八成产自欧洲八成产自欧洲琥珀酸在食品工业中应用较少，也属医药工业的常用原料之一。主要用于生产难溶药物的水溶性盐琥珀酸盐。全球琥珀酸总产销
6、量约在1万-2万吨左右。我国的琥珀酸生产仍以化学合成为主。未见发酵法生产琥珀酸的报道。6 6、琥珀酸、琥珀酸产量不大产量不大 重要的化工原料，主要用于晴纶化纤、树脂、橡胶、涂料、造纸、制药、农药、轻工、食品等领域（合成树脂或在工业上用作除垢剂等合成树脂或在工业上用作除垢剂等）。世界年需衣康酸56万吨。主要生产国美国、日本、俄罗斯。我国以发酵法生产衣康酸，年产量5000t。大部分内销。因技术存在问题，产品质量不过关。外销困难。7 7、衣康酸、衣康酸常见有机酸发酵生产菌种常见有机酸发酵生产菌种柠檬酸柠檬酸 Aspergillus nigerAspergillus niger（黑曲霉）（黑曲霉）葡萄
7、糖酸葡萄糖酸 Aspergillus nigerAspergillus niger（黑曲霉）（黑曲霉）醋酸醋酸 Acetobacter acetiAcetobacter aceti（醋化醋杆菌）（醋化醋杆菌）乳酸乳酸 Lactobacilus delbrackiiLactobacilus delbrackii（德氏乳杆菌）（德氏乳杆菌）-酮戊二酸酮戊二酸 Candida spCandida sp.（一种假丝酵母）（一种假丝酵母）衣康酸等衣康酸等 Aspergillus terreusAspergillus terreus（土曲霉）（土曲霉）水杨酸水杨酸 Pseudomonas aerugino
8、saPseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）（铜绿假单胞菌）丙酸丙酸 Propioni bacterium shermaniiPropioni bacterium shermanii(谢氏丙酸杆菌谢氏丙酸杆菌)柠檬酸柠檬酸（citric acid）又名枸橼酸，学名3-羟基-3-羧基戊二酸(C6H8O7)是生物体代谢产物之一，广泛分布于自然界、动物及人的器官中。无色透明或半透明晶体，或粒状、微粒状粉末，无臭，具有强烈的酸味，但令人愉快。稍有涩味。极易溶于水，乙醇，微溶于乙醚。无旋光性。二二 柠檬酸的发酵生产柠檬酸的发酵生产HOOCCH2CHOHCOOHCH2COOH(一)、概
9、述（1 1）食品方面：柠檬酸被称为第一食用酸味剂）食品方面：柠檬酸被称为第一食用酸味剂饮料不仅赋予饮料水果风味，而且具有增溶、缓冲、抗氧化等作用，能是饮料中的糖、香精、色素等成分交融协调果酱和果冻，酿造酒，冰激淋和人造奶油（增加乳化稳定性）、腌制品（除腥去臭、抗氧化）、罐头食品、豆制品和调味品 1 1、柠檬酸的应用、柠檬酸的应用n（2）医药工业、美容、化妆品工业中作为活性药n物的增溶剂，改善药物口感和清凉，解毒功能。n洗发和染发剂中均有柠檬酸具有防腐，去除头皮n屑功能，洗头时可增加头发的光泽，恢复头发的n弹性。n n n（3）金属工业中作为净化剂，可去除有色金属表面的氧化物。在洗衣粉中作为去垢
10、剂，作为磷酸盐的替代用品。电镀工业中作为电镀缓冲剂和络合剂、治理工业废气中用于回收SO2等等1784年;由Scheels氏发现柠檬酸 1893年至1917年：青霉菌生产（德国微生物学者 Wehmer首先用青霉菌生产柠檬酸）；1917年至1938年：黑曲霉，浅盘发酵，奠定了大 规模生产的基础；1938年至1951年：深层发酵，用糖蜜为原料（1951年 美国Miles公司首先采用深层发酵法）。2 2、国外柠檬酸发酵技术发展的三个历史时期、国外柠檬酸发酵技术发展的三个历史时期我国在20世纪40年代初开始浅盘发酵；60年代末开始深层发酵（先为薯干原料，后发展到精淀粉或糖蜜原料）；1970年开始进行石油
