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1、微量中和实验齐立第1页，共32页，编辑于2022年，星期六采集临床标本采集急性期和恢复期双份血清快速诊断病毒分离RT-PCRHAI或微量中和实验微量中和实验试剂盒（MDCK或EGG）测序CPE+HA+HAI(WHOFLUH5KIT)直接进行抗原检测疫情爆发第2页，共32页，编辑于2022年，星期六微量中和实验的优势一、传统的流感病毒中和实验主要基于对MDCK细胞病变抑制作用观察，即费时又费力。结合感染细胞快速鉴定方法，改进后的中和实验可以在两天内完成，并可一次测定大量血清样品二、微量中和试验技术已被成功应用于检测血清中抗流感病毒甲5型抗体，并可以推广用于检测血清中其它抗禽流感病毒亚型中和抗体水
2、平，其敏感性高于血凝抑制试验。三、由于人群中缺乏抗禽流感病毒特异性抗体，因此，检测单份血清即可反映人群的免疫状态。但是当诊断可疑病患时，则需要同时检测急性期和恢复期双份血清中的中和抗体滴度，若恢复期血清抗体水平高于急性期（4倍）即可确立诊断。第3页，共32页，编辑于2022年，星期六实验原理1抗原抗体之间的中和反应1：20DILUTION1：40DILUTION1：80DILUTION1：160DILUTIONHA抗原血清中的中和抗体第4页，共32页，编辑于2022年，星期六2ELISA的实验原理MDCK细胞中的病毒核蛋白（NP）抗原NP-AG鼠抗流感病毒甲型核蛋白单克隆抗体NP-AB病毒核蛋
3、白抗原-核蛋白单克隆抗体复合物辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IGG磷苯二胺第5页，共32页，编辑于2022年，星期六实验材料一、中和反应的实验材料（一）病毒（一）病毒1）当使用甲5型病毒时，9-10日龄的SPF胚较好，一般在37培养26-28小时会得到较高的滴度，一般血凝滴度在128以上方可用于中和实验2）冻存的病毒不能重复使用3）进行中和实验前，需先进行病毒滴定（TCID50）的滴定进行病毒定量第6页，共32页，编辑于2022年，星期六（二）血清样品（二）血清样品1）收到的被检血清要分装多份，冻存于-20，一般不要反复冻融3次以上。2）血清样品包括待检血清和阳性以及阴性对照血清，人血清实验前需5
4、6灭活30分钟分钟，动物血清需要RDE处理分装，去除非特异性抑制因素。（三）（三）MDCK细胞和细胞培养试剂细胞和细胞培养试剂1）MDCK细胞（狗肾上皮细胞）早代的细胞（10代）以及处于对数生长期的细胞对病毒感染具有最大的敏感性（在细胞培养皿中70%-90%）成片2）细胞培养液DMEM牛血清抗生素3）用于细胞消化的胰酶和VERSON第7页，共32页，编辑于2022年，星期六二ELISA实验材料1,抗体1鼠抗流感病毒甲型核蛋白单克隆抗体2.抗体2:辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IGG3.洗涤液:PBS+0.05%TWEEN-204.封闭液:PBS+1%牛血清白蛋白+0.05%TWEEN-205.底物
5、和底物溶液:常用的辣根过氧化物酶(HRP)所用的底物为磷苯二胺(OPD)底物溶液为PH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液6.终止反应液第8页，共32页，编辑于2022年，星期六质量控制病毒中和实验技术是一个相当复杂的过程，参与中和反应的因素有病毒、抗血清和宿主细胞病毒、抗血清和宿主细胞，这些因素的变化都会影响中和试验的结果。因此，须对中和试验的整个过程进行严格的质量控制，每次测定必须设立阳性和阴性血清对阳性和阴性血清对照，阳性和阴性细胞对照，以及对病毒使用剂量进行滴定照，阳性和阴性细胞对照，以及对病毒使用剂量进行滴定 第9页，共32页，编辑于2022年，星期六一一血清对照血清对照血清对照包括人或动物血
6、清阳性和阴性对照。即血清中含有（阳性对照）或不含有（阴性对照）对测定病毒特异性的中和抗体。血清对照一般分装成多份，-20保存，并避免反复冻融使用。1阴性血清对照（1）动物血清一般来自未免疫或未感染动物，即与待检血清同种动物的正常血清。（2）人血清一般来自与待检血清年龄相同的正常人群，该人群未暴露于待检病毒。（3）测定过程中，阴性对照血清与待检血清应处于相同稀释水平。2阳性血清对照（1）动物血清一般来自免疫后或感染后动物。（2）人血清一般采用急性期和恢复期双份血清做对照。*人血清使用前须经加热灭活处理，动物血清则须经霍乱滤液RDE（即受体破坏酶）处理，以排除非特异性反应因素。第10页，共32页，
7、编辑于2022年，星期六二二病毒和细胞对照病毒和细胞对照每次试验必须设立阳性和阴性细胞对照，以及对加入病毒工作液进行滴定检查，以便获得准确可靠的实验结果。第11页，共32页，编辑于2022年，星期六BCDEFGHl细l胞l对l照l病l毒l对l照回滴A血清阴性对照血清阳性对照12345678910 11 12质量控制质量控制第12页，共32页，编辑于2022年，星期六实验步骤该该实实验验分分为为三三个个步步骤骤：（1）病病毒毒滴滴定定（2）病病毒毒中中和和试试验验（3）酶酶联联免免疫疫吸吸附附实验（实验（ELISA）。）。一一病毒滴度测定（组织培养半数感染量病毒滴度测定（组织培养半数感染量TCI
