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1、微生物检验授课讲稿1第1页，共55页，编辑于2022年，星期六l无菌室的质量管理无菌室的质量管理l菌种保存、复壮及管理菌种保存、复壮及管理l药品微生物限度检查方法药品微生物限度检查方法l药品微生物检查法的验证药品微生物检查法的验证2第2页，共55页，编辑于2022年，星期六无菌室的管理无菌室的管理l陈设尽量简单，仅放置必需用的仪器设备陈设尽量简单，仅放置必需用的仪器设备l无菌室应每周和每次操作前用无菌室应每周和每次操作前用0.1%0.1%新洁尔灭擦拭操作台及可能污染的死新洁尔灭擦拭操作台及可能污染的死角，室内无菌空气过滤器及紫外灯杀菌角，室内无菌空气过滤器及紫外灯杀菌1 1小时。小时。l人员：
2、肥皂洗手，人员：肥皂洗手，0.1%0.1%新洁尔灭洗手，换无菌服、鞋，进入。新洁尔灭洗手，换无菌服、鞋，进入。l操作必须符合无菌要求，穿好无菌服后，不能反复出入无菌间，手不能来回操作必须符合无菌要求，穿好无菌服后，不能反复出入无菌间，手不能来回出入操作台。出入操作台。l在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去空气湿气，用在每次操作完毕，同样用上述消毒溶液擦拭工作台面，除去空气湿气，用紫外灯杀菌半小时。紫外灯杀菌半小时。l非无菌室工作人员不得进入，对外来维修人员要进行监督。非无菌室工作人员不得进入，对外来维修人员要进行监督。l缓冲间不得放杂物、培养箱等。缓冲间不得放杂物、培养箱等。l
3、定期对门、窗、墙面等消毒。定期对门、窗、墙面等消毒。l定期检查洁净度情况。定期检查洁净度情况。3第3页，共55页，编辑于2022年，星期六l通常，实验室应划分成洁净或无菌区域和活菌操作区域，同时应根通常，实验室应划分成洁净或无菌区域和活菌操作区域，同时应根据试验目的，在时间或空间上有效分隔不相容的试验活动，将交叉据试验目的，在时间或空间上有效分隔不相容的试验活动，将交叉污染的风险降低到最低。污染的风险降低到最低。l一般情况下，药品微生物检验的实验室应有符合无菌检查法和一般情况下，药品微生物检验的实验室应有符合无菌检查法和微生物限度检查法要求的、用于具有开展无菌检查、微生物限微生物限度检查法要求
4、的、用于具有开展无菌检查、微生物限度检查、无菌采样等检测活动的、独立设置的洁净室（区）或度检查、无菌采样等检测活动的、独立设置的洁净室（区）或隔离系统，并为上述检验配备相应的细菌（真菌）等实验室、隔离系统，并为上述检验配备相应的细菌（真菌）等实验室、培养室、培养基及实验用具准备（包括灭菌）区、样品接收和培养室、培养基及实验用具准备（包括灭菌）区、样品接收和储藏区、标准菌株储藏区、污染物处理区和文档处理区等辅助储藏区、标准菌株储藏区、污染物处理区和文档处理区等辅助区域，同时，应对上述区域明确标识。区域，同时，应对上述区域明确标识。l实验室应对进出洁净区域的人和物建立控制程序和标准操作规实验室应对