11、为原料发酵柠檬酸(C1022链烷烃等）目前，我国柠檬酸生产厂已过百家，年生产能力达80多万吨，居世界第一位。淀粉质原料或糖质原料：黑曲霉（Aspergillus niger）正烷烃为原料：解脂假丝酵母（Candida lipolytica）热带假丝酵母（C.tropicalis）(二二)、柠檬酸生产菌、柠檬酸生产菌(三三)、柠檬酸发酵生产方法、柠檬酸发酵生产方法 对于典型的好氧发酵，工业上的生产方法：-液体表面发酵法 -固态发酵法 -液态深层发酵法 利用液体中的溶解氧利用气相中的氧1、简介：将接种后的发酵液分装入发酵盘进行发酵的方法。传统方法，设备投资少，动力消耗低，原料粗放、价廉，生产易控制
12、，目前已实现全部自动化操作。缺点是设备占地大，劳动强度大，能耗高，产率和回收率低，副产物多。(四四)、柠檬酸的静止浅盘发酵工艺、柠檬酸的静止浅盘发酵工艺2 2、浅盘发酵设备、浅盘发酵设备n发酵盘：材质，以不锈钢为佳。规格4m1.2m0.15m。其次还有铁盘、铝盘、耐酸塑料盘。n发酵盘经常受到酸液、高温蒸汽、甲醛、微生物的侵蚀，所以材料和涂料要求严格。n为了防止蒸发过快和天花板冷凝水滴入盘中，每个发酵盘上有一盘罩3、发酵室：具有良好的通风系统，保证温度、湿度和风量能满足不同阶段的发酵要求，并且保证无菌。每个发酵室装两排发酵架，每架放10个发酵盘。发酵架连接通风管道、排风管道和进料，出料管道，接种
13、喷雾管道。（1）目的：获取大量高质量的分生孢子（孢子或干孢子），所以又称为“干孢子生产”。l对孢子的质量要求：形态整齐均一，无杂菌混入，发芽率高，发芽后生长速率适当，产酸活力高，无退化现象。l黑曲霉的扩大培养一般经过三个阶段，相应的阶段依次称为一级、二级、和三级种子培养。扩大培养的工艺流程和各级的培养方法因地而异，按照最终成品的形式可以区分为麸曲生产和孢子生产。4 4、菌种的扩大培养、菌种的扩大培养5 5、干孢子制备工艺流程：、干孢子制备工艺流程：一级发酵用种子质量鉴定培养器液态培养3235干孢子收集干燥4050无菌空气成品保藏使用前检查斜面培养30原菌种三角瓶培养3二级三级（总发酵时间：89
14、天）6 6、液体表面发酵工艺流程、液体表面发酵工艺流程pHpH值值3 34.54.5搅拌煮沸搅拌煮沸151530min30min静止静止4h4h取上清取上清加等体积沸水，加等体积沸水，糖蜜质量糖蜜质量1%1%生石灰生石灰糖蜜原料糖蜜原料硫酸或硫酸钠硫酸或硫酸钠糖蜜浓度糖蜜浓度121216%16%（以蔗糖计）（以蔗糖计）冷却至冷却至60607070加营养盐加营养盐和抗菌剂和抗菌剂 入室装盘入室装盘（404045 45 液层深液层深8 82020 ）冷却至冷却至3535接种接种 黑曲霉干孢子黑曲霉干孢子（100mg/m100mg/m2 2表面积）表面积）通风培养通风培养（3535，3 3天）天）控
