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2、能源-利用工程化的大肠杆菌非发酵利用工程化的大肠杆菌非发酵利用工程化的大肠杆菌非发酵利用工程化的大肠杆菌非发酵代谢途径合成高级醇代谢途径合成高级醇代谢途径合成高级醇代谢途径合成高级醇李李 春春北京理工大学北京理工大学 生命学院生命学院 世界经济的现代化是建立在化石能源基础之上的，得益于石油、天然气、煤炭等化石能源的广泛投入和应用。然而，这些资源载体正在比人类设想还要快的速度迅速地接近枯竭。化石能源与原料链条的中断，必将导致世界经济危机和冲突的加剧，最终葬送现在市场经济！为了避免由于能源危机而引起的战争和冲突，维系经济发展，挽救人类社会，除了开发各种节能技术之外，太阳能、地热能、风能、海洋能、核
3、能及生物质能等存在于自然界中的能源的开发利用是解决能源危机的重要途径。汽油是与人类生产生活密切相关的液体燃料之一，是一种复杂的碳氢化合物混合物，主要有C4C12的各种直链、支链和环状烷类、芳香族化合物等组成，辛烷值为9199。醇类燃料是一种情结、可再生的能源，作为传统石化燃料的添加剂和替代品在世界范围内得到广泛应用。常温常压下为液态热值较石油燃料低辛烷值高汽化潜热高燃料自身含氧 当前在各种生物燃料中，乙醇（辛烷值129）燃料无疑已经成为替代汽油等液体燃料的焦点。与人争粮难以提纯腐蚀性&高吸湿性运输不便能量密度低 相比燃料乙醇，丁醇因为具有热值高、性能好、使用便捷等优势，已成为国际科学界和企业界
4、关注的焦点，被公认为生物燃料中的潜力股。丁醇的优势有：与乙醇相比，丁醇不易溶于水，不仅能做汽油的添加剂，还能单独作为常规引擎的燃料。丁醇的腐蚀性小。对汽油混合物中的水分不敏感，使用丁醇作为驱动能源无需改造输油管和发动机。丁醇是一种高能量生物燃料。通常当分子构成中含有甲基链或双键时，其辛烷值会增加，因此，支链的C4和C5醇类也可以作为汽油的替代物。如：异丁醇（2-甲基-1-丙醇）的性质与丁醇相似，但其辛烷值比丁醇高；异戊醇、异戊烯醇的辛烷值略高于90，且比丁醇的能源含量高；异辛烷等支链、短链烷类也是很好的汽油替代品。这些醇类理论上可以利用类异戊二烯代谢途径进行生物合成或 通过转化氨基酸来得到，但
5、是要对生物现有代谢途径进行大规 模改造，因此实现起来难度较大。此外，生物柴油具有更优越的辛烷值、高润滑性和低污染物排 放等优势，也是备受瞩目的替代能源。生物柴油也可以通过植物中的类异戊二烯途径来生产，线性或 环状单萜和倍半萜西也是生物柴油的来源。生物能源生物能源利用合成生利用合成生物学手段构建物学手段构建工程化菌株工程化菌株以粮食作物以粮食作物或动植物油或动植物油为原料为原料加剧粮食紧张局势过程能耗高无经济竞争力木质纤维素木质纤维素微生物燃料微生物燃料不与人争粮原料来源丰富能通过工程化手段构建新的生物合成途径Renewable raw materialsBiofuelsCell Factory
6、The production of advanced biofuels.Engineering of bacteria or yeast species through data-or synthetic-biology-driven techniques optimizes the production of advanced biofuels,such as butanol,farnesane and bisabolane from feedstocks(ideally non-food resources such as lignocellulosic biomass,greenhous
7、e gases and algal biomass).-Microbial engineering for the production of advanced biofuels,Jay D.Keasling,Nature 11478Metabolic pathways used for the production of alcohol-based biofuels.In blue,Clostridiums butanol pathway converts acetyl-CoA into butanol.In green,the 2-keto acid pathway produces is
8、obutanol from pyruvic acid.Metabolic pathways used for the production of isoprenoid-based biofuels.In blue is the mevalonate pathway and in green is the deoxyxylulose-5-phosphate(DXP)pathway.Metabolic pathways used for the production of fatty-acid-and polyketide-derived biofuels.The fatty-acid biosy
