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1、第2章 酶的生产与分离纯化主要内容：2.1 国内外酶制剂工业生产及应用现状 2.2 酶的发酵技术 2.3 酶的分离纯化 2.4 酶分离、纯化的评价 2.5 酶的剂型与保存2.1国内外酶制剂工业生产及应用现状国内外酶制剂工业生产及应用现状2.1.1新技术在生产中的应用：三种方法：n组织提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶n微生物发酵：最大量的来源n化学及生物合成：生物重组高新技术的应用：酶的修饰、固定化、基因重组、膜分离技术、冷冻干燥、微胶囊2.1.2.集中垄断，市场全球化：规模企业由20世纪80年代初的80多家减少至20多家，占市场90%丹麦诺和诺得公司（诺维信novozymes）1978年进入中国诺
2、维信公司，占50%市场（天津）；美国杰能科公司（Genencor）98年进入中国，与无锡合资，控股80%（无锡），两家公司销售额占全球2/3；（2005年杰能科国际公司被丹尼斯克公司收购）2.1.3.品种、规模不断扩大目前30多家600多个品种，应用于18个工业领域。我国2000年酶制剂产量为30万吨，100家，市场份额仅占5%，以未经除菌去渣的粗制品粉状酶为主。国际以液体、颗粒为主。国内糖化酶、-淀粉酶、蛋白酶三大类占了97%，显然不合理。重要产品普鲁兰酶、真菌淀粉酶、系列果胶酶、低温碱性蛋白酶，国内尚未投入生产;我国有7家上市公司介入酶制剂开发生产。2.1.4.应用领域不断扩大：美国酶制剂
3、年产值6.25亿美元，食品工业占62%，拓展饲料工业、洗涤剂工业、化学工业。2.2 酶的发酵技术利用微生物产酶的优点是：n(1)微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。n(2)微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。n(3)微生物培养基来源广泛、价格便宜。n(4)可以采用微电脑等新技术，控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化，经济效益高。n(5)可以利用以基因工程为主的现代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种。因此，下面将主要介绍微生物发酵法产酶的一般原理和工艺。2.2.1 产酶微生物菌种是发酵生产酶的重要条件。菌种不仅与产酶种类、产量密切相关，而且与发酵条件、工艺等关
4、系密切。已经在自然界中发现的酶有数千种，目前投入工业发酵生产的酶约有5060种。它们的生产菌种十分广泛，包括细菌、放线菌、酵母菌、霉菌。2.2.2 酶的发酵技术2.2.2.1 培养基n培养基的营养成分是微生物发酵产酶的原料，主要是碳源、氮源，其次是无机盐、生长因子和产酶促进剂等。重要（1）碳源w碳素是构成菌体成分的主要元素，也是细胞贮藏物质和生产各种代谢产物的骨架，还是菌菌菌菌体体体体生生生生命命命命活活活活动动动动的的的的能能能能量量量量的的的的主主主主要要要要来来来来源源源源。当前酶制剂生产上使用的菌种大都是只能利用有有机机碳碳的异养型微生物。有机碳的主要来源有：一是农副产品中如甘薯、麸皮
5、、玉米、米糠等淀粉质原料；二是野生的如土茯苓、橡子、石蒜等淀粉质原料。此外，以石油产品中1216碳的成分来作碳源，如以某些嗜石油微生物生产蛋白酶、脂酶，均已获得成功。重要n不同的细胞对各种碳源的利用差异很大，所以在配制培养基时应根据不同细胞的不同要求而选择合适的碳源。另外，选择碳源除考虑营养要求外，还要考虑酶生物合成的诱导作用和是否存在分解代谢物阻遏作用。尽量选用具有诱导作用的碳源，尽量不用或少用有分解代谢物阻遏作用的碳源。n例如，淀粉酶的发酵生产中，应该选用有诱导作用的淀粉作为碳源，而不用对该酶有分解代谢物阻遏作用的果糖作为碳源。重要（2）氮源n氮是生物体内各种含氮物质，如氨基酸、蛋白质、核
6、苷酸、核酸等的组成成分。酶制剂生产中的氮源主要有有有有有机机机机氮氮氮氮源源源源和和和和无无无无机机机机氮氮氮氮源源源源两种，常用的有机氮源有：豆饼、花生饼、菜籽饼、鱼粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、多肽、氨基酸等；无机氮源有：(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3、(NH4)3P04、尿素等。重要n不同的细胞对各种氮源的要求各不相同，应根据要求进行选择和配制。一般来说，动动动动物物物物细细细细胞胞胞胞要要要要求求求求有有有有机机机机氮氮氮氮，植植植植物物物物细细细细胞胞胞胞主主主主要要要要要要要要求求求求无无无无机机机机氮氮氮氮。多数情况下将有机氮源和无机氮源配合使用才能取得较好的效果。例