15、温发酵至结束控温发酵至结束262628 28，pH2.5pH2.5最大通风量最大通风量(15(1518m18m3 3/m/m2 2hh，湿度湿度75%75%以上以上)(五五)、柠檬酸的深层发酵工艺、柠檬酸的深层发酵工艺1 1 柠檬酸发酵的原料柠檬酸发酵的原料原料n糖质原料和石油烷烃。n糖质原料包括n薯类：甘薯、薯干、木薯、木薯干、马铃薯、薯渣。n谷类：玉米、小麦、面粉、大米。n淀粉：谷类与薯类加工的淀粉。n砂糖：白砂糖、赤砂糖、糖蜜。n n淀粉糖：淀粉水解糖(单糖、双糖、糊精、葡萄糖母液)n果实，粮食加工下脚料：各种含糖果实、糖食加工的下脚料等。n石油烷烃原料包括正烷烃、乙酸、乙醇等 淀粉水解
16、糖的制备淀粉水解糖的制备 淀粉质原料是发酵工业常用的原料，大多数发酵生产菌不能直接利用或仅微弱利用淀粉，因此淀粉质原料必须转化为葡萄糖等可发酵性糖，才能被生产菌利用。工业生产将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，所制得的糖液称为淀粉水解糖n碳源：黑曲霉能利用的碳源很多，淀粉和二糖，单糖大多能利用。从生产角度看，葡萄糖、蔗糖、糊精是最好的碳源。但为了降低成本，多用廉价的甘薯、玉米、小麦及其淀粉、糖蜜。高糖浓度是柠檬酸深层发酵的特征，薯干粉深层发酵，粉浆浓度可达1620。淀粉质粉浆浓度25%。2 2 培养基培养基生理酸性氮:（NH4)2SO4,（NH4)3PO4（NH4)2HPO4（NH4)Cl
17、（NH4)2CO3生理碱性氮:NaNO3,KNO3 LiNO3 CaNO3 有机氮:麸皮、米糠、蛋白胨、氨基酸、尿素等。氮源：柠檬酸发酵中的氮源有氮源是黑曲霉合成细胞物质和代谢调节的重要物质，特别是细胞中铵离子浓度的升高，能解除ATP和柠檬酸对磷酸果糖激酶的反馈抑制，有利于柠檬酸的生成与积累。在柠檬酸生产中，黑曲霉偏好生理酸性氮如（NH4)2SO4，酸性氮中的铵离子被利用后，使培养基变酸，可以使发酵中的黑曲霉生长阶段结束，转入产酸阶段，pH下降到较低水平有利于柠檬酸的积累，所以铵盐即可以调节代谢，也可以控制pH。无机盐：无机盐是黑曲霉生长和柠檬酸发酵不可缺少的物质，具有构成菌体，促进代谢，促进
18、产酸的作用。我国采用诱变方法改良的菌株耐金属离子，原料与水可不经处理用于发酵。采用薯干粉、马铃薯、木薯和糖蜜原料发酵，其中P、K、Mg、S已够黑曲霉生长，不需专门添加。要求 KH2PO4 KCl MgSO4.7H2O Zn2 Mn2 Cu2 S Fe2 mg/L深层 0.3 0.2 0.5 0.07 0.2 发酵黑曲霉对无机盐及微量元素的要求n镜检：菌丝粗壮，结成菊花状小球体，无异味，无杂菌。npH：n酸度：0.5-2.0%n柠檬酸含量：0.5g/dl种子质量要求：种子质量要求：3 3 柠檬酸深层发酵工艺流程（薯干原料）柠檬酸深层发酵工艺流程（薯干原料）原始菌种实罐灭菌预处理培养基配制原料实罐
19、液化粉碎无菌空气麸曲菌种空气净化系统空压机种子罐试管斜面环境空气过滤发酵连消发酵成熟醪去柠檬酸提取工段代表菌种：Co827、-130、T419 液体深层发酵工艺三级过滤三级过滤 黑曲霉黑曲霉 原料原料,配料配料 灭菌灭菌空气无菌空气无菌空气柠檬酸（盐）柠檬酸（盐）无菌空气制备和有氧发酵系统（气升式发酵罐）生产实例工艺说明n菌种：Co827n麸曲菌种：制法同前n种子罐培养基：干薯干粉16-20%，（NH4)2SO4 0.5%，0.1MPa蒸汽灭菌30min，接入1000ml三角瓶麸曲菌种20-50只（根据发酵罐容积定）。351培养16-24h。n发酵罐培养基：干薯干粉16-20%，0.1%的-淀
