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1、会计学1实验二实验二 大肠菌群的检验大肠菌群的检验大肠杆菌的定义大肠杆菌的定义大肠杆菌的定义大肠杆菌的定义n n大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，大肠杆菌（也称大肠埃希氏菌），分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属。归属于埃希氏菌属。n n大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产大肠杆菌指革兰氏阴性无芽孢杆菌、乳糖发酵产酸产气、气、IMViCIMViC试验（靛基质、试验（靛基质、MRMR、V-PV-P、柠檬酸盐试验）、柠檬酸盐试验）为为+-+-或或-+-+-的细菌。的细菌。n n与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括与人类有关的大肠杆菌统称为致泻性大肠杆菌，包括五种：肠毒素
2、性大肠杆菌（五种：肠毒素性大肠杆菌（ETECETEC）、致病性大肠杆）、致病性大肠杆菌（菌（EPECEPEC）、出血性大肠杆菌（）、出血性大肠杆菌（EHECEHEC）、侵袭性大）、侵袭性大肠杆菌（肠杆菌（EIECEIEC）、黏附性大肠杆菌（）、黏附性大肠杆菌（EAECEAEC）。）。第1页/共41页大肠菌群和大肠杆菌的关系大肠菌群和大肠杆菌的关系大肠菌群和大肠杆菌的关系大肠菌群和大肠杆菌的关系耐热大肠菌群的定义：耐热大肠菌群的定义：能在液体乳糖培养基中能在液体乳糖培养基中35/37 35/37 培养培养48h48h产酸产气，并在产酸产气，并在44.544.5培养培养24h24h产酸产气的细菌（
3、依据产酸产气的细菌（依据ISOISO标准）标准）第2页/共41页卫生学意义卫生学意义卫生学意义卫生学意义n n大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的大肠菌群和大肠杆菌是评价卫生质量的重要指标，作为食品中的粪便污染指标。粪便污染指标。n n食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致食品中检出大肠菌群，表明该食品有粪便污染，既可能有肠道致病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流病菌存在，因而也就有可能通过污染的食品引起肠道传染病的流行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人行。大肠菌群数的高低，表明了粪便污染的程度，也反映了对人体健康危
4、害性的大小。体健康危害性的大小。n n大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现大肠杆菌在外界存活时间与一些主要肠道致病菌接近，它的出现预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监预示着某些肠道病原菌的存在，因此该菌是国际上公认的卫生监测指示菌。近年来，有些国家在执行测指示菌。近年来，有些国家在执行HACCPHACCP管理中，将大肠杆菌管理中，将大肠杆菌检测作为微生物污染状况的监测指标和检测作为微生物污染状况的监测指标和HACCPHACCP实施效果的评估指实施效果的评估指标。标。第3页/共41页大肠杆菌的生物学特性大肠杆菌的生物学特性大肠杆菌的生物学特性大肠杆菌的生物
5、学特性基本形态：基本形态：此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约此菌为两端钝圆的短小杆菌，一般约0.5-0.8m*1.0-3.0 m0.5-0.8m*1.0-3.0 m，多单独存在或成，多单独存在或成双，但不呈长链排列。约双，但不呈长链排列。约50%50%的菌株的菌株有周生鞭毛，但多数只有有周生鞭毛，但多数只有1-41-4根，一般根，一般不超过不超过1010根，故菌体动力弱。多数菌根，故菌体动力弱。多数菌株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不株有菌毛，有的有荚膜或微荚膜，不形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，形成芽孢，对普通碱性染料着色良好，革兰氏染色阴性。革兰氏染色阴性。第4页/共41页大肠杆菌的生物学特