7、如黑黑黑黑曲曲曲曲霉霉霉霉酸酸酸酸性性性性蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶生产，只用铵盐或硝酸盐为氮源时，酶产量仅为30%。只用有机氮源而不用无机氮源时产量也低，故一般除使用高浓度有机氮源外尚需添加1%3%的无机氮源。重要（3）碳氮比n在微生物酶生产培养基中碳源与氮源的比例是随生产的酶类、生产菌株的性质和培养阶段的不同而改变的。n一般蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶(包括酸性、中性和碱性蛋白酶)生产采用碳碳碳碳氮氮氮氮比比比比低低低低的培养基比较有利，例如黑曲霉3.350酸性蛋白酶生产采用由豆饼粉3.75%、玉 米 粉 0.625%、鱼 粉 0.625%。NH4Cl 1%、CaCl2 0.5%、Na2HP04
8、 0.2%、豆饼石灰水解液10%组成的培养基；重要n n淀淀淀淀粉粉粉粉酶酶酶酶(包括淀粉酶、糖化酶、淀粉酶等)生产的碳碳碳碳氮氮氮氮比比比比一一一一般般般般比比比比蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶生生生生产产产产略略略略高高高高，例如枯草杆菌TUD127淀粉酶生产采用由豆饼粉4%、玉米粉8%、Na2HP04 0.8%、(NH4)2SO4 0.4%、CaCl2 0.2%组成的培养基。而在淀粉酶生产中糖化酶生产培养基的碳氮比是最高的。以以以以上上上上是是是是蛋蛋蛋蛋白白白白酶酶酶酶和和和和淀淀淀淀粉粉粉粉酶酶酶酶生生生生产产产产培培培培养养养养基基基基碳碳碳碳氮氮氮氮比比比比的的的的一一一一般般般般规规
9、规规律律律律，但但但但是是是是由由由由于于于于菌菌菌菌种种种种很很很很多多多多而而而而其其其其性性性性质质质质各各各各异异异异。很很很很难说都是符合上述规律的。难说都是符合上述规律的。难说都是符合上述规律的。难说都是符合上述规律的。重要（4）无机盐n微生物酶生产和其他微生物产品生产一样，培养基中需要有磷酸盐及硫、钾、钠、钙、镁等元素存在。在酶生产中常以磷酸二氢钾、磷酸氢二钾等磷酸盐作为磷磷磷磷源源源源，以硫酸镁为硫硫硫硫源源源源和和和和镁镁镁镁源源源源。钙钙钙钙离离离离子子子子对淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶的活性有十分重要的稳稳稳稳定定定定作作作作用用用用，例如在无Ca2+存在时灰色链霉菌中
10、性蛋白酶只在pH77.5很小范围内稳定，当有Ca2+存在时稳定pH范围可以扩大到57。钠钠钠钠离离离离子子子子有控制细胞渗透压使酶酶酶酶产产产产量量量量增增增增加加加加的作用，酶生产的培养基中有时以磷酸氢二钠及硝酸钠等形式加入，例如米曲霉淀粉酶生产，添加适量的硝酸钠以促进酶生产。重要（5）生长因子 n微生物还需一些微量的像维生素一类的物质，才能正常生长发育，这类物质统称生长因子(或生长素)。其中包括某些氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶等。酶酶酶酶制制制制剂剂剂剂生生生生产产产产中中中中所所所所需需需需的的的的生生生生长长长长因因因因子子子子，大大大大多多多多是是是是由由由由天天天天然然然然原原原原料
11、料料料提提提提供供供供，如玉米浆、麦芽汁、豆芽汁、酵母膏、麸皮、米糠等。玉米浆中一般含有生长素32128mg/mL。重要（6）产酶促进剂 n n产产产产酶酶酶酶促促促促进进进进剂剂剂剂是是是是指指指指在在在在培培培培养养养养基基基基中中中中添添添添加加加加某某某某种种种种少少少少量量量量物物物物质质质质，能能能能显显显显著著著著提提提提高高高高酶酶酶酶的的的的产产产产率率率率，这这这这类类类类物物物物质质质质称称称称为为为为产产产产酶酶酶酶促促促促进进进进剂剂剂剂。产酶促进剂大体上分为两种：一一是是诱诱导导物物，二二是是表表面面活活性性剂剂。表面活性剂，如吐温80的浓度为0.1%时能增加许多酶
12、的产量。表面活性剂能增加细胞的通透性，处在气液界面改善了氧的传递速度，还可以保护酶的活性。生生生生产产产产上上上上常常常常采采采采用用用用非非非非离离离离子子子子型型型型表表表表面面面面活活活活性性性性剂剂剂剂，如聚乙二醇、聚乙烯醇衍生物、植酸类、焦糖、羧甲基纤维素、苯乙醇等。离离离离子子子子型型型型的的的的表表表表面面面面活活活活性性性性剂剂剂剂对对对对微微微微生生生生物物物物有有有有害害害害。用于食品、医药的酶的生产中所用的表面活性剂还须对人、畜无害。此外各种产酶促进剂的效果还受到菌种，种龄、培养基组成的影响。重要2.2.2.3 液体深层发酵的工艺控制酶的发酵生产中发酵效果除了受到菌种产酶