20、粉酶（中温），115灭菌1015min，培养温度351，通风量3/m3.min（视接种方式及培养情况而定）。温度控制黑曲霉属嗜热菌，最适生长温度3337，生产中温度控制在351。若采用孢子接种，在孢子发芽和菌球体形成阶段，可采用40高温培养，促进其发育，进入产酸期再降到35左右。pH控制黑曲霉柠檬酸生产菌发育适宜pH37。一般在生产中，在菌种生长期，pH维持在4.5(有利于糖化）。而柠檬酸积累时，即产酸期最适。pH3.0以上易产生草酸。采用薯干发酵生产柠檬酸，初始pH不调节，为自然pH。接种量 n孢子接种量与产酸的速率成正比关系，随着孢子接种量的增加，柠檬酸的产率也提高。n溶解氧的控制n黑曲霉
21、的柠檬酸产生菌属于严格的好氧菌，在生长、繁殖和产酸阶段均需要氧，一般黑曲霉生长期溶氧分压1.8kPa，产酸期溶氧分压3.2kPa由于菌体生长过程中呼吸作用，消耗大量的氧气，特别当菌体生长接近最大值时(2024h)即旺盛的对数生长期时，其需氧达到最高蜂，其后(一般2430h)菌体生长缓慢，进入产酸期，氧的消耗率立即降低到一个较低的水平，并一直持续到发酵终了。(六）柠檬酸生产下游工程六）柠檬酸生产下游工程 成熟的柠檬酸发酵醪，主要成分除柠檬酸，还有菌体，纤维、有机杂酸、糖、蛋白类胶体物质、色素、矿物质及其它代谢产物。来源于原料及发酵过程中。以溶解或悬浮状存在于发酵醪中。通过各种理化方法，清除这些杂
22、质，得到符合各级质量标准的柠檬酸成品的全过程，即为柠檬酸生产的下游工程。发酵醪精滤净化液复滤过滤阳离子交换拄调浆粗柠檬酸液预热钙盐离子交换工艺流程钙盐离子交换工艺流程活性碳粒滤液酸解蒸发结晶离心阴离子交换拄预处理复滤过滤洗钙中和过滤湿晶包装干燥筒仓筛分入库成品菌渣 浓有机废水 淡有机废水 湿石膏渣加热90CaCO390H2SO4等外品洗晶水母液70 乳酸乳酸,又名丙醇酸又名丙醇酸,学名学名-羟基丙酸羟基丙酸,分子式分子式为为C C3 3H H6 6O O3 3,其分子结构中含有一个不对称碳原子其分子结构中含有一个不对称碳原子,因因此具有旋光性按其构型及旋光性此具有旋光性按其构型及旋光性可分为可
23、分为L-L-乳酸、乳酸、D-D-乳酸和乳酸和DL DL 外消旋乳酸三类外消旋乳酸三类.它是世界上公认它是世界上公认的三大有机酸之一的三大有机酸之一,是制造无毒的高分子化合物是制造无毒的高分子化合物聚聚L-L-乳酸的单体乳酸的单体,也是医药、印刷、印染、制革、也是医药、印刷、印染、制革、食品等工业的重要原料。食品等工业的重要原料。二二 乳酸发酵乳酸发酵 作为一种食品添加剂人体只含有作为一种食品添加剂人体只含有L-L-乳酸脱氢乳酸脱氢酶酶,所以只能够分解自身产生或摄入的所以只能够分解自身产生或摄入的L-L-乳酸乳酸,所以高光学纯度的所以高光学纯度的L-L-乳酸更受市场的青睐。乳酸更受市场的青睐。自
24、然界中可产生自然界中可产生L-L-乳酸的微生物很多乳酸的微生物很多,但产但产酸能力强酸能力强,可应用到工业上的只有可应用到工业上的只有霉菌中的根霉霉菌中的根霉及及细菌的乳杆菌属细菌的乳杆菌属、链球菌属链球菌属及及芽孢杆菌属芽孢杆菌属,下表列下表列出了一些主要的产出了一些主要的产L-L-乳酸的微生物。乳酸的微生物。根霉属根霉属(Rhizopus)(Rhizopus)中产中产 L L一乳酸的菌种很多一乳酸的菌种很多,有有米根霉米根霉(Rhizopus oryzae)(Rhizopus oryzae)、黑根霉黑根霉(Rhizopus nigricans)(Rhizopus nigricans)、华根