5、进出洁净区域的人和物建立控制程序和标准操作规程，应按相关国家标准建立洁净室（区）和隔离系统的验证、程，应按相关国家标准建立洁净室（区）和隔离系统的验证、使用和清洁维护标准操作规程，对可能影响检测结果的工作使用和清洁维护标准操作规程，对可能影响检测结果的工作（如洁净度验证及监测、消毒、清洁维护等）能够有效地控制、（如洁净度验证及监测、消毒、清洁维护等）能够有效地控制、监测并记录。监测并记录。4第4页，共55页，编辑于2022年，星期六洁净度的要求洁净度的要求应应在在环环境境洁洁净净度度1000010000级级局局部部洁洁净净度度100100级级的的单单向流空气区域内进行。检验全过程必须无菌。向流
6、空气区域内进行。检验全过程必须无菌。工工作作台台面面及及环环境境应应定定期期按按医医药药工工业业洁洁净净室室（区区）悬悬浮浮粒粒子子、浮浮游游菌菌和和沉沉降降菌菌的的测测试试方方法法的的现现行行国国家家标准进行洁净度验证。标准进行洁净度验证。5第5页，共55页，编辑于2022年，星期六5 5个基本概念个基本概念 抑菌：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。抑菌：抑制体内或体外细菌的生长繁殖。防防腐腐：防防止止或或抑抑制制体体外外细细菌菌生生长长繁繁殖殖的的方方法法。细细菌菌一一般般不不死死亡亡。使使用用同一种化学药品在低浓度时为防腐剂，在高浓度时为消毒剂。同一种化学药品在低浓度时为防腐剂，在高浓度时为
7、消毒剂。消消毒毒：杀杀灭灭物物体体上上病病原原微微生生物物的的方方法法。并并不不一一定定杀杀死死含含芽芽孢孢的的细细菌菌或或非非病病原原微微生生物物。用用来来消消毒毒的的药药品品叫叫消消毒毒剂剂。一一般般消消毒毒剂剂在在常常用用浓浓度度下下只只对对细细菌菌的繁殖体有效，对其芽孢则需提高消毒剂的浓度和延长作用时间。的繁殖体有效，对其芽孢则需提高消毒剂的浓度和延长作用时间。无菌：不存在活菌。无菌：不存在活菌。灭灭菌菌：杀杀灭灭物物体体上上所所有有微微生生物物的的方方法法。比比消消毒毒要要求求高高，它它杀杀灭灭了了包包括括细菌芽孢在内的全部病原微生物和非病原微生物。细菌芽孢在内的全部病原微生物和非病
8、原微生物。6第6页，共55页，编辑于2022年，星期六灭菌和消毒的比较：灭菌和消毒的比较：共性：杀灭微生物以控制其污染和防止传染。共性：杀灭微生物以控制其污染和防止传染。区区别别：1 1、杀杀灭灭微微生生物物完完全全性性的的差差异异。灭灭菌菌要要求求完完全全杀杀灭灭微微生生物物，灭灭菌菌后后的的药药品品不不应应含含有有活活的的微微生生物物。而而消消毒毒不不完完全全杀杀灭灭微微生生物物，只只能能杀杀灭灭一一部部分分微微生生物物即即病病原原微微生生物物。这这是是相相对对的的。因因为为强强效效消消毒毒剂剂在在适适宜宜条条件件下下可可能能达达到到灭灭菌菌效效果果；不不适适宜宜条条件件下下灭灭菌菌，有有
9、不不完完全全杀杀灭微生物的可能。灭微生物的可能。2 2、方方法法上上的的差差异异：灭灭菌菌方方法法具具有有多多样样性性，消消毒毒常常借借化化学学物物质。质。3 3、效效果果检检查查的的差差异异：灭灭菌菌效效果果用用无无菌菌检检查查法法检检测测，而而消消毒毒效效果以消毒剂的效价评定。果以消毒剂的效价评定。7第7页，共55页，编辑于2022年，星期六常用的消毒剂常用的消毒剂洁净室（区）常用的消毒剂洁净室（区）常用的消毒剂 甲甲醛醛薰薰蒸蒸（作作用用机机制制：阻阻抑抑菌菌细细胞胞核核蛋蛋白白质质合合成成。甲甲醛醛是是一一种种常常用用的的杀杀细细菌菌和和杀杀真真菌菌剂剂。市市售售的的福福尔尔马马林林溶
