细胞毒性T细胞作用的分子机制.pdf

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1、第四章 细胞毒性T细胞作用的分子机制 免疫系统针对病原所产生的免疫应答分为两大类：以抗体为主体介导的中和细胞外病 原体的体液免疫反应和以细胞毒性T细胞(CTL)为主体介导的特异杀伤被感染靶细胞的细 胞免疫反应。其中细胞免疫反应对于彻底地杀灭病原体、清除被感染的“改变”了的自身细 胞显得尤为重要。细胞免疫反应包括NK细胞等介导的非特异性靶细胞杀伤和CTL为主、Th细胞为辅所介导的特异性靶细胞杀伤。CTL对于被感染细胞的MHC I类分子限制特异性 的杀伤是细胞免疫应答的重要内容，其研究对于了解免疫识别、免疫杀伤以及新型疫苗的分 子设计都有重要意义。第一节CTL作用概述 CTL即杀伤性T细胞，是一类

2、具有CD8+表面标志、受MHC I类分子限制性杀伤功能 的T细胞。CTL的重要功能是可以特异性地杀伤靶细胞。CTL介导的靶细胞杀伤的特点是:杀伤受TCR以及MHC I类分子的严格限制。CTL对靶细胞的杀伤还具有特异性、程序性和 快速性的特点。另外，IL-2和其它一些细胞因子在CTL前体的体外培养和效应CTL的分化 诱导中也起着重要作用。一、CTL的主要生物学功能 CTL对感染了病原的靶细胞杀伤构成了细胞免疫的重要部分。CTL在识别“改变”了 的自身细胞，如病毒感染细胞、恶性细胞和移植反应中的移植细胞等起着非常重要的作用。由于人体所有的有核细胞都表达I类MHC分子，因此，CTL原则上可以识别和清

3、除几乎所 有改变了的自身细胞。二、CTL作用的MHC限制性 CTL的杀伤作用受MHC严格限制。CTL在杀伤抗原特异性靶细胞过程中，不识别可 溶性抗原或者与非自身MHC I类分子结合的抗原，而只能识别与自身MHC I类分子相联系 的特异性抗原多肽。三、CTL的组成 CTL的命名是根据体外与一定比例的特异性靶细胞孵育后杀伤一定百分率的靶细胞这 一功能来确定的。因此，CTL不是一种特定的细胞，而是一个具有特异性杀伤活性的T细 胞群体。在组成上，它包括CD8+T细胞和CD4+T细胞。1、CD8+T细胞 主要有a0TCR型CD8+T细胞和ybTCR型CD8+T细胞。前者以a0TCR 识别靶细胞表面上的M

4、HC I类分子-肽复合物(图4-)；后者则以ybTCR识别靶细胞表面的 图 4-1 TCR-抗原肽-HLA 三分子复合物ap TCR n n HLA-I ap TCR HLA-II MHC I类分子-肽复合物。尽管TCR型T细胞仅占CTL群体中的极小部分，但在对一些特 殊抗原的免疫反应中，它们起着非常重要的作用。2、CD4+T细胞 CD4+T细胞通常被认为是在抗原免疫过程中通过分泌细胞因子及表 达表面分子介导细胞间相互作用，来调节和增进体液免疫和细胞免疫反应，主要起辅助作用。但在某些情况下，CD4+T细胞也具有杀伤功能，且主要依赖Fas-FasL机制。实验证明当抗 原由II类MHC分子而不是由

5、I类MHC分子呈递时，CD4+T细胞可以取代CD8+T细胞而 发生反应，成为杀伤性的CTL。四、CTL作用的主要过程 CTL介导的靶细胞杀伤反应可分为3个阶段：识别启动、增殖分化及效应阶段。1、识别启动阶段 在这一阶段，CTLp（CTL前体）通过表面的TCR特异性地识别并结合靶细胞表面呈 递的I类MHC分子-抗原多肽复合物，和其它若干对表面分子的配体（图4-2）。Fig 4-2 Accessory molecules of T lymphocytes The interaction of a cdCD4+helper T cell with an APC(A),or of a CD8+CTL