13、性能的影响外，还受到发酵温度、pH、溶氧量等条件的影响。(1)温度对产酶的影响 n n发发发发酵酵酵酵温温温温度度度度的的的的变变变变化化化化主主主主要要要要随随随随着着着着微微微微生生生生物物物物代代代代谢谢谢谢反反反反应应应应、发发发发酵酵酵酵中中中中通通通通风风风风、搅搅搅搅拌拌拌拌速速速速度度度度的的的的变变变变化化化化而而而而变变变变化化化化的的的的。微生物在生长发育中，不断地吸吸吸吸收收收收培培培培养养养养基基基基营营营营养养养养成成成成分分分分来合成菌体的细胞物质和酶时的生化反应都是吸吸吸吸热热热热反反反反应应应应；培养基中的营营营营养养养养物物物物质质质质被被被被大大大大量量量
14、量分分分分解解解解时的生化反应都是放放放放热热热热反反反反应应应应。发酵初初初初期期期期合成反应吸收的热量大于分解反应放出的热量，发酵液需要升升升升温温温温。当菌体繁殖旺盛时，情况则相反，发酵液温度就自行上升，加上通风搅拌所带来的热量，这时，发酵液必须降温，以保持微生物生长繁殖和产酶所需的适宜温度。n微生物生长繁殖和产酶的最适温度随着菌种和酶的性质不同而异，生长繁殖和产酶的最适温度往往不一致。一般细细细细菌菌菌菌为为为为37 37，霉霉霉霉菌菌菌菌和和和和放放放放线线线线菌菌菌菌为为为为282830 30，一一一一些些些些嗜嗜嗜嗜热热热热微微微微生生生生物物物物需需需需在在在在4050 405
15、0 下下下下生生生生长长长长繁繁繁繁殖殖殖殖，如如如如红红红红曲曲曲曲霉霉霉霉生生生生长长长长温温温温度度度度35373537，而生产糖化酶的最适温度为，而生产糖化酶的最适温度为，而生产糖化酶的最适温度为，而生产糖化酶的最适温度为373740 40。n在酶生产中，为了有利于菌体生长和酶的合成，也有进行变温生产的。例如以枯草杆菌ASl.398进行中性蛋白酶生产时，培养温度必须从31 逐渐升温至40，然后再降温到31进行培养，蛋白酶产量比不升温者高66%。据报道，酶生产的温度对酶活力的稳定性有影响，例如用嗜热芽孢杆菌进行淀粉酶生产时，在55 培养所产生的酶的稳定性比35 好。(2)pH对产酶的影响
16、n一般来说，培养基成分中碳碳碳碳/氮氮氮氮(C/N)(C/N)比比比比高高高高，发酵液倾向于酸性，pHpH低低低低；C/NC/N低低低低，发酵液倾向于碱性，pHpH高高高高。pH的这些变化情况，常常引起细胞生长和产酶环境的变化，对产酶带来不利的影响。因此生产中常采用一些控制pH的方法，通常有：添添添添加加加加缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液维持一定的pH；调调调调节节节节通通通通风风风风量量量量维持发酵液的氧化还原电位于一定范围；调节培养基的初始pH，保保保保持持持持一一一一定定定定的的的的C/NC/N比比比比；当发酵液pH过高时用糖或淀粉来调节，pH过低时，通过氮调节。(3)通风量对产酶的影响n其实
17、通风量的多少应根据培养基中的溶解氧而定。一般来说，在发发发发酵酵酵酵初初初初期期期期，虽然幼细胞呼吸强度大，耗氧多，但由于菌体少，相对通通通通风风风风量量量量可可可可以以以以少少少少些些些些；菌体生长繁殖旺盛期时，耗氧多，要求通风量大些；产酶旺盛时的通风量因菌种和酶种而异，一般需要强烈通风；但也有例外，通风量过多反而抑制酶的生成。因此，菌种、酶种、培养时期、培养基和设备性能都能影响通风量，从而影响酶的产量。目目目目前前前前用用用用于于于于酶酶酶酶制制制制剂剂剂剂生生生生产产产产的的的的微微微微生生生生物物物物都都都都为为为为好好好好气气气气性性性性微微微微生生生生物物物物，生生生生产产产产上上
18、上上普普普普遍遍遍遍采用自动测定和记录溶解氧的仪表。采用自动测定和记录溶解氧的仪表。采用自动测定和记录溶解氧的仪表。采用自动测定和记录溶解氧的仪表。(4)搅拌的影响n对于好气性微生物的深层发酵，除了需要通气外，还需要搅拌。搅搅搅搅拌拌拌拌有有有有利利利利于于于于热热热热交交交交换换换换、营营营营养养养养物物物物质质质质与与与与菌菌菌菌体体体体均均均均匀匀匀匀接接接接触触触触，降降降降低低低低细细细细胞胞胞胞周周周周围围围围的的的的代代代代谢谢谢谢产产产产物物物物，从从从从而而而而有有有有利利利利于于于于新新新新陈陈陈陈代代代代谢谢谢谢。同时可打破空气气泡，使发酵液形成湍流，增加湍流速度，从而提