8、D50滴定）滴定）（一）流感病毒制备利用鸡胚尿囊腔接种法制备流感病毒，收获尿囊液，血凝试验测定病毒的存在，分装后-70冻存。（二）病毒的稀释1取1管冻存病毒尿囊液，1：100稀释（100微升病毒液+9.9毫升稀释液）第1排加入146微升1：100稀释过的病毒液，然后做系列半对数稀释，使之成10-2、10-2.5、10-3、10-3.510-7。每孔含100微升病毒液，每个稀释度重复4孔。（三）MDCK细胞的准备1用病毒稀释液将细胞稀释成1.5X105细胞/毫升。2加100微升细胞（1.5X104细胞/孔）于已稀释好病毒的微量培养板中。3在375%CO2温箱中培养18-22小时。l第13页，共3
9、2页，编辑于2022年，星期六l-BCDEFGH加入146ul病毒稀释液46ul46ul46ul46ul46ul46ul46ul46ul46ul46ul弃掉46ul-TPCK-trypsin+TPCK-trypsin无病毒的稀释液A123456789101211病毒TCID50滴定方法第14页，共32页，编辑于2022年，星期六（一）测定组织细胞半数感染剂量（TCID50）1弃去微量培养板中的细胞液，250微升PBS洗细胞一次。2弃去PBS（不要让细胞干燥），加入100微升/孔固定液。3覆盖微量培养板，于室温固定细胞10分钟。4弃去固定液，让微量培养板室温干燥。5用ELISA检测细胞感染6利用
10、ELISA检测仪，于490纳米波长，测定每孔吸光度（OD）值，计数细胞阴性对照的平均OD值。7若含有不同稀释度病毒孔平均OD值是细胞阴性对照孔平均OD值的2倍以上，则判断为病毒生长阳性。8根据Reed和Muench方法对病毒滴度进行核算，最终获得TCID50/100微升。9在进行中和试验前，稀释病毒液，使之50微升中含有100TCID50流感病毒。第15页，共32页，编辑于2022年，星期六TCID50值的计算一般使用Reed-Muench方法计算。稀释（1）（2）（3）（4）（5）（6）阳性阴性阳性数阴性数比率%阳性数1044011011/11100104.540707/7100105313
11、13/475105.504050/501计算各病毒稀释度阳性孔数目（1）和阴性孔数目（2）2计算阳性和阴性孔的累积数：阳性孔累积数由下向上累积（3）；阴性孔累积数由上向下累积（4）3计算阳性孔的百分比：比率（5）=（3）/（3）+（4），（6）=（5）X1004计算距离比例距离比例=（大于50%的阳性百分比-50）/（大于50%的阳性百分比-小于50%的阳性百分比）=（75-50）/（75-0）=0.3第16页，共32页，编辑于2022年，星期六TCID50的对数=大于50%的阳性百分比的最高稀释稀释对数+距离比例X稀释系数的对数=5+0.3X0.5=5.15TCID50=10-5.15/10
12、0微升100TCID50/100微升=10-3.15100TCID50/50微升=10-3.15/2=10-3.15+0.3=10-2.8=1:631第17页，共32页，编辑于2022年，星期六1加入血清2倍稀释2加入病毒100TCID50/孔2h373加入细胞孔h37洗板固定特异性抗体流感病毒微量中和实验步骤流感病毒微量中和实验步骤第18页，共32页，编辑于2022年，星期六BCDEFGHl细l胞l对l照l病l毒l对l照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N123456789101112流感病毒微量中和实验设计流感病毒微量中和实验设计第19页，共32页，编辑于2022年，星期六9050
13、50505050505090909090 9090 9090905050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050 505050505050505050505050505050505050505050505010010050501005010050505050505050505050505050BCDEFGHl细l胞l对l照l病l毒l对l照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N12345678 9101112流感病毒微量中和实验加样方法流感病毒微量中和实验加样方法第20页，共32页，编辑于2022年
14、，星期六50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul弃掉50ul10050505050505050100100100100100100100 100100100 5050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505010010050501005010050505050505050505050505050BCDEFGHl细l胞l对l照l病l毒l对l照回滴血清A加入加入10UL血清血清,从从A1-A10SYDS