25、霉华根霉(Rh.chinensis)(Rh.chinensis)、行走根霉行走根霉(Rhizopus(Rhizopus stolonifer)stolonifer)、小麦曲根霉小麦曲根霉(Rhizopus ritici)(Rhizopus ritici)和和美丽根霉美丽根霉(Rhizopus elegans)(Rhizopus elegans)等十多种等十多种,其中米根霉生产其中米根霉生产L L一乳酸一乳酸的能力最强的能力最强。米根霉菌落疏松或稠密米根霉菌落疏松或稠密,最初呈白色最初呈白色,后变为灰褐色后变为灰褐色或黑褐色。菌丝爬行或黑褐色。菌丝爬行,无色无色,于于37-4037-40生长。米
26、根霉能生长。米根霉能够利用淀粉等廉价原料够利用淀粉等廉价原料,营养要求粗放营养要求粗放,菌丝体大而易于菌丝体大而易于分离分离,利于利于L L一乳酸的精制一乳酸的精制,成为国内外广泛研究的发酵成为国内外广泛研究的发酵生产菌。生产菌。国内外对乳酸发酵生产的研究,主要是从发酵原料的选择、菌种的选择和改良、发酵工艺技术的改进三个方面进行的（一）发酵制备（一）发酵制备L-L-乳酸所用的原料及选择乳酸所用的原料及选择1 1 发酵制备发酵制备L-L-乳酸所用原料的种类乳酸所用原料的种类 目前国内外发酵制备乳酸所用原料多集中于农副产品，也有利用纤维等废弃物发酵乳酸的报道。以玉米淀粉或玉米粉发酵制备乳酸；以大米
27、粉发酵制备乳酸；以红薯淀粉发酵制备乳酸；以纤维等废弃物发酵制备乳酸；以废食品等为碳源进行乳酸制备。Yu R C 等人对直接发酵农产品生产L-乳酸进行了研究，其结果是每千克粗玉米淀粉原料生成350g 以上的L-乳酸。白冬梅等人对玉米淀粉先液化糖化再进行发酵，产酸71.65g/L。吴清林等人直接对玉米粉进行发酵，通过物理方法处理，克服了淀粉浓度过高时基质变为凝胶而不能发酵的困难，不需经液化糖化程序。n 发酵制备乳酸的发展方向是对淀粉质原料的直接应用，不需经过液化和糖化，这样可以大大简化工序、降低成本，为实现大规模的工业化生产奠定基础。另一发展方向就是利用低品位的原料(如生物质原料、废纤维、厨房垃圾
28、等)发酵制备乳酸，以实现资源循环利用和可持续利用。发酵制备发酵制备L-L-乳酸原料的利用方式乳酸原料的利用方式 发酵制备L-乳酸原料利用方式的不同决定整个工艺的进程，影响生产的成本。目前发酵制备L-乳酸对原料的利用方式主要集中于：先经液化再糖化，进而再经微生物利用；糖化和发酵同时进行；对淀粉质原料直接进行利用，不经过液化糖化处理，可简化工艺过程，但对菌种要求较高，目前产率较低。（二）菌种的选择和改良（二）菌种的选择和改良 菌种选育菌种选育 菌种的优良直接关系到发酵过程的控制及其产量等,是发酵过程中的一个至关重要的影响因素。目前以米根霉为亲本的优良菌株的选育有:1 1、常规诱变育种、常规诱变育种
29、 只有乙醇脱氢酶（ADH）活性减弱的菌株才能生长。抑制ADH活性，降低丙酮酸向乙醇支路的转化，可能会提高丙酮酸向乳酸支路的碳流。发酵复筛，得到最优突变株：取原始菌株、初筛后的突变菌株进行初步发酵。测定乳酸产量，选择出乳酸高产突变株。育种实验方案流程：育种实验方案流程：2 2、离子注入诱变育种、离子注入诱变育种 离子注入生物体诱变育种是人工诱变方法的一种新发明,已经证实离子注入诱变,可以获得高突变率,扩大突变谱,为筛选优良的突变型菌株提供广阔的空间。方法培养方法：需要用到：斜面培养、液体种子培养、发酵培养低能离子注入：样品的制备：长好的新鲜斜面,用710mL 生理盐水洗下斜面孢子,用双层无菌纱布