6、with a target cell(B),involves multiple T cell membrane proteins that recognize different ligands on the APC or target cell.2、增殖分化阶段 在此阶段，Th细胞发生大量增殖并分泌IL-2等细胞因子；CTL则在特异性增殖的同 时，自前体细胞分化成为效应CTL。（1）Th细胞的增殖对CTLp分化的辅助作用 当CTLp识别了呈递于靶细胞表面与I 类MHC分子相结合的特异性抗原多肽后，特征性地表达IL-2R（受体）。由于此时Th细胞 也受到特异性抗原的刺激，产生大量的IL-2。这

7、些IL-2与激活的CTLp表面的IL-2R结合，使得CTLp发生特异性的增殖，逐步分化成为成熟的效应CTL。（2）巨噬细胞对CTLp分化的辅助作用 研究证明巨噬细胞的作用是用以激活II类 MHC限制性的Th细胞。（3）细胞因子对CTL的产生调节 多种细胞因子，包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-12和IL-15,其中IL-2诱导CTL杀伤活性的能力较强。这些细胞因子通过诱导相关基因 的表达，使CTLp朝着成熟方向分化，并使抗原特异性CTL克隆的生长和增殖加快。3、效应阶段 在效应阶段，已分化成熟的效应CTL发挥其杀伤功能，特异性裂解靶细胞。作用的过 程可分为4个阶段:识别与结合

8、、细胞器重排与颗粒外吐、CTL解离、靶细胞解体（图4-3,4-4）。外吐 MHC I-肽 Fig 4-4 Killing of Target cells by CTL CTLs from a cloned cell line specific for the human MHC molecule bind to MHC-expressing target cell(A),result in the membrane pored(B)and induce target cell apoptosis(C).(2)细胞器重排与颗粒外吐CTL上的TCR是与细胞内一些细胞骨架成分如小管和 膜损伤 靶细胞

9、,图 4-3 CTL介导的靶细胞杀伤过程（1）识别与结合CTL表面的TCR识别并结合靶细胞表面的I类MHC-多肽复合体，同时还需其它若干对表面分子参与，才能加强和稳定CTL与靶细胞的结合。其中，CTL上 的CD11a/CD18（LFA-1）与靶细胞上的ICAM-1或ICAM-2可能是最重要的一对结合分子。颗粒 A Conjugate formation betweencTL and Target cell CTL再循环 B form pores in the target cell membrane C.Target cell apoptosis CD8 TCR 偶合物 形成 CTL 器重排

10、CTL 颗粒 r CTL 名细肌动蛋白偶联的。当TCR与靶细胞上的MHC I-多肽复合体交联后，将通过这些细胞骨架成 分启动细胞器的重排。高电子密度的颗粒明显地向靶细胞方向移动，并在结合部位直接外吐 颗粒内含物质，对靶细胞膜进行攻击。这一胞质颗粒的外吐是由Ca2+流入CTL所诱发的。（3）CTL解离CTL向靶细胞释放颗粒内含物后，即完成其杀伤过程，开始与靶细 胞解离。离开靶细胞后，又可重复以上过程，重新结合靶细胞，重复杀伤。因此CTL可以 杀伤多个靶细胞，即CTL可循环利用。（4）靶细胞解体CTL离开靶细胞后，靶细胞开始出现核膜与细胞膜的破裂，直至细 胞裂解死亡（图4-5）。Target ce

11、ll Fig 4-5 The stage of CTL killing the target cell 第二节CTL分子机制及应用前景 一、CTL作用的分子模式 CTL杀伤靶细胞的分子机制包括胞质颗粒依赖机制和FasL-Fas介导的凋亡机制（图4）。1、胞质颗粒依赖机制 CTL可以通过外吐胞质颗粒，释放颗粒内含物，导致靶细胞的损伤。CTL胞内含许多颗粒，直径0.51 m，主要有两种成分：颗粒核心核多囊泡结构。颗粒核心中包含穿孔素、颗粒酶 和粘蛋白，而多囊泡结构则包含溶酶体酶和溶酶体的一些膜标志。穿孔素是胞质颗粒中参与 靶细胞损伤过程的最主要蛋白，穿孔素似乎唯一地表达于CTL颗粒中。它可在靶细胞

