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1、 茯砖茶茯砖茶 茯砖茶，属黑茶，称发酵茶始祖。约在公元1368年（洪武元年即朱元璋“明太祖”建立明朝初）问世，采用陕南，四川等茶为原料，手工筑制，因原料送到咸阳泾阳筑制，称“泾阳砖”；因在伏天加工，故称“伏茶”，又因其药效似土茯苓，就由“伏茶”美称为“茯茶”或“福砖”。茯砖茶压制要经过原料处理、蒸气沤堆、压制定型、发花干燥、成品包装等工序。而发花是茯砖茶特有的工艺，在这个过程当中形成了茯砖特有的“金花”，这也是保证茯砖茶品质的关键工艺。研究表明：茯砖茶“金花”的多种提取成分对PPAR、PPAR均有激活作用，“金花”内两种新的活性物质茯茶素A和茯茶素B，具有显著降低人体类脂肪化合物、血脂、血压、
2、血糖、胆固醇等功效。长期饮用茯茶，能够促进调节新陈代谢，增强人体体质、延缓衰老，对人体起着有效的药理保健和病理预防作用。第1页/共21页 茶多酚（茶多酚（Tea PolyphenolsTea Polyphenols）茶多酚（Tea Polyphenols）是茶叶中多酚类物质的总称，包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。主要为黄烷醇（儿茶素）类，儿茶素占6080%。儿茶素类化合物主要包括儿茶素（EC）、没食子儿茶素（EGC）、儿茶素没食子酸酯（ECG）和没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）4种物质第2页/共21页儿茶素类儿茶素（EC）没食子儿茶素（EGC）儿茶素没食子酸酯（ECG）没
3、食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）茶多酚（Tea Polyphenols），又名抗氧灵、维多酚、防哈灵，是茶叶中所含的一类多羟基类化合物，简称TP。儿茶素类化合物为茶多酚的主体成分，占茶多酚总量的60%80%。第3页/共21页摘要摘要高效液相色谱分析“京威”茯砖茶的四个主要发酵过程表明没食子儿茶素没食子酸脂（EGCG）和儿茶素没食子酸酯（ECG）持续下降到只占终产物的1/3左右。对终产物的植物化学物进行研究发现儿茶素类有四个新B环裂解代谢物（BRFCs），即茯砖素C-F(1-4)以及三个已知BRFCs(5-7)，六个已知儿茶素（8-13），五个简单酚类（14-18），七个黄酮和黄酮苷（19-25
4、），两个生物碱（26,27），三个三萜类化合物（28-30），一个类固醇（31）。这些化合物的结构由一维、二维核磁共振，高分辨质谱，红外光谱以及CD光谱等鉴定。茶叶中有五个化合物（16-18,28,29）是首次报道，并同时提供主要茶多酚降解及BRFCs代产生的可能途径。第4页/共21页1 1 研究背景研究背景 随着发酵程度的增加，茶可具体分为四大类：未发酵（如绿茶）、半发酵（如乌龙茶）、完全发酵的（如红茶）、和后发酵（黑茶，如茯砖茶，FBT）。砖黑茶是以砖的形式用老的、粗的叶子及茶树、冬虫夏草等小树枝压缩而成的一种独特的后发酵茶。据报道，砖黑茶还有抗肥胖、抗菌、抗氧化、抑制脂肪沉积等特殊健康益
5、处。根据材料和制造工艺，砖茶产品可分为以下几种类型：黑砖茶、茯砖茶（FBT）、青砖茶和普洱砖茶。据报道，在部分发酵的乌龙茶，全发酵的红茶以及后期发酵的黑茶中主要茶多酚变化明显，尤其是没食子儿茶素没食子酸脂（EGCG）。绿茶中的儿茶素含量比其他种类的茶高，因为新鲜采摘茶叶中的多酚氧化酶和天然微生物在蒸熟或煎制后会立即失活。而黑茶在发酵过程中，茶叶中的主要儿茶素类被多酚氧化酶催化的成茶黄素，大大减少了儿茶素的含量。茯砖茶（FBT）在“发花”过程中，会有大量的微生物繁殖，并释放胞外酶，由于酶的氧化作用，使得茶叶中的儿茶素，特别是没食子儿茶素没食子酸脂（EGCG）及没食子儿茶素（ECG）的水平大大下降
6、。据报道，在茯砖茶（FBT）生产过程中能够减少粗涩味和酒精味的产生，能提高其质量和口味的主要反应是氧化聚合。一些B环裂解代谢物的和其他聚合产品的明显区别，也可能有助于形成FBT的独特风味和品质。第5页/共21页1 1 研究背景研究背景 虽有关茯砖茶的化学物分析及化合物提纯已经有了大量研究，但是到目前，我们还没有意识到可用高效液相色谱法分析茯砖茶在生产过程中主要茶多酚的变化。另外，还没有形成对“京威”茯砖茶化学提纯的系统研究。因此，本文我们主要探究“京威”茯砖茶的化学组成。通过高效液相色谱，已经分离有31种化合物。通过红外光谱、核磁共振氢谱、高分辨质谱及CD光谱确定4个新B环裂变代谢物与27种已