9、nthetic cycle is in red,the reversal of the-oxidation cycle is in green and polyketide synthase is in blue.In DNA,genes involved in the synthesis of fuel can be introduced at the desired numbers into the host genome.Promoter(black arrows)and terminator sequences(green pins)can be engineered to contr
10、ol transcription rates.In the translation process,ribozymes(hairpins)can be inserted into functional RNA segments between the genes and ribosome binding sites can be engineered to control transcription initiation rates.Synthetic protein scaffolds incorporated into the pathway spatially assemble enzy
11、mes to efficiently transfer intermediates from one enzyme to the next in the pathway,increasing metabolic flux.Biosensors can detect specific metabolites in the host and regulate either transcription or translation dynamically,and the production of intermediates.Cellular pumps transport the fuel out
12、side the cell.Synthetic biology tools are used to maximize the production of biofuels from hosts.尽管缺乏相应的模式生物，难以优化代谢途径，难以平衡工程微生物的氧化还原态，且酶的低活性、燃料的抑制效应和上游生物质处理步骤的副产品的存在等因素限制产量的提高，但开发低成本、高能效的将木质纤维素转化成燃料的方法仍然被提上了日程，成为目前研究的焦点。并取得了一些可喜的进展，一些潜在的生物能源合成途径在模式生物中得以表达，例如：合成异丙醇和丁醇的丁基梭菌（Clostriduim）基因在大肠杆菌中进行了表达；除
13、了在发酵期间产生乙醇，工程化的酿酒酵母也可利用氨基酸生成高级醇和酯；在大肠杆菌中表达3-甲基-1-丁醇；利用蓝细菌和水藻等生物合成生物柴油。合成代合成代谢途径的加入会破坏途径的加入会破坏细胞原有的代胞原有的代谢平衡，平衡，导致副致副产品的品的产生并降低目生并降低目标代代谢物的物的产量量ATP/ADP、NAD(P)+/NAD(P)H和和acyl-CoAs等全局等全局水平代水平代谢谢物影响和制物影响和制约约合成代合成代谢谢途径的表达量途径的表达量新途径也需要氨基酸、氧化还原辅助因子和能量，新途径也需要氨基酸、氧化还原辅助因子和能量，给细胞增加了新的负担给细胞增加了新的负担现存的问题为了预测新代谢途
14、径对细胞生长和产量的影响，研为了预测新代谢途径对细胞生长和产量的影响，研究者开发了许多代谢模型帮助代谢途径的优化和筛究者开发了许多代谢模型帮助代谢途径的优化和筛选，如大肠杆菌的生化模型和酿酒酵母的代谢模型，选，如大肠杆菌的生化模型和酿酒酵母的代谢模型，以及一些基因组水平的模型、随机模型等。以及一些基因组水平的模型、随机模型等。虽然由于模型参数的不确定性，很多模型的解空间都比较大，然而这些模型仍然取得了一些重要的成果。例如：大肠杆菌在不同碳源下进化时，预测其表型空间；预测高通量的网络拓扑结构；在利用 Pichia stipitis 的木糖还原酶（xylose reductase,Xylp)和木糖
15、醇脱氢酶（xylitol dehydrogenase,Xyl2p)编码基因对酿酒酵母进行工程化使其能够利用木糖合成乙醇时，在代谢模型分析的建议下，移除依赖于NADP+谷氨酸脱氢酶GDH1和过表达依赖于NAD+的GDH2，增加了乙醇的产量并降低了副产品的合成；利用基因组模型指导在酿酒酵母中插入甘油三磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases）基因使甘油副产品的量降低了58%、木糖醇副产品的量降低了33%，而乙醇的产量却提高了24%。利用工程化的大肠杆菌非发酵代谢途径利用工程化的大肠杆菌非发酵代谢途径利用工程化的大肠杆菌非发酵代谢途径利用工程化的