15、ADK/SINGX-49N1234567 89 1011 12加入100UL病毒到A11第21页，共32页，编辑于2022年，星期六5050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050505050 505050505050505050505050505050505050505050505010010050501005010050505050505050505050505050BCDEFGHl细l胞l对l照l病l毒l对l照回滴血清ASYDSADK/S
16、INGX-49N1234567891011122倍稀释后的情况A-1-A-111:1001:2001:4001:8001:16001:32001:64001:12800第22页，共32页，编辑于2022年，星期六100100100100100100100100100100100100 10010010010010050100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100 1005010
17、0100501001001005010010010010010010010050100100501001001001001001001005050100100100100100BCDEFGHl细l胞l对l照l病l毒l对l照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N1234567891011 12加加50UL(100TCID50)病毒于浅兰色孔病毒于浅兰色孔100TCID50502512.56310.5第23页，共32页，编辑于2022年，星期六100100100100100100100100100100100100 100100100100100100 1001001001001001001
18、00100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100 100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100100BCDEFGHl细l胞l对l照l病l毒l对l照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N123456789101112加加50UL稀释液于稀释液于A-11100TCI
19、D50502512.56310.52小时后小时后第24页，共32页，编辑于2022年，星期六200200200200200200200200200200200200200200200200200200 2002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002002
20、00200200200200200200200200200200200BCDEFGHl细l胞l对l照l病l毒l对l照回滴血清ASYDSADK/SINGX-49N123456789101112所有各孔均加入所有各孔均加入100ULMDCK细胞细胞(1.5104)培养培养18-22小时小时100TCID50502512.56310.51:2001:4001:8001:16001:32001:64001:128001:25600第25页，共32页，编辑于2022年，星期六中和实验结果判定0.712 0.7010.1120.0961.4531.7521.495.1.1360.9790.9710.792
21、1.4240.638 0.5670.0930.0950.0610.7600.9630.9430.8170.9400.7491.2950.9310.6810.0940.1050.9950.9930.9681.0400.9420.9510.5151.3210.7590.7320.1370.1010.9750.9661.1490.9250.8460.9250.3461.2290.8000.9860.1820.1741.0330.9971.0440.9250.9820.9650.1580.1020.7560.7250.4740.3560.9820.9750.9780.7510.8770.9100.09
22、80.1100.7390.7780.551 0.6280.9130.9450.9430.9230.7240.8490.1560.1230.9680.9580.9811.0591.1041.0940.9411.0791.0751.0110.1000.093SYDSASADK/SINGX-49NVCCC(+)1.33(-)0.1120032006400128002560040080016001)X=1.33-011/2+0.11=0.72(细胞半数感染域值）2）低于1.1的细胞孔判定为中和反应阳性中和反应阳性的血清最高稀释度即为血清中的中和抗体的滴度Y=OD（)2=0.22第26页，共32页，编辑