7、知化合物。高效液相色谱分析不同发酵程度中主要儿茶素水平变化情况，并提供了B环裂变代谢物的可能代谢途径。第6页/共21页2 2 材料与方法材料与方法2.1 主要仪器 Thermo Nicolet 8700 红外光谱仪；氢谱、碳谱；Agilent 6210 高效液相色谱仪；J-815分光偏振计：进行圆二色性（CD）光谱检测。2.2 材料与试剂 没食子酸（GA）、儿茶素（EC）、儿茶素没食子酸酯（ECG）、没食子儿茶素没食子酸脂（EGCG）标准品，购于成都超纯科技有限公司，纯度高于98%；“京威”茯砖茶，购于苍山茶叶公司（中国咸阳），制作过程中的样品仍由该公司提供，真菌生长阶段（称为发花期）是制作茯
8、砖茶的关键步骤，其间的化学成分发生很大的变化，高效液相色谱也主要分析这一期间主要儿茶素的变化。2.3 高效液相色谱分析参数确定 分析使用XP ODS-A C18色谱柱（内径250 mm4.6 mm，5um，宁波HE有限公司）；柱温：30；洗脱液：流动相A（0.17%乙酸水溶液），流动相B（乙腈）；流动相B的梯度设置：04 min,6%;416 min,6%-14%;1622 min，4%-15%;2232 min,15%-18%;3237 min,18%-29%;3745 min,29%-45%;4550 min,45%;5051 min,45%-6%;保持浓度6%洗脱10min；溶剂流速：1
9、.0mL/min；注射量：5uL；检测波长：280nm。第7页/共21页2 2 材料与方法材料与方法2.4“京威”茯砖茶植物化学物质的分离 称取“京威”茯砖茶15g 研磨 石油醚、乙酸乙酯、甲醇（320L）室温下萃取三次 萃取液减压浓缩 三种馏分：A（石油醚馏分165g）、B（乙酸乙酯馏分200g）、C（甲醇馏分2kg）馏分C 二氯甲烷、正丁醇分别萃取 减压浓缩 D（正丁醇馏分450g）。馏分A用硅胶柱分离，用石油醚混合物洗脱，用乙酸乙酯增加极性（1:00:1），得到13种馏分（A1-A13）。馏分B用聚酰胺色谱柱分离，用二氯甲烷混合物洗脱，用乙酸乙酯、甲醇增加极性（2:1:00:1:2），得
10、到8种馏分（B1-B8）。馏分D用二氧化硅凝胶柱分离，用二氯甲烷、甲醇、水（6:1:0.1）洗脱，得到4种馏分（D1-D4）。高效液相色谱使用XP ODS-A C18色谱柱（内径250 mm4.6 mm,5um）分离化合物3和4。柱温：30。洗脱液：流动相A（甲醇），流动相B（水）；流动相A的梯度设置：015 min,50%;1517 min,50%-100%;1720 min，4%-15%;2022 min,100%-50%，保持浓度50%洗脱10min；溶剂流速：1.0mL/min；注射量：20uL；检测波长：280nm和210nm。第8页/共21页茯茯砖砖茶茶提提取取萃萃取取流流程程图图
11、第9页/共21页3 3 结果结果3.1 高效液相色谱法分析后发酵过程中主要茶多酚的变化（1）没食子儿茶素没食子酸脂（EGCG）和儿茶素没食子酸酯（ECG）持续下降到只占终产物的1/3左右；（2）后发酵过程中没食子酸（GA）的水平在发酵前6天一直升高，因微生物鞣酸对没食子儿茶素及单宁的降解产生没食子酸。而后，没食子酸（GA）和儿茶素（EC）含量在终产物中降低，表明GA和EC从开花的第九天便持续降解为简单的酚类。（3）由于有加工过程中的EGCG，ECG和GA的水平明显的变化，这三种化学物质可作为“京威”茯砖茶加工质量控制指标。第10页/共21页3 3 结果结果3.2 茯砖素C和D 化合物1被命名为
12、茯砖素C。化合物1呈无色粉末状，高分辨质谱鉴定其分子式为C16H20O7，不饱和度为7。红外光谱显示有羟基组（峰宽约3181）、酯羰基组（峰宽1731）及苯环（1605,1518）存在。根据A环与C环传递的信号，氢谱显示此化合物类似儿茶素（8）。TCL荧光显示此化合物与FeCl3试剂着色较弱，这也证实了此为儿茶素的新B环裂解代谢物。化合物1的核磁共振碳谱也表明了有黄烷-3-醇的A-和C-环基团存在：一个间苯三酚芳香型A环，两个氧化次甲基和一个亚甲基。观察氢谱、碳谱中的剩余信号，确定有一个次甲基，一个亚甲基，一个酯羰基，一个被氧化的季碳和两个甲氧基。第11页/共21页3 3 结果结果3.2 茯砖