19、高溶氧量，增加空气利用。但搅拌速度主要因菌体大小而异，由于搅拌产生剪切力，易使细胞受损。同时搅拌也带来一定机械热，易使发酵液温度发生变化。搅拌速度还与发酵液黏度有关。(5)泡沫的影响n发酵中往往产生较多的泡沫。泡泡泡泡沫沫沫沫的的的的存存存存在在在在阻阻阻阻碍碍碍碍了了了了COCO2 2的的的的排排排排除除除除，影影影影响响响响溶溶溶溶氧氧氧氧量量量量，同同同同时时时时泡泡泡泡沫沫沫沫过过过过多多多多影影影影响响响响补补补补料料料料，也也也也易易易易使使使使发发发发酵酵酵酵液液液液溢溢溢溢出出出出罐罐罐罐外外外外造造造造成成成成跑跑跑跑料料料料。因此，生产上必须采用消泡措施。一般除了机械消泡外
20、，还可利用消泡剂。消泡剂主要是一些天然的矿物油类、醇类、脂肪酸类、胺类、酰胺类、醚类、硫酸酯类、金属皂类、聚硅氧烷和聚硅酮，其中以聚甲基硅氧烷最好。我国常用聚氧丙烯甘油醚或泡敌(聚环氧丙环氧乙烷甘油醚)。理想的消泡剂，其表面相互作用力应低，而且应难溶于水，还不能影响氧的传递速率和微生物的正常代谢。(6)湿度n用固体培养基生产酶制剂时，一般前期湿度低些，培养后期湿度大些，有利于产酶。2.3 酶的分离纯化酶的分离纯化工作，是是是是酶酶酶酶学学学学研研研研究究究究的的的的基基基基础础础础。酶的纯化过程，就目前而言，还是一门实实实实验验验验科科科科学学学学。一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行
21、摸索，没有通用的规律可循。酶的纯化过程与一般的蛋白质纯化过程相比，又有其本身独独独独有有有有的的的的特特特特点点点点：一是特定的一种酶在细胞中的含含含含量量量量很很很很少少少少，二是酶可以通过测测测测定定定定活活活活力力力力的方法加以跟踪，前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们迅速找出纯化过程的关键所在。2.3.1 酶原料的选择一般来说，为了使纯化过程容易进行，总是选择目的酶酶酶酶含含含含量量量量最最最最多多多多的的的的生生生生物物物物组组组组织织织织为原料来进行提取纯化的。当然，也要考虑原料的来源、取材方便、经济等因素。在分离纯化动物Cu，ZnSOD(超氧化物歧化酶)时，一般就以含Cu，Zn
22、SOD很高的动物血球为原材料。MnSOD主要存在于线粒体中，所以，龙虾、灵芝草、人体组织适宜于作为提取MnSOD的原材料。但龙虾、灵芝草等非常昂贵，人体组织也很难得到，因而，除非是特殊目的的纯化，一般不选用这些材料提取酶。目前，利用动、植物细胞体外大规模培养技术，可以大量获得以前极为珍贵的原材料(例如人参细胞、某些昆虫细胞等)，用于酶的分离纯化。利用基基基基因因因因工工工工程程程程重重重重组组组组DNADNA技技技技术术术术，能能能能够够够够使使使使某某某某些些些些在在在在细细细细胞胞胞胞中中中中含含含含量量量量极极极极微微微微的的的的酶酶酶酶的的的的纯纯纯纯化化化化成成成成为为为为可可可可能
23、能能能。例如，大肠杆菌胞内芳香族氨基酸的合成需要EPSP合成酶（丙酮酰莽草酸磷酸合成酶）的参与。现已分离出这种酶的基因并重组入多拷贝质粒pAT153，将此质粒转化大肠杆菌，产生一种比野生型大肠杆菌株高100倍EPSP合成酶含量的新菌株。从18g新菌株的菌体中，可纯化得4.8 mgEPSP合成酶。2.3.2 酶的提取2.3.2.1 生物组织的破碎各种生物组织的细胞有着不同的特点，在考虑破碎方法时，要根据细胞性质、处理量及酶的性质，采用合适的方法。(1)机械(匀浆)法n利用机械力的搅拌、剪切、研碎细胞。(2)超声波法n超声处理的主要问题是超声空穴局部过热引起酶活性丧失，所以超声振荡处理的时间应尽可
24、能短，容器周围以冰浴冷却处理，尽量减小热效应引起的酶的失活。(3)冻融法n生物组织经冰冻后，细胞胞液结成冰晶，使细胞壁胀破。冻融法所需设备简单，普通家用冰箱的冷冻室即可进行冻融。一般需在冻融液中加入蛋白酶抑制剂，如PMSF(苯甲基磺酰氟)、络合剂EDTA、还原剂DTT(二硫苏糖醇)等以防破坏目的酶。(4)渗透压法n渗透破碎是破碎细胞最温和的方法之一。细胞在低渗溶液中由于渗透压的作用，溶胀破碎。如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象。但这种方法对具有坚韧的多糖细胞壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用，除非用其他方法先除去这些细胞外层坚韧的细胞壁。(5)酶消化法n利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖苷酶对细胞膜