6、性大肠杆菌的生物学特性大肠杆菌的生物学特性大肠杆菌的生物学特性培养特性：培养特性：n n大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通大肠杆菌合成代谢能力强，在含无机盐、铵盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。最适生长温度为培养基上生长良好。最适生长温度为3737，在，在42-44 42-44 条件下仍条件下仍能生长，生长温度范围能生长，生长温度范围15-46 15-46。l 在普通营养琼脂上有3种菌落形态：1）光滑型：菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈灰色，在生理盐水中易分散；2）粗糙型：菌落扁平、干涩、边缘不整齐，易 在生理盐水中自凝；3）黏液型：常为含有荚膜的菌株。第5页/共4
7、1页大肠菌群及大肠杆菌测定大肠菌群及大肠杆菌测定大肠菌群及大肠杆菌测定大肠菌群及大肠杆菌测定 MPNMPN法检验流程（法检验流程（法检验流程（法检验流程（FDA BAMFDA BAM）检样检样50g+450ml50g+450ml稀释液稀释液 适当十倍稀释样品适当十倍稀释样品选择选择3 3个适宜的连续稀释度的样品稀释液，个适宜的连续稀释度的样品稀释液，每个稀释度接种三管每个稀释度接种三管LSTLST肉汤（每管肉汤（每管9ml 9ml LSTLST肉汤并加有导管），肉汤并加有导管），每管接种每管接种1mL1mL 35 35 ，24 2h 48 2h24 2h 48 2h 没有产气管没有产气管 有产
8、气管有产气管 报告阴性报告阴性 接种接种BGLBBGLB肉汤管肉汤管 接种接种ECEC肉汤肉汤 35 35 ，48 2h 44.50.5 48 2h 44.50.5 （水浴培养）（水浴培养）24 2h24 2h 48 2h 48 2h 查查MPNMPN表报告结果表报告结果 产气管接种产气管接种EMBEMB平板（平板（3535、1824h1824h）（大肠菌群）（大肠菌群）从从EMBEMB平板上挑取平板上挑取5 5个可疑菌转接到个可疑菌转接到PCAPCA斜斜 面，进行革兰氏染色、面，进行革兰氏染色、IMVCIMVC生化鉴定、接生化鉴定、接 种种LSTLST复检产气复检产气 查查MPNMPN表报告
9、结果表报告结果（大肠杆菌）（大肠杆菌）第6页/共41页大肠菌群测定大肠菌群测定大肠菌群测定大肠菌群测定MPNMPN法检验几点说明法检验几点说明法检验几点说明法检验几点说明n nMPNMPNMPNMPN检索表：检索表：检索表：检索表：MPN MPN 为最大可能数为最大可能数(Most Probable Number)(Most Probable Number)的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释，的简称。这种方法，对样品进行连续系列稀释，加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最加入培养基进行培养，从规定的反应呈阳性管数的出现率，用概率论来推算样品中菌数最
10、近似的数值。近似的数值。MPNMPN检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低检索表只给了三个稀释度，如改用不同的稀释度，则表内数字应相应降低或增加或增加1010倍。倍。n n初发酵和证实试验：初发酵和证实试验：初发酵和证实试验：初发酵和证实试验：1 1）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实）两步法进行了两次乳糖发酵试验。初发酵和证实实验所用培养基不同，但都是为了证实培养物是否符合大肠菌群的定义，即培养物是否符合大肠菌群的定义，即“在在3737分解乳糖产酸产气分解乳糖产酸产气”。LSTLST中提供了磷酸盐中提供了磷酸盐缓冲体系，氯化
11、钠可维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白缓冲体系，氯化钠可维持渗透压，月桂基硫酸钠可抑制非大肠菌群的生长，这个缓冲蛋白胨乳糖肉汤允许胨乳糖肉汤允许“缓慢乳糖发酵（缓慢乳糖发酵（Slow lactose fermentationsSlow lactose fermentations）”来促进菌体产气。来促进菌体产气。BGLBBGLB中中胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。胆盐和煌绿可以抑制革兰氏阳性细菌和除了大肠菌群的很多革兰氏阴性细菌。2 2）初发酵阳性管，不能肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有）初发酵阳性管，不能