12、膜上 聚合，形成穿膜孔道，以穿孔方式裂解靶细胞。Process and presentation of antigen by target cell TCR/antigenic peptide:MHC I complex CTL activated kills the target cell(granzyme/perforin,FasL/Fas)CTL dissociation and target cell apoptosis（1）穿孔素的穿孔机制 穿孔素是一个含555个氨基酸的糖蛋白，分为两个重要的 功能区：补体同源区和C2区。穿孔素以单体存在，插入靶细胞膜中，发生聚合，产生多种 不同聚合

13、数目的多聚体。CTL通过可咯外吐方式释放出穿孔素，进入细胞间隙。穿孔素在Ca+存在下，引起构 象变化，暴露其疏水基团，附着并插入脂质双层膜中，在靶细胞膜表面形成多个孔洞，最终 引起靶细胞解体（图4-6）。图4-6 CTL杀伤的胞质颗粒酶依赖和Fas/FasL凋亡机制（2）胞质颗粒内其它酶或分子依赖的非穿孔素机制 A丝氨酸脂酶/颗粒酶；B粘蛋 白；TNF。2、非胞质颗粒依赖机制一FasL/Fas机制 CTL对靶细胞的杀伤主要引起靶细胞的膜结构破裂以及核DNA的快速降解，但胞质 颗粒依赖机制只能引起靶细胞的膜结构破裂，而不能导致靶细胞核DNA的降解，目前认为 Fasl/Fas介导的细胞凋亡是CTL

14、杀伤靶细胞的非胞质颗粒依赖机制。Fas/Apo-1即CD95分子，编码分子量45x103单位？的跨膜蛋白，是TNF受体相关蛋 白（TNFR）的一种。Fas蛋白由胞外区、跨膜区和胞内区组成，其中胞内区含一个与细胞 凋亡相关的死亡区域。Fas主要以膜受体形式存在，广泛表达于外周活化T、B细胞，NK 细胞，单核细胞，成纤维细胞等。FasL是分子量为30 x103单位？的TNF相关II型膜蛋白，也由细胞外区、跨膜区和胞内区组成，其胞外区与TNF家族成员高度同源。FasL除了在淋 巴细胞表达外，还在其他一些细胞表达，包括巨噬细胞、树突细胞、中性粒细胞、神经元细 胞和若干肿瘤细胞。因靶细胞上的Fas与CT

15、L等具有杀伤功能的细胞上的FasL结合是诱导 靶细胞产生凋亡的主要途径之一，因此Fas可称死亡分子，FasL则称死亡因子。FasL-Fas作用的分子机制FasL-Fas机制介导的杀伤过程可分为两个时期：激活启动 期和FasL-Fas结合期。FasL-Fas机制的启动仍然必需CTL上的TCR对靶细胞MHC I-肽复 合物的识别，同样需要CTL与靶细胞发生Mg+依赖的结合和粘连。激活期依赖于细胞外 Ca+/Mg+环境的存在以及细胞内RNA合成与蛋白合成所需的酶与基质。TCR对靶细胞 MHC I-肽复合体的识别与结合同时启动了 CTL染色体DNA上FasL基因以及靶细胞染色体 DNA上Fas基因的转

16、录和翻译，随后，FasL表达在CTL细胞膜上，Fas表达于靶细胞膜上。在一些粘附分子的辅助下，二者有效地发生结合。Fas在配体的诱导下，形成三聚体，三聚体的形成导致一种级联反应衔接子一一Fas相 关的含死亡区域的蛋白（FADD/MORT1）的募集。而FADD含一个蛋白-蛋白作用区域，又 称死亡效应区域，可使 FADD 与其他含死亡效应区域的蛋白（如 FLICE/MACHI/Mch5caspase-8/胱冬肽酶8,N端含2个独立的死亡效应区域）形成二聚体。Fas三聚体对FADD的募集又导致对caspase-8前体的募集，这样便形成了 Fas信号传导复 合物。caspase-8前体发生自催化剪切，