25、或细胞壁的酶解作用，使细胞崩解破碎。将革兰氏阳性菌(如枯草杆菌)与溶菌酶一起温育，就能得到易破碎的原生质体，用EDTA与革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)一起温育，也可制得相应的原生质体。几丁质酶和3葡聚糖酶则常用于水解曲霉、面包霉等的细胞壁。(6)化学破碎法n化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏的方法。n常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。n 有机溶剂处理w常用的有机溶剂有甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。w有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。例如，将细胞悬浮在10倍体积的预冷至20的丙酮之中，搅拌均匀，
26、待自然沉降后弃上清液，抽滤得细胞，再用2.5倍体积的20 丙酮洗涤，抽干后，把得到的细胞立即放入真空干燥器中，除去残余的丙酮，得到细胞干粉，可长期保存，使用时再用水或缓冲液把胞内的酶提取出来。n 表面活性剂处理w表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用使细胞膜结构破坏，增加膜的透过性。2.3.2.2 酶的提取酶酶酶酶的的的的提提提提取取取取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程，也称作酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。大多数酶能溶解于水，可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液提取；有些酶与脂质结合或含较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取
27、。为为为为了了了了提提提提高高高高酶酶酶酶的的的的提提提提取取取取率率率率并并并并防防防防止止止止酶酶酶酶的的的的变变变变性性性性失失失失活活活活，在在在在提提提提取取取取过过过过程程程程中中中中，要要要要注注注注意意意意控控控控制制制制好好好好温温温温度度度度、pHpH值值值值等等等等各各各各种种种种条条条条件件件件。破碎生物组织一般在适当的缓冲液中进行。典型的抽提液由以下几部分组成：抽提液 离子强度调节剂 十 pH缓冲剂 温度效应剂 (KCl、NaCl、蔗糖)(各种缓冲液)(甘油、二甲基亚砜)蛋白酶抑制剂 防氧化剂 重金属络合剂 增溶剂 (PM3F、DIFP)(DTT 巯基乙醇)(EDTA
28、、柠檬酸)(TritonX100)根据酶提取时所采用的溶剂或溶液的不同，酶的提取方法主要有盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取等。(1)盐溶液提取n大多数酶溶于水，而且在一定浓度的盐存在条件下，酶的溶解度增加，这称之为盐盐盐盐溶溶溶溶现现现现象象象象，然而盐浓度不能太高，否则溶解度反而降低，出现盐析现象。所以一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0.020.5 mol/L的范围内。例如，用固体发酵生产的麸曲中的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15 mol/L的氯化钠溶液或0.020.05 mol/L的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢酶用0.50.6 mol/L的磷酸氢二钠溶
29、液提取；6磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1 mol/L的碳酸钠提取：枯草杆菌碱性磷酸酶用0.1 mol/L的氯化镁提取等。有少数酶，如霉菌产生的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好。(2)酸溶液提取n有些酶在酸酸酸酸性性性性条条条条件件件件下下下下溶溶溶溶解解解解度度度度较较较较大大大大且稳定性较好宜用酸溶液提取。例如从胰脏中提取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，采用0.12 mol/L的硫酸溶液进行提取。(3)碱溶液提取n有些在碱碱碱碱性性性性条条条条件件件件下下下下溶溶溶溶解解解解度度度度较较较较大大大大且稳定性较好的酶，应采用碱溶液提取。例如，细菌L天门冬酰胺酶的提取是将含酶菌体悬浮在pH 1112.