12、肯定就是大肠菌群细菌，经过证实试验后，有时可能成为阴性。有数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实数据表明，食品中大肠菌群检验步骤的符合率，初发酵与证实试验相差较大。因此，在实际检测工作中，证实试验是必需的。际检测工作中，证实试验是必需的。n n产气量与倒管：产气量与倒管：产气量与倒管：产气量与倒管：在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），在乳糖发酵试验工作中，经常可以看到在发酵倒管内极微少的气泡（有时比小米粒还小），有时可以遇到在初发酵时产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气有时可以遇到在初发酵时
13、产酸或沿管壁有缓缓上浮的小气泡。实验表明，大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生，而应作进一步试验。虑可能有气体产生，而应作进一步试验。第7页/共41页大肠杆菌测定大肠杆菌测定大肠杆菌测定大肠杆菌测定EMBEMB选择性分离鉴别选择性分离鉴别选择性分离鉴别选择性分离鉴别EMBEMB平板典型大肠杆平
14、板典型大肠杆菌菌落特征：菌菌落特征：中心黑色或紫红色，有中心黑色或紫红色，有或无绿色金属光泽或无绿色金属光泽第8页/共41页大肠杆菌测定大肠杆菌测定大肠杆菌测定大肠杆菌测定EMBEMB选择性分离鉴别选择性分离鉴别选择性分离鉴别选择性分离鉴别n nEMBEMB是一种弱选择性培养基，一些是一种弱选择性培养基，一些球菌也可在该培养基上生长；球菌也可在该培养基上生长；n n高压灭菌可使得美蓝还原从而使培高压灭菌可使得美蓝还原从而使培养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻养基的颜色呈不均一橘黄色，轻轻摇动培养基可以恢复原有的正常紫摇动培养基可以恢复原有的正常紫色，倾注平板前应先摇匀；色，倾注平板前应先摇匀；n
15、n大肠杆菌在该培养基上并不一定总大肠杆菌在该培养基上并不一定总是呈现绿色的金属光泽；是呈现绿色的金属光泽；n n该培养基受可见光易使其中的成分该培养基受可见光易使其中的成分氧化，储存及培养细菌时都应在避氧化，储存及培养细菌时都应在避光条件。光条件。菌名菌落形态大肠埃希氏菌 紫黑色，有绿色金属光泽肺炎克雷伯氏菌粉色，中心色深阴沟肠杆菌粉色，中心色深弗氏志贺氏菌无色鼠伤寒沙门氏菌 无色粪链球菌无色第9页/共41页大肠杆菌测定大肠杆菌测定大肠杆菌测定大肠杆菌测定革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色基本原理：基本原理：革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种重要的鉴别染色法。革兰氏染色法是细菌学中广泛
16、使用的一种重要的鉴别染色法。18841884年由丹麦医师年由丹麦医师GramGram创立。此法可将细菌分为革兰氏阴性菌创立。此法可将细菌分为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌两大类。和革兰氏阳性菌两大类。革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构革兰氏染色的机理主要是利用两类细菌的细胞壁成分和结构的不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚的不同。革兰氏阴性菌的细胞壁中含有较多的类脂质，而肽聚糖的含量较少。当用酒精或丙酮酸脱色时，类脂质被溶解，增糖的含量较少。当用酒精或丙酮酸脱色时，类脂质被溶解，增加了细胞壁的通透性，使初染后的结晶紫和碘的复合物易于渗加了细胞壁的通透性，使初染后的
17、结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色。而革出，结果细胞被脱色，经复染后，又染上复染液的颜色。而革兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含兰氏阳性菌细胞壁中肽聚糖的含量多而且交联度大，类脂质含量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降量少，经乙醇或丙酮洗脱后，肽聚糖层的孔径变小，通透性降低，因此细胞仍保留初染时的颜色。低，因此细胞仍保留初染时的颜色。第10页/共41页大肠杆菌测定大肠杆菌测定大肠杆菌测定大肠杆菌测定革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色革兰氏染色基本步骤：基本步骤：n n将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染将涂片在火焰上固定，滴加
