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1、纤维素酶纤维素酶 纤维素酶是一种纤维素酶是一种复合酶复合酶，一般认为它，一般认为它至少至少包括三种组分包括三种组分，即，即C C1 1酶酶(外切酶外切酶)、C CX X酶酶(内切酶内切酶)和葡萄糖苷酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖纤维二糖C C1 1酶、酶、CxCx酶酶葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维素纤维素第1页/共16页取二支取二支20mL20mL的试管的试管实验：纤维素酶分解纤维素的实验实验：纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入pH
2、4.8pH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液的醋酸醋酸钠缓冲液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在乙试管中加入在乙试管中加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1h1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？什么？第2页/共16页提示：提示：本实验的本实验的自变量是是纤维素酶的有无自变量的操纵方法是：在在一支试管中中添加适量（添
3、加适量（1mL1mL）的纤维素酶溶液）的纤维素酶溶液，另一支试管不添加纤维素酶，但需不添加纤维素酶，但需加加入等量的缓冲液入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的，不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的pHpH。实验分析：实验分析：P P2727的小实验是如何构成对照的小实验是如何构成对照的？的？第3页/共16页可根据是否可根据是否产生产生透明圈透明圈来筛选纤维来筛选纤维素分解菌素分解菌第4页/共16页培养基成分分析培养基成分分析培养基组成培养基组成提供主要的营养物质提供主要的营养物质纤维素粉纤维素粉 5g碳源（能源）碳源（能源）NaNO3 1g氮源、无机盐氮源、无机盐KCl 0.5g Na
4、2HPO47H2O 1.2gKH2PO4 0.9g MgSO4 7H2O 0.5g无机盐无机盐酵母膏酵母膏 0.5g生长因子、生长因子、氮源氮源、少量碳源少量碳源水解酵素水解酵素 0.5g氮素、生长因子氮素、生长因子溶解后，蒸馏水定容至溶解后，蒸馏水定容至1000mL水水第5页/共16页比较项目比较项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养基基原理原理培养基培养基类型类型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原理原理现象现象方法方法将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有尿素做氮源的选择尿素做氮源的选择培养基上培养基上将细菌涂布在只有将细菌涂布在只有纤维素粉做碳源的纤维素粉做碳源的
5、选择培养基上选择培养基上固体培养基固体培养基液体培养基液体培养基筛选菌株筛选菌株选择培养选择培养第6页/共16页思考：本实验的流程与课题思考：本实验的流程与课题2 2中的实验流程有哪些中的实验流程有哪些异同？异同？课题课题2 2是将土样制成的菌悬液直接涂布在是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得得到菌落。到菌落。本课题通过本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。骤基本一致。第7页/共16页按照课题
6、按照课题1 1的稀释操作方法，将选择培养后的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释的培养基进行等比稀释10101 110107 7倍。倍。3.3.梯度稀释梯度稀释101102103104105106第8页/共16页4.4.将样品涂布到将样品涂布到鉴别纤维素分解菌鉴别纤维素分解菌的培养的培养基上基上（1 1）制备鉴别培养基）制备鉴别培养基:（2 2）涂布平板：）涂布平板：将稀释度为将稀释度为10104 410106 6的菌悬液各取的菌悬液各取0.1ml0.1ml涂布到平板培养基上，涂布到平板培养基上，3030倒置培养。倒置培养。第9页/共16页培养基组成培养基组成提供的主要营养物质提供的
7、主要营养物质CMC-Na 510g碳源碳源酵母膏酵母膏 1g碳源碳源、氮源、生长因子、氮源、生长因子KH2PO4 0.25g无机盐无机盐土豆汁土豆汁 100mL碳源碳源、生长因子、生长因子琼脂琼脂 15g凝固剂凝固剂上述物质溶解后，加蒸馏上述物质溶解后，加蒸馏水定容至水定容至1000mL氢元素、氧元素氢元素、氧元素鉴别纤维素分解菌的培养基的培养基(水溶性羧甲基纤维素钠水溶性羧甲基纤维素钠)第10页/共16页方法一：先方法一：先 ，再加入刚果红进，再加入刚果红进行颜色反应。行颜色反应。方法二：在方法二：在 时就加入刚果红。时就加入刚果红。培养微生物培养微生物倒平板倒平板5.刚果红染色法 挑选产生
8、透明圈的菌落，一般即为分解挑选产生透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。纤维素的菌落。第11页/共16页这两种方法各有哪些优点与不足？这两种方法各有哪些优点与不足？染色法染色法染色法染色法优优优优点点点点缺点缺点缺点缺点方法一方法一方法一方法一方法二方法二方法二方法二颜色反应基本颜色反应基本上是纤维素分上是纤维素分解菌的作用解菌的作用操作繁琐操作繁琐刚果红会使菌落之间发生刚果红会使菌落之间发生混杂混杂操作简便不操作简便不存在菌落混存在菌落混杂问题杂问题1.1.产生淀粉酶的微生物也产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈产生模糊透明圈2.2.有些微生物能降解色素，有些微生物能降解色素，形成明显的透明
9、圈。形成明显的透明圈。第12页/共16页比较比较项目项目分解尿素的细菌分解尿素的细菌纤维素分解菌纤维素分解菌选选择择培培养养原理原理培养基类培养基类型型目的目的鉴鉴定定培培养养基基原原理理现现象象方方法法在细菌分解尿素的化学反应在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨，氨会使培养基分解成了氨，氨会使培养基的碱性增强，的碱性增强，pHpH升高。在培升高。在培养基中加入酚红指示剂，如养基中加入酚红指示剂，如果果pHpH升高指示剂会变红升高指示剂会变红刚果红可以与纤维素形成刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被红色复合物，当纤维素被纤维素酶催化分解后红
10、色纤维素酶催化分解后红色复合物无法形成，培养基复合物无法形成，培养基上就会出现以纤维素分解上就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈菌为中心的透明圈观察菌落周围是否有观察菌落周围是否有着色的环带出现来鉴定尿素分解菌带出现来鉴定尿素分解菌观察菌落周围是否出现观察菌落周围是否出现透明圈来筛选纤维素分解菌来筛选纤维素分解菌脲酶检测法脲酶检测法刚果红染色法刚果红染色法第13页/共16页 在在产生明显的透明圈产生明显的透明圈的菌落，挑取的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在在30300 0C C 37370 0C C培养，可获得培养，可获得纯化培养纯化培养。6 6、纯化培养、纯化培养第14页/共16页 为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_实实验，纤维素酶的发酵方法有验，纤维素酶的发酵方法有_ _ 发酵和发酵和_ _ 发酵。纤维素酶测定方法是对发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_ _ 含量进行定量测定。含量进行定量测定。发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶 液体液体 固体固体 葡萄糖葡萄糖 五、课题延伸五、课题延伸第15页/共16页感谢您的观看！第16页/共16页