30、过滤得到无菌丝体孢子悬液,取稀释10倍孢子悬液0.1mL 均匀涂布于无菌平皿风干。低能离子诱变处理：一般采用N+，能量为10keV15keV，需要采用不同的剂量去处理。样品、稀释、分离、培养及筛选：1mL 生理盐水洗涤注入后的样品,将洗脱液稀释到10-210-3，取0.05mL涂布于溴甲酚绿平板或琥珀酸平板上，3436培养，挑取单菌落进行初筛，复筛。古绍彬、葛春梅等采用离子束诱变方法,对米根霉PW352 进行改良,以葡萄糖为碳源获得高产L(+)-乳酸菌株RE3303,产酸能力达131136g/L,最高可达140g/L,糖转化率为86%90%,产酸比PW352 提高75%。杨英歌、李文等采用氮离
31、子注入诱变方法，对出发菌株米根霉RLC41-6 进行改良，获得高产L(+)-乳酸菌RQ4012，以木糖作为碳源，发酵周期为72h，产酸能力达74.37g/L，产酸速达1.03g/(L.h)，比RLC41-6 提高了1.6 倍。经过多次传代实验证明该菌株具有较好的遗传稳定性。李市场、葛春梅等采用离子修饰技术对一株产L-乳酸的米根霉菌P988 进行诱变处理,从正变菌株中反复筛选,得到一株产酸量高的菌株PN2207,产酸量达110 g/L,比出发菌株提高了23%,经过连续传代试验,其遗传性状稳定。3.3.利用基因工程技术得到高产的目的工利用基因工程技术得到高产的目的工程菌株。程菌株。L-乳酸脱氢酶(
32、lactate dehydrogenase)以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+/NADH 作辅酶,可逆催化氧化L-乳酸生成丙酮酸,因此可以提高L-乳酸脱氢酶表达基因在菌株中的扩增,使其向有利于L-乳酸生成的方向进行。Skory首次将米根霉的乳酸脱氢酶基因在酵母菌中表达。其后又通过提高乳酸脱氢酶活性来提高米根霉的产酸能力。尽管基因工程实现了有目的、有控制的菌株选育,但目前关于插入的DNA 片断在米根霉菌株中是如何结合与复制的还不清楚,在如何选择最佳质粒载体等方面也还有待进一步的研究。根霉发酵机理 L-乳酸发酵按发酵过程中生成产物的不同,可分成同型发酵及异型发酵两类,不同菌种有不同的乳酸发酵机理,细菌
33、发酵为厌氧或微好氧。细菌的同型发酵一般是通过糖酵解途径,异型发酵有6-磷酸葡萄糖酸途径和双歧途径两种。根霉发酵属好氧异型发酵,但其途径与细菌异型发酵不同,是通过糖酵解途径,发酵产生L-乳酸的同时产生乙醇、富马酸等,糖转化率较低。（三）发酵工艺技术（三）发酵工艺技术 同型乳酸发酵是葡萄糖经直接酵解途径降解为丙酮酸,丙酮酸在乳酸脱氢酶的催化下还原为乳酸。此发酵过程中,1mol 葡萄糖可以生成2mol 乳酸,理论转化为100%。异型乳酸发酵是某些乳酸细菌利用磷酸已糖途经(HMP 途径),分解葡萄糖为6-磷酸核酮酸,再经差向异构酶作用变成5-磷酸木酮糖,然后经磷酸酮解酶催化裂解反应,生成3-磷酸甘油醛
34、和乙酰磷酸。磷酸酮解酶是异型乳酸发酵的关键酶。乙酰磷酸进一步还原为乙醇,同时放出磷酸。而3-磷酸甘油醛经EMP 途径后半部分转化为乳酸,同时产生两分子ATP。扣除发酵时激活葡萄糖消耗的1 分子ATP,净得1 分子ATP。因此由葡萄糖进行异型乳酸发酵,其产酸能力比同型乳酸发酵低一半。异型乳酸发酵产物除乳酸外还有乙醇、CO2 和ATP。双歧发酵是两歧双岐杆菌(Bifidobacterium bi2fidum)发酵葡萄糖产生乳酸的一条途径。其发酵途径如下:乳酸生产的传统方法是采用游离细胞在搅拌罐中进行发酵，由于米根霉的菌丝发达，在罐中易形成大的菌丝团，引起氧气及其它营养物质的传递困难，或缠绕在搅拌桨
