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1、20世纪人类科技发展史上的三大创举 90年代人类基因组计划40年代第一颗原子弹爆炸60年代人类首次登上月球第1页/共61页一、人类基因组计划的启动 1986 年诺贝尔奖获得者R.Dulbecco（杜尔贝科）提出人类基因组计划第一节人类基因组计划第一节人类基因组计划第2页/共61页 美国政府决定于美国政府决定于 19901990年正式年正式启动启动HGPHGP，预计用，预计用 15 15 年年时间，时间，投入投入 30 30 亿美元亿美元，完成，完成 HGPHGP。HGPHGP逐渐扩展为多国协作计逐渐扩展为多国协作计划。参与者包括：美划。参与者包括：美、英、日、英、日、法、德和中国法、德和中国（
2、19931993年）年）第3页/共61页二、人类基因组计划的进展状况二、人类基因组计划的进展状况（1 1）截至）截至 1998 1998 年年 10 10 月，完成月，完成 1.8 X 1.8 X 10108 8bpbp，占占 计划的计划的 6 6。（2 2）完成一系列模式生物全基因组测）完成一系列模式生物全基因组测定定第4页/共61页（3 3）DNA DNA 测序技术飞速提高测序技术飞速提高 J.C.Venter J.C.Venter 等等宣布，组建商宣布，组建商业公司，投入业公司，投入 3 3 亿美元，亿美元，3 3 年内完成。年内完成。2000.6 完成并公布 人类基因组工作框架图(90
3、%)。第5页/共61页二二000000年六月二十六日克林顿宣布年六月二十六日克林顿宣布人类基因组草图绘制完成人类基因组草图绘制完成第6页/共61页美国国家人类基因组研究所所长弗朗西斯柯林斯在介绍情况。第7页/共61页人类基因组草图基本信息人类基因组草图基本信息由由31.6531.65亿亿bp组成组成含含33.533.5万基因万基因与蛋白质合成有关与蛋白质合成有关 的基因占的基因占2%2%人类基因组人类蛋白质61%与果蝇同源43%与线虫同源46%与酵母同源第8页/共61页同时发表论文同时发表论文 美国美国 ScienceScience,Vol.291,No.5507 ,Vol.291,No.55
4、07 英国英国NatureNature,Vol.409,p.860,Vol.409,p.8602001 年2月16日,人类基因组“精细图”完成，(99%)年月日，人类基因组序列图亦称“完成图”（99.99%），提前绘制成功。第9页/共61页DAN测序胶图第10页/共61页三、人类基因组计划的科学意义三、人类基因组计划的科学意义（1）确定人类基因组中约3万个编码基因的序列及其在基因组中的物理位置，利于研究基因的产物及其功能。（2）了解转录和剪接调控元件的结构与位置，从整个基因组结构的宏观水平上理解基因转录与转录后调节。第11页/共61页（4）研究空间结构对基因调节的作用。（3）从整体上了解染色体
5、结构，包括各种重复序列以及非转录“框架序列”的大小和组织，了解各种不同序列在形成染色体结构、DNA复制、基因转录及表达调控中的影响与作用。（5）发现与DNA复制、重组等有关的序列。第12页/共61页（6）研究DNA突变、重排和染色体断裂等，了解疾病的分子机制，包括遗传性疾病、易感性疾病、放射性疾病甚至感染性疾病引发的分子病理学改变及其进程，为这些疾病的诊断、预防和治疗提供理论依据。（7）确定人类基因组中转座子、逆转座子和病毒残余序列，研究其周围序列的性质。了解有关病毒基因组侵染人类基因组后的影响，可能指导人类有效地利用病毒载体进行基因治疗。（8）研究染色体和个体之间的多态性。第13页/共61页
6、系Gene和Chromosome二词缩并而成，它可被译为“基因组”或“染色体组”。以基因组分析为手段，研究基因组的结构组成、时序表达模式和功能，并提供有关生物物种及其细胞功能进化信息的一门学科。GenomeGenomics第二节基因组分析概述第14页/共61页1.结构基因组学主要涉及从DNA序列水平上来确定基因组结构，代表着基因组分析的起始阶段,结构图谱指某一有机体的完整的DNA序列图谱。2.功能基因组学利用结构基因组学研究所得到的各种来源的信息，建立与发展各种技术和实验模型来测定基因及基因组非编码序列生物学功能的学科，代表着基因组学的新阶段。3.比较基因组学主要涉及不同有机体基因组间的比较研