18、结晶紫染液，染液，染1min1min，水洗；，水洗；n n滴加革兰氏碘液，作用滴加革兰氏碘液，作用1min1min，水洗；，水洗；n n滴加滴加95%95%乙醇脱色约乙醇脱色约151530s,30s,直至染色直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗；液被洗掉，不要过分脱色，水洗；n n滴加番红复染液，复染滴加番红复染液，复染1min1min，水洗、，水洗、待干、镜检。待干、镜检。n n结果：革兰氏阳性菌呈结果：革兰氏阳性菌呈紫色紫色紫色紫色，革兰氏，革兰氏阴性菌呈阴性菌呈红色红色红色红色。第11页/共41页大肠杆菌测定大肠杆菌测定大肠杆菌测定大肠杆菌测定生化鉴定生化鉴定生化鉴定生化鉴定Testpo
19、sitivenegativebiotype1biotype2reagentIndole红色环不变色+-KovacsMR红色不变色+甲基红V-P玫瑰红色环不变色-V-P甲、乙液Citrate生长不生长-第12页/共41页实验二实验二大肠菌群的检验大肠菌群的检验一、实验目的一、实验目的1、学习食品中大肠菌群检测程序、方法；、学习食品中大肠菌群检测程序、方法；2、掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。、掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。二、实验材料二、实验材料1、设备和材料、设备和材料温温箱箱、水水浴浴锅锅、天天平平、显显微微镜镜、均均质质器器或或乳乳钵钵、温温度度计计、平皿、试管、发酵管、吸管
20、、载玻片、接种针平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针2、培养基及试剂、培养基及试剂乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管、乳乳糖糖发发酵酵管管、蛋蛋白白胨胨水水、靛靛基基质质试试剂剂、麦康凯、伊红美蓝琼脂（麦康凯、伊红美蓝琼脂（EMB）、革兰氏染色液）、革兰氏染色液第13页/共41页GB4789.3-2010 大肠菌群计数第14页/共41页GB4789.3-2010 大肠菌群计数第15页/共41页第16页/共41页（一）最先准备的器材（一）最先准备的器材（一）最先准备的器材（一）最先准备的器材n n规格名称规格名称 数量数量 用途用途n n1 1、500ml500ml三角瓶三角瓶 1 1个个 稀释样
21、品稀释样品n n2 2、250ml250ml三角瓶三角瓶 1 1个个 制制EMBEMB琼琼脂脂n n3 3、18180mm18180mm试管试管 9 9支支 单料乳糖胆盐发酵管单料乳糖胆盐发酵管n n4 4、18180mm18180mm试管试管 3 3支支 稀释样品稀释样品（9ml9ml）n n5 5、1ml1ml移液管移液管 5 5 支支n n6 6、10ml10ml移液管移液管 3 3 支支n n7 7、直径为、直径为90mm90mm平皿平皿 2 2套套制制EMBEMB平板平板n n8 8、250ml250ml量筒量筒 1 1支支n n9 9、玻璃珠：直径约、玻璃珠：直径约5mm5mm（二
22、）应灭菌消毒的器材（二）应灭菌消毒的器材剪刀1把不锈钢药匙1把 滴管胶头5只称量纸适量第17页/共41页（三）应制备的培养基（三）应制备的培养基n n 培养基培养基 总量总量 所用容器所用容器n n蒸馏水蒸馏水 225ml 500ml225ml 500ml三角瓶三角瓶n n蒸馏水蒸馏水 9ml9ml/3/3支支 27ml 18180mm27ml 18180mm试管（稀释样品）试管（稀释样品）n n乳糖胆盐发酵管（单料）：乳糖胆盐发酵管（单料）：10ml/910ml/9支支 100ml100ml18180mm18180mm试管试管(装杜氏小管装杜氏小管 )n nEMBEMB琼脂：琼脂：1 1瓶瓶
23、 150ml 250ml150ml 250ml三角瓶（每三角瓶（每 组配一瓶）组配一瓶）第18页/共41页蛋白胨20g、胆盐5g、乳糖10g、0.4%溴甲酚紫乙醇溶液25ml、蒸馏水1000ml（将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正PH值至7.4，加入指示剂）；或购买制好的乳糖胆盐发酵培养基、按说明配置。分装试管，每管10ml，并放入一个到气管（杜氏小管），高压灭菌115、15分钟。双料乳糖胆盐发酵培养基除蒸馏水外，其它成分加倍。乳糖胆盐发酵培养基：乳糖胆盐发酵培养基：P99第19页/共41页A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤）肉汤A.1.1 成分成分胰蛋白胨或胰酪