23、于2022年，星期六l0.1550.1280.2250.2562.0202.1222.2162.0841.6801.7211.5462.140l0.1300.1340.484 0.7021.8251.9121.9871.6781.6341.8841.4401.999lO.1530.1851.3061.1261.9661.9051.9811.8491.7761.8880.9292.078l0.2230.2021.8231.5861.8091.9321.9701.9111.9531.8210.6512.038l0.3640.4141.8461.7381.7642.1701.9051.9002.04
24、31.9670.6090.078l0.673 0.6941.7761.7851.7312.1452.0141.7121.7971.7230.4530.083l1.1771.2041.9891.6961.8461.9972.0191.7911.8561.8560.2420.092l1.7011.5311.7461.6231.7171.8511.9201.7201.7872.0280.1360.083(+)2.1(-)0.081)X=2.1-0.08/2+0.08=1.1(细胞半数感染域值）2）低于1.1的细胞孔判定为中和反应阳性中和反应阳性的血清最高稀释度即为血清中的中和抗体的滴度Y=OD（)2
25、=0.222004008001600320064001280025600SYDSASADK/SINGX-49NVCCC第27页，共32页，编辑于2022年，星期六操作中注意的事项1待检人血清需5630分钟灭活，动物血清需RDE处理。2待检血清需要重复测定时，应分装后冻存，以免反复冻融。3每管病毒只使用一次，若重复使用，或血清阳性对照结果过高或过低，以及细胞阳性对照OD值过低，须对病毒进行重新测定。4MDCK细胞应处于对数生长期，严禁细胞过度生长或老化（代数过高）。因此，必须在10代前进行细胞冻存，保存于液氮中备用。5牛血清有中和病毒感染力的作用。试验过程中切勿将细胞培养液与病毒稀释液混淆使用。
26、第28页，共32页，编辑于2022年，星期六6病毒与抗血清混合，常规采用37作用1小时，该试验采用37作用2小时，但针对不同耐热性的病毒，孵育温度和时间应有所增减。7在ELISA过程中，每步都要洗涤，以保证结果可靠。8选择合适的抗体稀释浓度，一般预先将不同稀释度的抗体以及酶结合抗体进行ELISA测定，以获得最佳稀释度。9正确控制显色时间，以降低背景染色。10.大量测定时，为稳定培养液的PH值，可用HEPES增加溶液的缓冲能力，减少PH变化对细胞的不利影响。11.在缺少病毒特异性抗体的情况下，可用细胞病变观察或检测微量培养板中每孔血凝活性来替代ELISA方法。但细胞培养时间一般须从18-22小时
27、增至2-4天。第29页，共32页，编辑于2022年，星期六总结总结一、病毒微量中和实验（第一天）（第一天）（一）实验设计取一96孔微量培养板，标记：细胞阳性和阴性对照孔，血清阳性和阴性对照孔，待检血清孔，以及病毒工作液滴定核实孔。（二）稀释病毒至100TCID50/50微升（三）血清和病毒2倍稀释1、以50微升/孔体积对血清做系列2倍稀释2、以50微升/孔体积，从100TCID50/50微升起对病毒进行2倍稀释（四）血清抗体和病毒中和反应1、加50微升病毒（含100TCID50）于倍比稀释血清孔和细胞阳性对照孔。2、于病毒核实孔加稀释液50微升/孔。摇匀病毒-血清混合物，放37温箱作用2小时。
28、（五）MDCK细胞的准备1、胰酶消化MDCK细胞，PBS洗二次以去除残余血清。2、在细胞计数板上对细胞进行计数，将细胞稀释成1.5105细胞/毫升3、加100UL细胞于96孔板中,37温箱孵育18-22小时第30页，共32页，编辑于2022年，星期六二酶联免疫吸附实验ELISA(第二天第二天)(一)细胞的固定1、弃去细胞液,250微升PBS洗细胞一次,弃去PBS2、加100微升/孔固定液(80%冷丙酮),室温固定细胞10分钟,弃去固定液,让扳子干燥(二)ELISA1、用洗涤液洗板2次，以去除残余丙酮2、加100UL最佳稀释的抗流感病毒核蛋白单克隆抗体，室温作用1小时，用洗涤液洗板3次，以去除未
29、结合抗体3、加100UL最佳稀释的HRP标记的羊抗鼠IGG，室温作用1小时，用洗涤液洗板4次4、每孔加100微升OPD底物，室温显色5-10分钟。加100微升1N硫酸终止反应5、在ELISA测定仪上（490）纳米读出每孔OD值。二、结果判定（一）中和实验质量的判定1、阳性细胞对照孔OD值在1.0左右，阴性细胞对照孔OD值小于0.22、病毒工作液滴度检测孔,上数3-5孔呈病毒感染阳性反应,显示使用的病毒量正常(二)病毒中和抗体滴度的计算1、每孔OD值低于细胞半数感染域值（X）时，判定为中和反应阳性X=（细胞阳性对照孔的平均OD值-细胞阴性对照孔的平均OD值）/2+细胞阴性对照平均OD值2、中和反应阳性孔的血清最高稀释度既血清中和抗体滴度。第31页，共32页，编辑于2022年，星期六Thankyou!第32页，共32页，编辑于2022年，星期六