7、究。基因组学包括三个相互联系的领域：第15页/共61页1.确定基因在染色体上的位置及包含的遗传信息。基因组分析的任务:2.分析基因之间的联系。3.分析基因与性状之间的关系。4.基因的组成结构、表达调控等。第16页/共61页第三节基因组作图遗传图谱转录图谱cM序列图谱物理图谱kbkbSTSmapSTSmap第17页/共61页一、基因图谱(genemap)的类型1.染色体核型与细胞遗传学图谱利用染色体的形态结构特征如着丝粒、疖、随体、端粒等进行基因的定位而绘制出的图谱。第18页/共61页相关技术相关技术染色体原位杂染色体原位杂交交染色体原位杂交技术是染色体原位杂交技术是DNA探针与染色体上探针与染
8、色体上的的DNA杂交，并在染色体上直接进行检测的杂交，并在染色体上直接进行检测的分子标记技术。分子标记技术。目前发展最快的是荧光素参与的原位目前发展最快的是荧光素参与的原位DNA杂杂交技术，即荧光原位杂交（交技术，即荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization)技术，简称技术，简称FISH技术技术。第19页/共61页制备探针；染色体制片；染色体处理与变性；染色体与探针杂交；显微检测。原位杂交技术的基本步骤第20页/共61页染色体专一位点探针染色体专一位点探针第21页/共61页第22页/共61页2.遗传连锁图谱表明两个或两个以上的基因位点间的位置关系和遗传距
9、离的图谱。也称连锁图谱(linkagemap)或遗传连锁图谱(geneticlinkagemap)。3.物理图谱把DNA片段按照实际的物理位置进行排序，通常是指高分辨率的基因组长度片段限制性酶切图谱和重叠克隆图谱。第23页/共61页4.转录图谱 也叫“基因图谱”或“基因表达图”，基本含义是鉴别人类目前认识的全部基因，包括编码蛋白质的基因和决定各类RNA的基因。5.序列图谱 是基因组计划最实质的内容，是最精密的基因图谱，即它将DNA序列按照遗传图和物理图的标记，确定在基因组中而组合成完整的染色体序列图谱。第24页/共61页多态性分子标记是多态性分子标记是DNA水平上绘制现代遗传图水平上绘制现代遗
10、传图谱的主要路标（谱的主要路标（landmark)。染色体上的基因和DNA顺序均可作为路标，路标具有物理属性，他们由特定的DNA顺序组成。路标位于染色体上的位置是固定的，不会更改的，因而提供了作图的依据。标记1标记2标记3基因组路标二、分子标记二、分子标记第25页/共61页目前应用的路标多态性分子标记RFLPRFLPrestrictionfragmentlengthpolymorphism,限制性片段长度多态性RAPDRAPDrandomamplifiedpolymorphismDNA随机扩增多态性AFLPAFLPamplifiedfragmentlenthpolymorphism扩增片段长度
11、多态性SSLPSSLPsimplesequencelengthpolymorphism简单序列长度多态性SNPSNPsinglenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性SSCPSSCPsingle-strandcomformationpolymorphism单链构象多态性第26页/共61页RFLP技术是基于Southern杂交的分子标记的方法，它是指用限制性内切酶酶切不同个体基因组DNA后，酶切片段长度的差异。这一技术用放射性同位素标记DNA片段作为同源序列探针（RFLP标记），与经限制酶消化并转移到支持膜上的基因组总DNA杂交，通过放射性自显影（或非同位素技术）来显示酶切片