17、释放有活性的蛋白酶亚基。一旦被激活，caspase-8 可连续激活其他的下游caspase，并可降解其在胞内的底物。经过caspase的一系列反应，细 胞最终走向细胞凋亡（图4-7）。原 caspase-8 图 4-7 FasL-Fas 通路导致细胞凋亡机制 3、细胞因子介导途径（1）细胞因子介导途径的作用机制 在人类的病毒感染期，至少有两种以上的机制 联合才能实现病毒的完全清除。首先，病毒特异性CTL识别并杀伤一小部分被感染的靶细 胞；其次，病毒特异性CTL可分泌炎性细胞因子直接或间接（通过激活巨噬细胞）地通过 抑制病毒在胞内复制来治疗大部分的被感染的细胞。（2）细胞因子介导的双重作用 细胞

18、因子作用机制还不完全明确，但它在产生抗病 毒效应的同时，也可能使病毒降低其复制水平以逃避免疫系统的识别。已知不完全/不足量 的病毒激活或者免疫系统的功能减退将会导致若干感染细胞内病毒抗原表达的下调，其微小 的量正好可使这些感染细胞逃避免疫细胞如CTL的识别，从而引起病毒的持续性感染和慢 性肝炎的发生。因此，细胞因子介导途径也可能具有双重性。一方面，机体通过CTL来源 的细胞因子抑制病毒表达和复制，清除病毒，有效发挥了机体的抗病毒功能；另一方面，病 毒可能利用这一机制下调基因的表达和病毒颗粒的装配，逃避CTL的识别，以此作为持续 感染的生存策略。二、基因免疫诱导的CTL反应及其作用 DNA免疫是

19、一种给予抗原（免疫）的新手段，它通过将目的基因克隆于真核表达载体 后直接注入机体，表达相应抗原，诱生免疫反应。1993年，Ulmer等将流感病毒NP表达质 粒注射小鼠骨骼肌，不仅检测到特异性IgG抗体，而且免疫小鼠的脾细胞在体外可特异性 杀伤NP致敏的靶细胞，证实DNA免疫同时可诱生特异性的CD8+CTL应答。与常规蛋白 质疫苗免疫相比，DNA免疫具有易制备、操作简便，并可诱导体液免疫和细胞免疫应答的 优势，因此已成为抗病毒感染新型疫苗研制的热点。病毒感染的清除主要依赖于特异性体液免疫和细胞免疫应答。体液免疫通过特异性抗体 中和细胞外游离的病毒，而细胞免疫应答则主要通过特异性CTL识别、杀伤、

20、破坏病毒感 染的细胞，清除胞内感染的病毒。以不同病毒抗原编码基因为目的基因构建真核表达重组体 进行DNA免疫，诱生了针对不同病毒的特异性CTL应答，并证实这些特异性CTL应答在 清除病毒感染中起重要作用。1、DNA免疫诱导的病毒特异性CTL反应 将病毒特异性抗原编码基因置于真核启动子（通常称为病毒启动子）调控下，构建真核 表达载体，以此裸露质粒DNA直接注入机体，诱生了针对不同病毒的特异性CTL应答。2、DNA诱导特异性CTL反应的可能机制 DNA 免疫与传统蛋白免疫相比，具有持续表达抗原和诱生全面的免疫反应如中和抗 体、CTL和Th1等优点。可能是DNA导入部位抗原的有效呈递。将DNA直接导

21、入体内，多种专职APC细胞如LG细胞、树突细胞、巨噬细胞和B细胞，可直接被DNA转染，而 后表达抗原并行使APC功能。DNA注射部位的（肌肉）细胞不起呈递抗原的作用，真正将 抗原呈递给免疫系统的是骨髓来源的专职APC。这一机制也可以解释DNA免疫为何能同时 诱导CTL和Th细胞应答。少量的专职APC可直接在注射部位被DNA转染产生内源性蛋 白抗原表达，而后借助蛋白酶体和TAP复合物将蛋白装载于MHC I类分子上，完成内源性 抗原呈递途径，产生CTL。大部分的蛋白抗原是有肌肉细胞表达的，以外源抗原方式转给 专职APC细胞，诱导Th反应。此外，外源性蛋白也可激活MHC I类限制性CTL。3、DNA