16、大肠杆菌非发酵代谢途径合成高级醇实例合成高级醇实例合成高级醇实例合成高级醇实例u作者设计了新的合成方法，以产生2-甲基-1-丁醇及3-甲基-1-丁醇等长链醇作为下一代生物燃料。u为了避免异源代谢途径的引入所引起的代谢失衡，防止具有细胞毒性的异源代谢物的过量积累，作者充分利用大肠杆菌现有的代谢能力结合取自其他生物的2-酮酮酸酸（2-keto acid）降降解解 Ehrlich 途径的最后两步代谢相关基因，以达到高产异源目标产物的目的。Production of higher alcohols through the synthetic non-fermentative pathways.a,Va
17、rious 2-keto acid precursors lead to corresponding alcohols through 2-ketoacid decarboxylase and alcoholdehydrogenase.2-酮酸是氨基酸合成途径的中间物质，能够被2-酮酸脱羧酶（2-keto-acid decarboxylases，KDC）转化成醛，继而被醇脱氢酶（alcohol dehydrogenases，ADH）转化成醇。采用这种策略，仅需两步异源代谢步骤即可将氨基酸生物合成的中间代谢物 分流出来生产醇类。氨基酸的生物合成途径能够产生多种2-酮酸，作者利用了其中的6种：（1
18、）异亮氨酸生物合成途径产生的2-酮丁酸（2-ketobutyrate）和2-酮-3-甲基戊酸（2-keto-3-methyl-valerate）可以被分别转化成1-丙醇和2-甲基-1-丁醇。（2）缬氨酸生物合成途径产生的2-酮-异戊酸（2-keto-isovalerate）可以作为异丁醇的前体物质。（3）亮氨酸生物合成途径产生的2-酮-4甲基-戊酸是3-甲基-1-丁醇的底物。（4）苯丙氨酸生物合成途径产生的苯丙酮酸（phenylpyruvate）可用于合成2-苯乙醇。（5）正缬氨酸生物合成途径是亮氨酸合成的副反应，产生1-丁醇和2-酮戊酸的底物。Production of higher alc
19、ohols through the synthetic non-fermentative pathways.b,The synthetic networks for the non-fermentative alcohol.主要工作1、检验酶的活性和转化能力 在醇类合成的过程中，KDC是关键酶。为了检验大肠杆菌中不同KDC的活性和对内源2-酮酸底物的转化能力，除了过表达酵母菌的醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase 2，Adh2)，确保将醛转化成醇外，还要过表达5中KDC，分别是：酿酒酵母的KDC（Pdc6、Aro10、Thi3）；乳酸乳球菌的Kivd；丙酮丁醇梭菌的Pdc。.G
20、C-MS分析表明：表达Kivd和Aro10的大肠杆菌能够产生所期望的醇类，Thi3无任何活性，Pdc6和Pdc介于中间。Kivd是活性最强、功能最全的脱羧酶，将其选作后续实验的KDC酶。2、提高中间代谢物2-酮酸的表达量 为了获得最高的代谢物表达量，需要对异源代谢途径进行修饰，协调相关基因的表达。本例中2-酮酸是关键的中间代谢物，提高2-酮酸的表达量有利于提高目标醇的产量。为此：（1）利用PLlacO1 启动子控制 ilvIHCD 基因并使其过表达以加强2-酮异戊酸的生物合成。将 ilv 途经与 Kivd 和 Adh2 的醇类合成途经相结合，生产异丁醇。结果表明，过表达ilvIHCD 的菌株产
21、异丁醇的量为23mM，比普通菌株的产量提高了将近5倍。.（2）为进一步提高异丁醇的产量，将 adhE、ldhA、frdAB、fnr 和 pta等对合成副产品有关的基因删除，降低丙酮酸的不必要消耗，提高 ilvIHCD 代谢通路所需的丙酮酸水平，异丁醇的产量提高到了30mM。.（3）为提高异丁醇的转化效率，用取自 Bacillus subtilis 的 alsS 基因代替大肠杆菌的 ilvIH 基因。alsS 基因对丙酮酸具有高亲和性，而 ilvIH 基因却对2-酮丁酸具有高亲和性。具有 alsS 代谢通路的菌株的异丁醇产量又提高约1.7倍，为50mM。（4）删除 pflB 基因，进一步降低对丙
22、酮酸的竞争。所有这些措施使得在微好氧条件下，异丁醇的最终产量可达到300mM（22g/L）。在40-120h，异丁醇的产量为0.35g/g葡萄糖，达到理论最大值的86%。作为对照试验，在无葡萄糖培养的情况下，此菌株产生的异丁醇却几乎可以忽略不计。3、生物合成1-丁醇 某些梭菌在发酵生长阶段能够产生 1-丁醇，其合成途径中许多酶对氧非常敏感且依赖于辅酶A。在无 1-丁醇发酵代谢途径的大肠杆菌中过表达 Kivd 或 Aro10，则在非发酵生长阶段，大肠杆菌能能够表达少量的1-丁醇，说明在细胞内有2-酮酸的前体（2-酮戊酸）存在。而对于大肠杆菌而言，2-酮戊酸并不是常见的代谢物。为了提高合成 2-酮