10、溶液液就就是是373740%40%的的甲甲醛醛水水溶溶液液。常常用用于于保保存存动动物物标标本本，也也可可以以作作气气体体熏熏蒸蒸和和液液体体消消毒毒。甲甲醛醛有有挥挥发发性性，对对眼眼睛睛、皮皮肤肤有有刺刺激激性性，引引起皮肤硬化或皱褶，不宜做皮肤消毒用。）起皮肤硬化或皱褶，不宜做皮肤消毒用。）0.1%0.1%新新洁洁尔尔灭灭溶溶液液(作作用用机机制制：使使蛋蛋白白质质变变性性，破破坏坏细细胞胞膜。膜。)75%75%酒酒精精溶溶液液（常常用用于于皮皮肤肤消消毒毒。能能迅迅速速杀杀死死细细菌菌繁繁殖殖体体，对一般病毒有一定的消毒作用。）对一般病毒有一定的消毒作用。）5%5%来苏水来苏水(甲酚皂
11、甲酚皂)溶液（作用机制：损伤细胞膜溶液（作用机制：损伤细胞膜 ）8第8页，共55页，编辑于2022年，星期六灭菌的方法灭菌的方法1 1、热力灭菌：、热力灭菌：主主要要是是利利用用高高温温的的致致死死作作用用，使使微微生生物物的的蛋蛋白白质质和和核核酸酸等等重重要要生生物物高高分分子子发生变性、破坏，而导致细胞死亡。发生变性、破坏，而导致细胞死亡。分为分为干热灭菌与湿热灭菌干热灭菌与湿热灭菌(1)(1)干热灭菌：灼烧与火焰灭菌干热灭菌：灼烧与火焰灭菌 、干烤灭菌、干烤灭菌 灼灼烧烧主主要要用用于于接接种种工工具具灭灭菌菌，如如接接种种针针、接接种种环环、刀刀、剪剪等等在在火火焰焰上上烧烧灼即可达
12、到彻底灭菌。灼即可达到彻底灭菌。火火焰焰灭灭菌菌是是在在无无菌菌操操作作中中，将将试试管管口口、玻玻璃璃瓶瓶口口、硅硅氟氟塑塑料料塞塞等等反反复复通通过过火火焰焰数数次次，利利用用火火焰焰对对管管口口等等进进行行灭灭菌菌，防防止止管管口口污污染染，作作为为无无菌菌操操作作过过程中的辅助灭菌手段。程中的辅助灭菌手段。干烤灭菌干烤灭菌是利用热辐射及干热空气进行灭菌。是利用热辐射及干热空气进行灭菌。9第9页，共55页，编辑于2022年，星期六2)2)湿热灭菌法：通过热蒸汽或沸水使细菌蛋白质变性而杀灭微生物的方法。湿热灭菌法：通过热蒸汽或沸水使细菌蛋白质变性而杀灭微生物的方法。包括：煮沸灭菌、流通蒸汽
13、灭菌、高压蒸汽灭菌包括：煮沸灭菌、流通蒸汽灭菌、高压蒸汽灭菌煮煮沸沸灭灭菌菌：加加热热使使水水至至沸沸而而杀杀灭灭细细菌菌的的方方法法。凡凡不不适适于于高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌的的物品可常压下在水中煮沸一段时间达到灭菌目的。物品可常压下在水中煮沸一段时间达到灭菌目的。流流通通蒸蒸汽汽灭灭菌菌：常常压压下下，用用蒸蒸笼笼、蒸蒸锅锅等等在在100100灭灭菌菌。仅仅可可杀杀死死细细菌菌繁繁殖体，不能完全杀灭芽孢。殖体，不能完全杀灭芽孢。高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌：通通过过加加压压提提高高蒸蒸汽汽温温度度，用用高高压压蒸蒸汽汽灭灭菌菌，穿穿透透力力强强、温度高、灭菌效果最好。温度高、灭菌效果最好。是是