22、免疫诱生的CTL应答在清除病毒感染中的作用 CTL应答在病毒感染尤其是持续性病毒感染的清除过程中起着重要作用。通过构建不 同CTL抗原表位的质粒进行DNA免疫，检测其诱导CTL的特性，可迅速、准确地确立天 然病毒蛋白中的特异性CTL抗原表位，以便于新型疫苗的分子构建。同时以此可进一步阐 明病毒诱生的特异性免疫应答的优点及病毒感染的致病机制和防治策略。三、增强CTL应答的新策略 1、增强MHCI 类分子对内源性多肽的呈递 在CTL应答的诱生中，内源性抗原必须经MHC I类分子有效呈递，才可被CTL特异 性识别。首先，抗原在细胞内经多功能蛋白酶体（LMP）降解为短肽，随后进入内质网中，与在内质网中

23、新合成的MHCI类分子有效结合，经高尔基体最后呈递于细胞外膜。因此如 何将抗原多肽转运至内质网，对于有效呈递至关重要。目前已知有两种不同的分子机制：伴 随蛋白、TAP及内质网转运或插入信号序列参与抗原多肽向内质网转运过程。2、增强DNA免疫中外源基因导入细胞及细胞内的稳定存在和持续表达 DNA免疫所选用的表达载体一般是真核表达载体，而免疫对象又是真核生物细胞。通 常，它们不具备在宿主细胞内自主复制的能力。因此，当把DNA直接注入机体之后，编码 基因所在的质粒载体只能在宿主细胞内一过性表达，之后，随细胞的分裂而逐渐丢失。所以，进入机体细胞的DNA所表达的蛋白量应当足以诱生特异性免疫应答。增加外源

24、基因导入细 胞的效率，可提高外源基因在宿主细胞中的量，从而提高外源基因的表达水平，是增强DNA 免疫效果的手段之一。已知EBV在体内可感染人B细胞，体外转化B细胞使之永生化。EBV感染B细胞后，呈隐性状态，DNA以闭环形式游离于染色体外，可自主复制。由此构建的EBV复制型载体 不仅能较高效率导入细胞内，而且可在染色体外稳定存在，不整合，随细胞分裂而自主复制，并可插入长达几千个硷基的外源基因而不影响其特性。这对提高外源基因在细胞内稳定存在 和持续表达有很大意义。另外将一些DNA结合分子（poly-Lys或DNA结合蛋白）偶联受体特异配基，再与DNA 形成可溶性复合物,细胞表面特异性受体介导内吞，

25、也是实现基因定向导入与表达的策略。3、降低外源DNA在细胞内的降解 在受体介导的外源基因导入过程中或病毒对细胞的天然感染过程中，外源DNA从内质 体释放到细胞质中而不被降解是成功转基因或感染的关键步骤。通常，内质体内含物（外源 性摄入物）会在内质体向溶酶体的转换过程中被降解。为避免这一事件的发生，构建一种可 溶性载体复合物，以模拟病毒进入细胞。这一复合物包括DNA、运铁蛋白poly-Lys偶联物、poly-Lys偶联的流感病毒HA-2N未端来源多肽。实验表明，这一复合物在酸性条件下可破 坏溶酶体，使基因导入K562细胞效率提高500倍。流感病毒HA-2 N末端多肽具有破坏宿 主细胞内质体膜、释放共内化物质进入细胞质的性质，因此又称作内质体破坏多肽（endosome-disrupting peptides）。4、一些共刺激分子、细胞因子增强CTL的作用 一些共刺激分子、细胞因子，如IL-2、TFN-、GM-CSF及Th细胞抗原表位在CTL激 活中也起一定作用。对于DNA免疫，基于DNA疫苗的简单性和易操作性，可考虑适当地 改造载体，增加这些共刺激分子、细胞因子、Th抗原表位基因序列和一些调控序列，有望 增强靶细胞对多肽的呈递以及CTL对靶细胞的识别和活化，提高DNA免疫的效果。