23、戊酸的量而提高 1-丁醇的产量，研究者引入了具有广泛底物特异性的 leuABCD 途径，其中的底物之一即是 2-酮戊酸。作者尝试利用2-酮丁酸（2-ketobutyrate)通过类似亮氨酸生物合成的步骤来合成2-酮异戊酸。ilvA 基因编码的苏氨酸脱水酶（threonine dehydratase）能够将 L-苏氨酸转化成 2-酮丁酸，或者采用 Leptospira interrogans 和 Methanocaldococcus jannaschii 的中间代谢途径获得 2-酮丁酸。后者可以通过异丙基苹果酸异构酶（isopropylmalate isomerase，LeuCD）和 -异丙基苹
24、果酸脱氢酶（-isopropylmalate dehydrogenase，LeuB）将甲基苹果酸（citramalate）转化成 2-酮丁酸。为了产生 1-丁醇，研究者构建了由 PLlaceO1 启动子控制的编码 ilvA-leuABCD 代谢途径的操纵子。试验结果表明，具有 ilvA-leuABCD 途径的菌株能够产生0.6mM的 1-丁醇，是非过表达此途径的菌株产量的3倍。可以通过以下途径进一步提高1-丁醇产量：（1）采用高表达L-苏氨酸的大肠杆菌菌株；（2）将 ilvD 基因删除；（3）提高 leuABCD 向 2-酮丁酸的代谢途径活性、提高 Kivd 对 2-酮戊酸的特异性。4、提高大
25、肠杆菌对异源高级醇类的耐受性 相对于1-丁醇而言，异丁醇对大肠杆菌的毒性要小些。为了使大肠杆菌能够更好低生产高级醇，必须提高其对高级醇毒性的抵抗能力。为此，研究者更换不同的培养基，发现在更换了5次异丁醇浓度不断增加的培养基后，野生型大肠杆菌JCL16发生了突变，异丁醇耐受性从1.5%（w/v）提高到了2.0%（w/v）。这一耐受性已经能够与1-丁醇内源宿主的耐受性相匹敌。Effect of isobutanol on growth.a,Wild type strain,Blue triangle:without isobutanol;green diamond:with isobutanol；
26、b,High tolerant mutant,Orange square:without isobutanol;Red circle:with isobutanol.该策略开辟了一个生物燃料生产的未知领域 充分利用了氨基酸合成途径的中间代谢物 避开了常用的辅酶A介导的化学合成 并且可以在更大规模上合成其他高级、复杂的醇类 这一方法还可用于酵母等工程微生物中，具有非常广泛的开发和应用前景。uTo demonstrate how one might engineer and coordinate all of the necessary components for a biomass-degra
27、ding,hydrocarbon-producing microorganism,the author engineered a microorganism nave to both processes,Escherichia coli,to grow using both the cellulose and hemicellulose fractions of several types of plant biomass pretreated with ionic liquids.Consolidated bioprocessing of plant biomass into biofuel
28、s by E.coli.(A)Gene schematics for the pCellulose and pXylan plasmids.Engineered E.coli grows on model cellulosic substrates and IL-treated plant biomass.(B)Growth of strain expressing either Cel3A or OsmY-Cel alone,or containing the pCellulose plasmid.(C)Growth of strain s expressing either Gly43F
29、or OsmY-XynB alone,or bearing pXylan.(D)Growth on the cellulose and hemicellulose fraction s of IL-treated switchgrass.Conversion of IL-treated switchgrass into advanced biofuels.(A)Gene schematics of plasmids encoding biofuel production pathwaysProduction of fatty-acid ethyl esters(B),butanol(C),and pinene(D)from IL-treated switchgrass by cocultures of cellulose-and xylan-consuming E.coli.