30、5的碱溶液中，振荡20 min，即达到显著的提取效果。(4)有机溶剂提取n n有有有有些些些些与与与与脂脂脂脂质质质质结结结结合合合合比比比比较较较较牢牢牢牢固固固固或或或或分分分分子子子子中中中中含含含含非非非非极极极极性性性性基基基基团团团团较较较较多多多多的的的的酶酶酶酶，不不不不溶溶溶溶或或或或难难难难溶溶溶溶于于于于水水水水、稀稀稀稀酸酸酸酸、稀稀稀稀碱碱碱碱和和和和稀稀稀稀盐盐盐盐溶溶溶溶液液液液中中中中，需需需需用用用用有有有有机机机机溶溶溶溶剂剂剂剂提提提提取取取取。常用的有机溶剂是与水能够混溶的乙醇、丙酮、丁醇等。其中丁醇对脂蛋白的解离能力较强，提取效果较好，已成功地用于琥珀
31、酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、胆碱酯酶等的提取。2.3.2.3 离心分离离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术，在酶的提取和分离纯化过程中，细胞的收集、细胞碎片和沉淀的分离以及酶的纯化等往往要使用离心分离。在在在在离离离离心心心心分分分分离离离离时时时时，要要要要根根根根据据据据欲欲欲欲分分分分离离离离物物物物质质质质以以以以及及及及杂杂杂杂质质质质的的的的大大大大小小小小、密密密密度度度度和和和和特特特特性性性性的的的的不不不不同同同同，选选选选择择择择适适适适当当当当的的的的离离离离心心心心机机机机、离离离离心心心心方方方方法法法法和离心条件和离心条件和离心
32、条件和离心条件。离心机多种多样，按照离心机的最大转速的不同可以分为常速(低速)、高速和超速三种。常速离心机的最大转速在8000 r/min以内，相对离心力(RCF)在1104g以内，在酶的分离纯化过程中，主要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。2.3.3 酶的纯化抽抽抽抽提提提提的的的的酶酶酶酶液液液液是是是是否否否否需需需需要要要要进进进进一一一一步步步步经经经经过过过过纯纯纯纯化化化化，要要要要视视视视其其其其应应应应用用用用部部部部门门门门的的的的要要要要求求求求。一般工工工工业业业业的的的的酶酶酶酶，如纺织工业应用淀粉酶脱胶处理，往往采用液液液液体体体体粗粗粗粗酶酶酶酶便可；
33、皮革工业应用的细菌蛋白酶也是如此。食食食食品品品品工工工工业业业业应应应应用用用用的的的的酶酶酶酶如果粗酶液已达到食品级标准要求，特别是卫生指标，也无需进一步纯化。然而，应用于医药、化学试剂级的酶液必须进一步纯化。在浓缩液或发酵液中，除含有我们需要的酶以外，还不可避免地存在着其他大分子物质和小分子物质。其中小分子物质在以后的纯化步骤中会自然而然的除去。大分子物质中包括核酸、粘多糖及其他蛋白质等。因此，酶的分离纯化工作主要是，将酶从杂蛋白中分离出来或者将杂蛋白从酶溶液中除去。现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的。酶和杂蛋白的性质差异大体有以下几个方面，它们的分离方法根据这
34、个基础分为：n(1)根据分分分分子子子子大大大大小小小小而设计的方法。如离心分离法、筛膜分离法、凝胶过滤法等。n(2)根据溶溶溶溶解解解解度度度度大大大大小小小小分离的方法、如盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法等。n(3)按分子所带正正正正负负负负电电电电荷荷荷荷多多多多少少少少分分分分离离离离的方法，如离子交换分离法、电泳分离法、聚焦层析法等。n(4)按稳稳稳稳定定定定性性性性差差差差异异异异建立的分离方法，如选择性热变性法、选择性酸碱变性法、选择性表面变性法等。n(5)按亲亲亲亲和和和和作作作作用用用用的的的的差差差差异异异异建立的分离方法，如亲和层析法、亲和电泳