12、段的大小，检测不同遗传位点的多态性。1.RFLP第27页/共61页RFLP的特点1)处于染色体上的位置相对固定;2)遵循孟德尔遗传;3)同一凝胶电泳可显示不同多态性片段,表现为共显性.第28页/共61页第29页/共61页ABAB限制性内切酶位点与放射性探针结合部位限制性内切酶酶切后；电泳分离DNA片段；转移至硝酸纤维素薄膜；与放射性探针杂交，分析阳性条带第30页/共61页RFLPRFLP作图作图第31页/共61页第32页/共61页原理：以基因组DNA为模板，采用随机设计的单个寡核甘酸序列（一般为10nt）为引物，通过PCR扩增，产生不连续的DNA产物，用于检测DNA序列的多态性。2.RAPD第
13、33页/共61页（1）不需）不需DNA探针，设计引物也无须知道序列信息；探针，设计引物也无须知道序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；缺点缺点实验重复性较差，结果可靠性较低。实验重复性较差，结果可靠性较低。RAPD标记的主要特点有：第34页/共61页RAPD扩增克隆鱼扩增克隆鱼(B)、供体红鲤供体红鲤(A)、受体金鱼受体金鱼(D)
14、和杂交鱼和杂交鱼(C，即即AxD)的细胞核的细胞核DNA指纹图谱。指纹图谱。结果显示，对于不同的引物，克隆鱼的扩增谱带均和结果显示，对于不同的引物，克隆鱼的扩增谱带均和供体红鲤的一致，迥异于受体金鱼和杂交鱼。供体红鲤的一致，迥异于受体金鱼和杂交鱼。第35页/共61页3.AFLP 1)这是一种筛选RFLP分子标记的方法。先将DNA样品采用选定的限制性内切酶(如EcoRI,Sau3A)消化，然后加上接头。2)PCR引物设计:根据限制酶接头添加数个向外延伸的碱基，然后向3方向延伸1-3个不同的碱基。3)选择不同的引物扩增样品DNA，经聚丙烯胺凝胶电泳分离PCR产物。第36页/共61页AFLP的操作程
15、序第37页/共61页第38页/共61页第四节的鸟枪法序列分析技术第四节的鸟枪法序列分析技术 一、一、的鸟枪法测序原理第39页/共61页2000年3月用“全基因组鸟枪法”获得果蝇全基因组序列。第40页/共61页二、二、DNA的鸟枪法测序的主要步骤的鸟枪法测序的主要步骤 1、建立高度随机、插入片段大小为2kb左右的基因组文库。2、高效、大规模的末端测序。3、序列集合。4、填补缺口。第41页/共61页Shotgun法序列拼接SequenceGapSequenceGap 第42页/共61页三、三、的鸟枪法测序的优缺点优点：速度快优点：速度快 缺点：缺点：随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加高
16、等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误第43页/共61页第44页/共61页 一、比较基因组学(Comparative Genomics)概念：是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。第五节比较基因组学及功能基因组学研第五节比较基因组学及功能基因组学研究究第45页/共61页物种物种完成完成年份年份总长度总长度/Mp已完成总长已完成总长的百分数的百分数/%占常染色质占常染色质百分数百分数/Mb基因数基因数/Mb酵母酵母19961293100483线虫线虫19989699100197果蝇果蝇200011664971
17、17拟南芥拟南芥200011592100221人类全基因组人类全基因组2003316599.9999.99300基本完成DNA序列分析的真核生物基因组比较第46页/共61页二、功能基因组学研究二、功能基因组学研究 1.概念：概念：利用结构基因组学提供的信息，以高通利用结构基因组学提供的信息，以高通量，大规模实验方法及统计与计算机分析为特征，量，大规模实验方法及统计与计算机分析为特征，全面系统地分析全部基因的功能全面系统地分析全部基因的功能包括结构注释和功能注释，其中基因组功能注释是功能基因组学的主要研究目标。基因组序列注释第47页/共61页结构注释:通过基因组组成元素的寻找来识别、搜寻基因，也