35、上，使搅拌阻力增加，造成产酸速率低、得率低、生产不稳定等问题。Cachon 和Divies的研究表明固定化技术可以作为一种稳定菌体活力、防止质粒流失的工具。因此利用固定化技术生产乳酸可以提高细胞浓度和乳酸产率。米根霉发酵工艺米根霉发酵工艺 在工业化生产中最重要的是：固定化细胞载体可以反复使用，尽量减少接种次数，节省了大量的人力、物力和能源。因此，固定化技术是提高生物催化剂利用率、生物反应速率以及实现高效连续生产过程的有效方法。用于米根霉固定化发酵的载体种类相对比较多，但是很少能优化出用于大规模生产并创造出良好的经济效益的载体规格，所以在以后对于乳酸固定化发酵的研究中，载体的优化和改良必将成为新
36、的研究热点。理想的固定化细胞载体应该是：对微生物无毒，传质性能良好，性质稳定、不易被生物分解，强度高、寿命长，价格低廉等。对于米根霉的固定化技术，研究者在选用材料时大多数使用软凝胶，如海藻酸钙等。甲壳糖杂化海藻酸盐主要用于改善固定材料的机械性能，同时增强菌体的生物活性。Goksungur 等用此载体进行固定化发酵L-乳酸，发现游离细胞数量比单用海藻酸钙作为载体的减少了很多，同时乳酸产量也相应有大幅增加。载体材料对乳酸固定化发酵的影响载体材料对乳酸固定化发酵的影响 近年来,对根霉发酵生产乳酸的发酵工艺研究主要集中在菌丝形态和发酵条件的优化等方面。目前，固定化细胞生物反应器大致可以分为同期搅拌罐、
37、中空纤维膜反应器、填充床、流化床反应器以及转盘反应器等。Hamamci 和Ryu在三相流化床内进行固定化发酵生产乳酸，该三相流化床生物反应器结构简单、动力消耗低、反应器内物质混合均匀、氧传递量大于固定化米根霉的需氧量，非常适合好氧的固定化米根霉发酵，乳酸产率达到65。发酵反应器的选择发酵反应器的选择（四）（四）提取工艺提取工艺 从发酵液中提取有机酸,传统方法为钙盐结晶硫酸酸化法。其工艺流程长,消耗化工原料多,工人劳动强度大,环境污染严重,特别是产品收率低。近几年人们努力寻找新的提取方法,主要有:n溶剂萃取法n液膜法提取乳酸n离子交换法n电渗析法（五）（五）L-L-乳酸的应用乳酸的应用n在食品行
38、业中的应用在食品行业中的应用n在医药行业的应用在医药行业的应用n在轻工、化工行业的应用在轻工、化工行业的应用n在农业上的应用在农业上的应用n可生物降解材料聚乳酸可生物降解材料聚乳酸（六）研究展望（六）研究展望n1 利用基因工程技术获得高产L-乳酸的基因工程菌 株。通过基因工程化技术可以知晓菌种突变株在分子水平上的变化及乳酸产量提高的机制，可以减少一代一代诱变筛选的时间。n2 控制乳酸产品构型。L-乳酸与人体完全融合性及聚L-乳酸的生物降解性，使得L-乳酸的应用范围极为广泛。因此控制乳酸产品构型尤为重要，通过对乳酸构型影响因素的详细研究可以达到控制产品构型的目的。n3 研发新型发酵设备，改良提取工艺。设计新型高效的原位分离反应器，以适应连续发酵或半连续发酵过程，综合运用及优化集成分子蒸馏及膜技术等改良提取工艺，以降低成本，提高产品纯度。n n 4 拓展L-乳酸的应用领域。加强乳酸转化为乳酸聚合物、丙烯酸类聚合物等方面的研究，以进一步扩大乳酸的应用范围。n5 降低乳酸生产成本。综合利用玉米粉、甘薯粉、马铃薯粉等生物质原料、可再生资源，提高副产品的 经济效益，降低乳酸生产原料的成本。