35、法等。酶的纯化方法：重要凝胶过滤(gel filtration chromatography)凝胶过滤有多种名称，又称凝胶排阻层析、分子筛层析法、凝胶层析法等。是根据溶质分子的大小进行分离的方法。它具有一系列的优点：操作方便，不会使物质变性，层析介质不需再生，可反复使用等；因而在酶纯化中占有重要位置。由于凝胶层析剂的容量比较低，所以在生物大分子物质的分离纯化中，一般不作为第一步的分离方法，而往往在最后的处理中被使用。它的应用主要包括脱盐，生物大分子按分子大小分级分离以及分子量测定等。(1)基本原理在显微镜下，可观察到凝胶过滤层析介质具有海绵状结构。将凝胶装于层析柱中，加入混合液，内含不同分子量
36、的物质，小分子溶质能在凝胶海绵状网格内，即凝胶内部空间全都能为小分子溶质所达到，凝胶内外小分子溶质浓度一致。在向下移动的过程中，它从一个凝胶颗粒内部扩散到胶粒孔隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进人与流出，使流程增长，移动速率慢故最后流出层析柱。而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分送入凝胶颗粒，从而在大分子与小分子物质之间被洗脱。大分子溶质不能透人凝胶内，而只能沿着凝胶颗粒间隙流运动，因此流程短，下移速度较小分子溶质快而首先流出层析柱。因而样品通过定距离的层析柱后，不同大小的分子将按先后顺序依次流出，彼此分开。图24 凝胶过滤层析的原理a.小分子由于扩散作用进入凝胶内部被截留；大
37、分子被排阻在颗粒外，在颗粒间迅速通过。b.1.蛋白质混合物上柱，2.洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内大分子被排阻在颗粒外，3.小分子被截留，大分子向下移动，大小分子分开，4.大小分子完全分开，5.大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在行进中。(2)凝胶种类 葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖凝凝凝凝胶胶胶胶 是分子量几万到几十万的葡聚糖凝胶通过环氧氯丙烷交联而成的网状结构物质，可分离分子量从l l 000500 000500 000000的分子。其商品名是Sephadex G，有各种型号(表23)，G后的数字表示每g干胶吸水量(即吸水值)的10倍。其特性如表23所示，另外还有一种为Sephacry
38、lS，通过N，N甲叉双丙烯酰胺交联的烯丙基葡聚糖，可适用于水、有机溶剂及高浓度解离试剂存在的系统。另一类SephadexLH，适用于脂类化合物的分离。聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶 是以丙烯酰胺为单体，通过N，N甲叉双丙烯酰胺为交联剂共聚而成的凝胶物质。商品名是BioGel P，有各种型号，P后的数字乘以1 000表示其分离的最大分子量(即排阻分子量)。琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶 琼脂糖是琼脂抽去琼脂胶等之后所得D半乳糖和3，6脱水半乳糖，自动缔合而成的网眼结构物质，孔孔径径大大小小由由胶胶的的浓浓度度决决定定。以商品Sepharose为例，有2B、4B和6B等规格，B前面数字表示胶百分浓度。这这类类
39、凝凝胶胶孔孔径径都都比比较较大大，适适于于分分离离较较大大的的物物质质，如如病病毒毒、细细胞胞颗颗粒粒和和DNA等等。其他纯化方法亲和层析法n利用生物体内存在的特异性相互作用分子对而设计的层析方法染料层析法n具有亲和配基的染料可以吸附酶，由于配基的结构类似某些酶的底物。疏水层析n将疏水性基团如丁烷、辛烷、苯固定化到介质上，这些基团会与蛋白质生物大分子上的疏水区亲和。电泳n靠溶质在电场移动中移动速度不同而分离的方法。2.4 酶分离、纯化的评价酶经分离、纯化后要确定该纯化步骤是否适宜，必须经过对有关参数的测定及计算才能确定。酶的产量是以活活力力单单位位表表示示，因此在整个分离过程中每一步始终贯穿比