18、称基因注释。如确定基因组的全部编码区或ORF。功能注释：用最大相似的同源基因的功能注释咨询序列；用元件(MOTIF)搜索，元件往往是功能相关的保守序列;直系同源簇方法，即用不同种族的基因成对相似聚类法把它们划分成各种直系同源簇，从而可以用同一簇中的已知基因来注释未知基因；以近缘物种EST搜索、注释。第48页/共61页2.2.基因功能的研究方法基因功能的研究方法(1)基基因因转转导导技技术术：导导入入细细胞胞，观观察察功功能能。该该方法用的最多，技术最成熟。方法用的最多，技术最成熟。(2)基因打靶(genetargeting)通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究该
19、基因的功能。基因敲除(geneknockout)：定向敲除基因敲入(geneknockin)：定向替代第49页/共61页（3）RNA干涉（干涉（RNA interference)RNA干涉是在演化中保留下来的一个过程，通过该过程，双链干涉是在演化中保留下来的一个过程，通过该过程，双链RNA诱导诱导目标基因沉默。目标基因沉默。第50页/共61页RNAi过程1.RNAi的起始是dsRNA被剪切成siRNA，此步骤需要ATP提供能量；2.随后这些siRNA被组装成无活性的蛋白复合体；3.消耗ATP的能量，siRNA解链将无活性的复合体转变成活性形式；4.最后，在无需或少量ATP的帮助下，该复合体以s
20、iRNA为指导，识别并切割互补的靶RNA。第51页/共61页RNA干涉第52页/共61页siRNA组装的蛋白复合体被命名为组装的蛋白复合体被命名为RISC。（RNA-induced silencing complex）第一步中siRNA产生的关键酶是Dicer，属于双链RNA特异内切酶RNaseIII家族。siRNA特征：21-25nt,双链，5磷酸化（这是必要的），3为羟基末端且有两个不配对核苷酸，此结构形式可能对siRNA进入蛋白复合体是必须的。第53页/共61页(4)DNA芯片技术应用之一 基因表达谱（gene expression pattern)BiologicalBiologica
21、lSampleSampleFunctionalFunctional Information Information红色上调黄色不变绿色下调第54页/共61页核酸杂交技术是基因芯片应用的基础其基本原理是将一系列的核酸片段固定在芯片载体上作为固相靶片段（target），待测的核酸片段人工标记上不同的荧光、或同位素等作为探针（probe），一定条件下两者杂交，根据杂交后不同的信号即可获得靶片段的信息，进行计算机分析。第55页/共61页Northern杂交DotBlot杂交DNA芯片第56页/共61页 基基因因表表达达谱谱芯芯片片可可以以检检测测整整个个基基因因组组范范围围的的众多基因在众多基因在mR
22、NA表达水平的变化。表达水平的变化。它它能能对对来来源源于于不不同同个个体体、不不同同组组织织、不不同同细细胞胞周周期期、不不同同发发育育阶阶段段、不不同同分分化化阶阶段段、不不同同生生理理病病理理、不不同同刺刺激激条条件件下下的的组组织织细细胞胞内内基基因因表表达达情情况况进进行行对对比比分分析析。从从而而对对基基因因群群在在个个体体特特异异性性、组组织织特特异异性性、发发育育特特异异性性、分分化化特特异异性性、疾疾病病特特异异性性、刺刺激激特特异异性性的变化特征和规律进行描述，的变化特征和规律进行描述，第57页/共61页 第58页/共61页基因芯片的优点基因芯片的优点：1.高通量高通量2.大规模大规模3.高度平行性高度平行性4.快速高效快速高效5.高灵敏度高灵敏度6.高度自动化高度自动化第59页/共61页本章重点基因图谱类型分子标记技术（RFLP、RAPD、AFLP、SSR）RNA干涉过程第60页/共61页感谢您的观看。第61页/共61页