24、胨 20.0 g氯化钠 5.0 g乳糖 5.0 g磷酸氢二钾（K2HPO4）2.75 g磷酸二氢钾（KH2PO4）2.75 g月桂基硫酸钠 0.1 g蒸馏水 1 000 mLpH 6.80.2A.1.2 制法制法将上述成分溶解于蒸馏水中，调节 pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 高压灭菌15 min。第20页/共41页A.2 A.2 煌绿乳糖胆盐（煌绿乳糖胆盐（BGLBBGLB）肉汤）肉汤A.2.1 A.2.1 成分成分蛋白胨 10.0 g乳糖 10.0 g牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液 200 mL0.1%煌绿水溶液 13.3 mL蒸馏水 800 mLpH 7
25、.20.1A.2.2 A.2.2 制法制法将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 mL（将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中，调节pH至7.07.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH，再加入0.1%煌绿水溶液13.3 mL，用蒸馏水补足到1 000 mL，用棉花过滤后，分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 高压灭菌15 min。第21页/共41页A.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）A.3.1 成分蛋白胨 7.0 g酵母膏 3.0 g乳糖 10.0 g氯化钠 5.0 g胆盐或3号胆盐 1.5 g中性红 0.03 g结晶紫 0.002 g
26、琼脂 15 g18 g蒸馏水 1 000 mLpH 7.40.1A.3.2 制法将上述成分溶于蒸馏水中，静置几分钟，充分搅拌，调节pH。煮沸2 min，将培养基冷却至45 50 倾注平板。使用前临时制备，不得超过3 h。第22页/共41页第23页/共41页质控：质控：此培养基呈紫色，可有细微沉淀。质控菌株接种后，此培养基呈紫色，可有细微沉淀。质控菌株接种后，3535培养培养18182424小时，观察结果应如下表所示：小时，观察结果应如下表所示：菌株 菌号 生长情况 菌落产气肠杆菌 ATCC 13048 好 粉红，无光泽大肠埃希氏菌 ATCC 25922 好，极好 有紫绿金属光泽中心肺炎克雷伯氏
27、菌 ATCC 13883 好 绿金属光泽，有黑心奇异变形杆菌 ATCC 25933 好，极好 无色鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 14028 好，极好 无色金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 被抑制 第24页/共41页说明：（1）伊红又称署红或四溴荧光素，为酸性染料。美蓝又称亚甲蓝，为碱性染料。当大肠杆菌分解乳糖产酸时，细菌带正电荷，染上红色，再与美蓝结合而形成紫黑色菌落，并有绿色金属光泽。二者除了作为指示剂外，还有抑制格兰氏阳性菌的作用。（2）在碱性环境中，不分解乳糖产酸的细菌不着色。伊红、美蓝不能结合，故沙门氏菌和志贺氏菌等为无色或琥珀色半透明菌落。（3）此培养基用于鉴别大肠杆菌及产气杆菌，并
28、可快速鉴定白色念珠菌及鉴定凝固酶阳性葡萄球菌。美国公共卫生协会和美国细菌协会推荐，用于增殖或鉴别大肠杆菌的检查。但某些沙门氏菌、志贺氏菌可被抑制。培养基保存应注意避光防止氧化。第25页/共41页样品样品n n1.1.酸奶酸奶1 1n n2.2.鲜奶鲜奶n n3.3.水样水样1 1n n4.4.水样水样2 2n n5.5.水样水样3 3n n6.6.水样水样4 4n n7.7.水样水样5 5n n8.8.酸奶酸奶2 2第26页/共41页A1组组 酸奶1 A2A2组组 水样1 A3组组 水样2 A4组组 水样3 第27页/共41页B1B1组组 鲜奶 B2B2组组 水样4 B3B3组组 水样5 B4
29、组组 酸奶2 第28页/共41页三、实验方法与三、实验方法与步骤步骤1、采样及稀释、采样及稀释以以无无菌菌操操作作将将检检样样25g（或或25ml）放放于于含含有有225ml灭灭菌菌生生理理盐盐水水或或其其他他稀稀释释液液的的灭灭菌菌玻玻璃璃瓶瓶内内（瓶瓶内内预预置置适适当当数数量量的的玻玻璃璃珠珠）或或灭灭菌菌乳乳钵钵内内，经经充充分分振振摇摇或或研研磨磨做做成成1：10的的均均匀匀稀稀释释液液。固固体体检检样样最最好好用用无无菌菌均均质质器器，以以800r/min1000r/min的速度处理的速度处理1min，做成，做成1：10的稀释液。的稀释液。用用1ml灭灭菌菌吸吸管管吸吸取取1：10