40、活力和总活力的检测、比较。基本概念1酶活力(Enzyme activity)：酶活力是指酶催化反应的能力，它表示样品中酶的含量。1961年国际酶学会规定，l min催化lmol分子底物转化的酶量为该酶的一个活力单位(国际单位)，温度为25，其它条件(pH、离子强度)采用最适条件。重要酶的总活力为样品的全部酶活力。总活力=酶活力 总体积(mL)或 =酶活力 总质量(g)比活力(Specific activity)：比活力是指单位蛋白质(毫克蛋白质或毫克蛋白氮)所含有的酶活力(单位/毫克蛋白)。比比活活力力是是酶酶纯纯度度指指标标，比比活活力力愈愈高高表表示示酶酶愈愈纯纯，即即表表示示单单位位蛋蛋
41、白白质质中中酶酶催催化化反反应应的的能能力力愈愈大大。但是，比活力仍然是个相对酶纯度指标。要了解酶的实际纯度，尚需采用电泳等测定方法。回收率(Yield percent)：回收率是指提纯前与提纯后酶的总活力之比。它表示提纯过程中酶的损失程度，回收率愈高，其损失愈少。提纯倍数：提纯倍数是指提纯前后两者比活力之比。它表示提纯过程中酶纯度提高的程度，提纯倍数愈大，提纯效果愈佳。酶纯化评价实例 2.5 酶的剂型与保存酶制剂通常有下列四种剂型：n液体酶制剂n固体粗酶制剂n纯酶制剂n固定化酶制剂2.5.1 液体酶制剂 包括稀酶液和浓缩酶液。一般除去固体杂质后，不再纯化而直接制成，或加以浓缩而成，一般需要加
42、稳定剂。这种酶制剂不稳定，且成分复杂，只用于某些工业生产。2.5.2 固体粗酶制剂 发发发发酵酵酵酵液液液液经经经经杀杀杀杀菌菌菌菌后后后后直直直直接接接接浓浓浓浓缩缩缩缩或或或或喷喷喷喷雾雾雾雾干干干干燥燥燥燥制制制制成成成成。有的加入淀粉等填充料，用于工业生产。有的经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物生产。用于加工或生产某种产品时，务须除去起干扰作用的杂酶，才不会影响质量。固固固固体体体体酶酶酶酶制制制制剂剂剂剂适适适适于运输和短期保存，成本也不高于运输和短期保存，成本也不高于运输和短期保存，成本也不高于运输和短期保存，成本也不高。2.5.3 纯酶制剂 包括结晶酶，通通通通常常常常用用用用
43、作作作作分分分分析析析析试试试试剂剂剂剂和和和和医医医医疗疗疗疗药药药药物物物物。要求较高的纯度和一定的活力单位数。用作分析工具酶时，除了要求没有干扰作用的杂酶存在外，还要求单位质量的酶制剂中酶活力达到一定的单位数。用作基因工程的工具酶要求不含非专一性的核酸酶，或完全不含核酸酶，酶的保存方法(1)温度。(2)pH与缓冲液。(5)为提高酶稳定性，常加入下列稳定剂：n 底物、抑制剂和辅酶，它们的作用可能是通过降低局部的能级水平，使酶蛋白处于不稳定状态的扭曲部分转入稳定状态。n 对巯基酶，可加入SH保护剂。如二巯基乙醇、GSH(谷胱甘肽)、DTT(二硫苏糖醇)等。n 其他如Ca2+能保护淀粉酶，Mn
44、2+能稳定溶菌酶，Cl能稳定透明质酸酶。(3)酶蛋白浓度。(4)氧。基本概念 2酶分子修饰：n通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程。如金属离子交换法、大分子修饰法n例如，Bender和Kosland成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。重要酶分子的修饰方法化化学学法法又可分为：金属离子置换法、大分子修饰法、肽链有限水解法、蛋白侧链基团的小分子修饰法等。生生物物法法是通过基因工程的手段改变蛋白质，即基于核酸水平对蛋白质进行改造，利用基因操作技术对DNA或mRNA进行改造和修饰以期获得化学结构更为合理的蛋白质。物物理理修修饰饰法法的特点是不改变酶的组成和基团，酶分子的共价键不发生变化。重要谢 谢！