13、素C和D 化合物2被命名为茯砖素D。化合物2呈无色粉末状。高分辨质谱鉴定其分子式为C16H16O8，不饱和度为9。红外光谱显示有羟基组（峰宽约3157）、酯羰基组（峰宽1732）、五元环内脂（1785）及苯环（1607,1521）存在。与茯砖素C相似，氢谱显示化合物2同样没有芳香型B环信号。一个ABX系统显示有一个O-CHCH2片段存在。此外，它还具有独特的单峰亚甲基单元（s,H-5）和甲氧基（3.65,s,OCH3）。化合物2的核磁共振碳谱也表明了有两个羰基（C-3和C-6），一个季碳（C-4）存在。HMBC相关性表示有CH3OCO-CH2-C-CHCH2-CO-单元的存在。由在H-1/71
14、.6（C-3）和H-5/77.3（C-2）的HMBC信号推断，CH3OCO-CH2-C-CHCH2-CO-单元的上连接C-2和C-3。第12页/共21页3 3 结果结果3.2 茯砖素C和D 茯砖素C(1)、茯砖素D(2)和黄烷-3-醇(5)可能通过表儿茶素(8)的B-环酶催化氧化裂解后以顺序或同时加成衍生而来。这两种化合物的生物合成途径及四种化合物具有类似的CD光谱进一步确认了两种新的化合物的立体化学结构。第13页/共21页3 3 结果结果3.3 茯砖素E和F 化合物3被命名为茯砖素E。化合物3呈无色粉末状，高分辨质谱鉴定其分子式为C13H12O5，不饱和度为8。红外光谱显示有羟基组（峰宽约3
15、334）、共轭羰基组（峰宽1685）及苯环（1622,1524）存在。氢谱显示化合物3可能是儿茶素的衍生物，同样没有芳香型B环信号。另外，TCL荧光显示此化合物与FeCl3试剂着色较弱，因此化合物3是另外一个儿茶素的B环裂解代谢物，其NMR数据也非常类似文冠木素6。第14页/共21页3 3 结果结果3.3 茯砖素E和F 化合物4被命名为茯砖素F。化合物4呈无色粉末状，高分辨质谱鉴定其分子式为C13H12O5，不饱和度为8。红外光谱显示有羟基组（峰宽约3209）、羰基组（峰宽1705）及苯环（1605,1518）存在。化合物4与化合物3结构十分相似。有趣的是，化合物3和4最初被纯化为一种化合物，
16、最终这两种化合物被高效液相色谱分离出来。这两种化合物有着相同的分子式，确定它们为一对同分异构体。核磁共振数据显示化合物4有一个甲基，一个内酯，一个完全取代双键和一个氧合次甲基存在。另外，它还有一个以上的亚甲基信号。以上数据都与化合物3的不同，表明在C-3位置双键已经从一侧移动到另一侧。第15页/共21页3 3 结果结果3.3 茯砖素E和F 茯砖素E(3)和茯砖素F(4)是文冠木素(6)的两个同分异构体。除了和文冠木素正Cotton效应（220nm）相比，它们的波长（3为210nm，4为192.5nm）较短外，其CD谱很相似（见图3）。第16页/共21页3 3 结果结果3.4 黑砖茶中儿茶素的降
17、解和B环分裂代谢物传代的可能途径 后发酵茶的特征主要体现于微生物发酵过程，在此过程中，微生物酶和自氧化引发聚合或儿茶素的分解等复杂的生化反应能分别产生儿茶素聚合物或简单的酚类化合物。内酯形成两个新的BRFCs可能途径如下：先由儿茶素涉及初始双加氧酶介导的元B环裂解后通过醛氧化成二羧酸，随后通过醇氧化形成半缩醛，再转化为两个新的BRFCs。茯砖素A、B、黄烷-3-醇（5）以及文冠木素（6）可能的产生途径都在近期的论文中提到(Luo et al.,2013)。如图4所示，没食子儿茶素（EGCG，ECG，GCG，CG）在微生物发酵过程中逐一分解。总之，除了被降解以形成简单酚类，儿茶素也通过氧化二羧酸
18、中间体的三个不同recyclisation通路降解形成三种主要的BRFCs类别，即B-环内酯型、线性6/6/6三环式以及角6/6/5/5四环类型。第17页/共21页Fig.4.Possible pathways for degradation of tea catechins in brick dark tea and generation of BRFCs第18页/共21页4 4 总结总结 本研究表明以高效液相色谱法为基础分析茶叶中主要茶多酚可方便明晰“京威”茯砖茶生产过程中儿茶素和没食子酸的发酵行为，并能更好地了解茶叶在发酵过程中独特的代谢变化。本研究首次对“京威”茯砖茶的4个新B环裂解代谢物及其他27个化合物进行系统的分离、鉴定，并提供了主要茶多酚的变化机制及B环裂解代谢物的可能代谢途径。没食子儿茶素先分解为非没食子儿茶素和没食子酸，随后非没食子儿茶素和没食子酸则继续分解为简单的酚类物质。另一方面，儿茶素通过起初双加氧酶介导的元B-环裂解及不同通路降解形成了三种类型的BRFCs。第19页/共21页敬请老师同学批评指正敬请老师同学批评指正!谢谢！谢谢！第20页/共21页感谢您的观看！第21页/共21页