30、稀稀释释液液1ml，注注入入含含有有9ml灭灭菌菌生生理理盐盐水水或或其其他他稀稀释释液液的的试试管管内内，振振摇摇混混匀匀，做做成成1：100的的稀稀释释液液，换换用用1支支1ml灭灭菌菌吸吸管管，按按上上述述操操作作依依次次作作10倍倍递递增增稀稀释液释液第29页/共41页2.乳糖初发酵试验乳糖初发酵试验 即即通通常常所所说说的的假假定定试试验验。其其目目的的在在于于检检查查样样品品中中有有无无发发酵乳糖产生气体的细菌。酵乳糖产生气体的细菌。将将待待检检样样品品接接种种于于乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管内内，接接种种量量在在1ml以以上上者者，用用双双料料乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管；1ml
31、及及1ml以以下下者者，用用单单料料乳乳糖糖发发酵酵管管。每每一一个个稀稀释释度度接接种种3管管，置置（361）0C温温箱箱内内，培培养养（242）h，如如所所有有乳乳糖糖胆胆盐盐发发酵酵管管都都不不产产气气，则则可可报报告告为为大大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。管。也可直接用样品接种。10，100,1000 倍稀释（倍稀释（-1，-2，-3）第30页/共41页3.分离培养分离
32、培养（10倍稀释倍稀释）将将产产气气的的发发酵酵管管分分别别转转种种在在伊伊红红美美蓝蓝琼琼脂脂板板或或麦麦康康凯凯琼琼脂脂平平板板上上，置置（361）0C温温箱箱内内，培培养养18h24h，然然后后取取出出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。4.乳糖复发酵试验乳糖复发酵试验 即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌，试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。确能发酵乳糖产生气体。第31页/共41页 在在
33、上上述述的的选选择择性性培培养养基基上上，挑挑取取可可疑疑大大肠肠菌菌群群12个个进进行行革革兰兰氏氏染染色色，同同时时接接种种乳乳糖糖发发酵酵管管，置置（361）0C的的温温箱箱内培养（内培养（242）h，观察产气情况。，观察产气情况。凡凡乳乳糖糖发发酵酵管管产产气气，革革兰兰氏氏染染色色为为阴阴性性无无芽芽胞胞杆杆菌菌，即即报报告告为为大大肠肠杆杆菌菌阳阳性性；凡凡乳乳糖糖发发酵酵管管不不产产气气或或革革兰兰氏氏染染色色为为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。5.报告报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报检索表，报告每
34、告每100ml（g）食品中大肠菌群的最可能数。）食品中大肠菌群的最可能数。第32页/共41页第33页/共41页n n根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查附表根据证实总大肠菌群存在的阳性管数，查附表“最可能数（最可能数（MPNMPN）表）表”，即，即求得每求得每100ml100ml水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以水样中存在的总大肠菌群数。我国目前系以1L1L为报告单位，故为报告单位，故MPNMPN值再乘以值再乘以1010，即为，即为1L1L水样中的总大肠菌群数。水样中的总大肠菌群数。n n对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应作对污染严重的地表水和废水，初发酵试验的接种水样应作1
35、 1：1010、1 1：100100、1 1：10001000或更高倍数的稀释。或更高倍数的稀释。n n如果接种水的水样量不是如果接种水的水样量不是10ml10ml、1ml1ml和和0.1ml0.1ml，而是较低或较高的三个浓度的水，而是较低或较高的三个浓度的水样量，也可查表求得样量，也可查表求得MPNMPN指数，再经下面公式换算成每指数，再经下面公式换算成每100ml100ml的的MPNMPN值。值。n nMPNMPN值值MPNMPN指数指数1010（mlml）/接种量最大的一管（接种量最大的一管（mlml）第34页/共41页 3个大肠菌群/1L饮水 100个细菌总数/1ml饮水我国饮用水卫生标准：第35页/共41页第36页/共41页第37页/共41页第38页/共41页第39页/共41页第40页/共41页