14、最最可可靠靠最最适适用用最最广广泛泛的的灭灭菌菌方方法法，凡凡耐耐高高温温和和潮潮湿湿的的物物品品可可应应用用本法灭菌。本法灭菌。注注意意事事项项：完完全全排排出出高高压压灭灭菌菌器器内内的的冷冷空空气气。（冷冷空空气气存存在在时时，同同一一表表压下所达到的温度值偏低，不符合规定的要求，灭菌就不彻底。压下所达到的温度值偏低，不符合规定的要求，灭菌就不彻底。)10第10页，共55页，编辑于2022年，星期六2 2、气体灭菌：利用化学消毒剂形成的气体来杀灭微生物。、气体灭菌：利用化学消毒剂形成的气体来杀灭微生物。臭氧杀菌消毒臭氧杀菌消毒 广广泛泛存存在在于于自自然然界界中中，雷雷雨雨过过后后的的空
15、空气气有有一一种种清清新新的的感感觉觉，是是因为空中放电产生臭氧，消灭了空气中的微生物，净化了空气。因为空中放电产生臭氧，消灭了空气中的微生物，净化了空气。臭臭氧氧具具有有强强烈烈的的杀杀菌菌消消毒毒作作用用。其其杀杀菌菌消消毒毒原原理理是是：臭臭氧氧在在常常温温、常常压压下下分分子子结结构构不不稳稳定定，很很快快自自行行分分解解成成氧氧和和单单个个氧氧分分子子，后后者者具具有有很很强强的的活活性性，对对细细菌菌具具有有很很强强的的氧氧化化作作用用，臭臭氧氧氧氧化化分分解解了了细细菌菌内内氧氧化化葡葡萄萄糖糖所所必必需需的的酶酶，从从而而破破坏坏其其细细胞胞膜膜，将将它它杀杀死死。多多余余的的
16、氧氧原原子子则则会会自自行行重重新新结结合合成成为为普普通通氧氧分分子子，不不存存在在任任何何有有毒毒残残留留物物，故故称称为为无无污污染染消消毒毒剂剂。不不但但对对各各种种细细菌菌（包包括括肝肝炎炎病病毒毒、大大肠肠杆杆菌菌、绿绿脓脓杆杆菌菌及及杂杂菌菌等等）有极强的杀灭能力，且对杀死霉菌也很有效。有极强的杀灭能力，且对杀死霉菌也很有效。11第11页，共55页，编辑于2022年，星期六3 3、辐射灭菌、辐射灭菌 （1 1）电离辐射）电离辐射:用引起电离的用引起电离的X X射线、射线、射线灭菌。射线灭菌。电电离离辐辐射射对对微微生生物物的的致致死死作作用用，主主要要是是细细胞胞内内生生物物化化
17、学学的的变化所致。变化所致。辐辐射射的的药药品品、食食品品的的安安全全问问题题：辐辐射射灭灭菌菌用用于于药药品品或或食食品品都都应应经经过过安安全全试试验验，完完全全有有必必要要进进行行科科学学全全面面的的评评价价，高高剂剂量量的的辐辐射射更更应慎重。应慎重。Co60Co60辐辐射射灭灭菌菌后后，被被辐辐射射物物质质的的温温度度升升高高很很少少，一一般般仅仅约约55，故，故Co60Co60辐射灭菌又称辐射灭菌又称“冷灭菌冷灭菌”。（2 2）电电磁磁波波辐辐射射（包包括括紫紫外外线线 波波长长190190350nm350nm、红红外外线线 波长波长0.770.771000m1000m、微波、微波
18、 波长波长1 11000mm1000mm）。）。12第12页，共55页，编辑于2022年，星期六紫外线灭菌紫外线灭菌1 1、紫紫外外线线辐辐射射的的穿穿透透力力很很弱弱，因因此此主主要要用用于于无无菌菌室室、某某些些工工作作区区的的空空气灭菌、物体表面灭菌。气灭菌、物体表面灭菌。2 2、实实践践工工作作中中在在无无菌菌室室无无菌菌柜柜净净化化工工作作台台工工作作室室及及车车间间安安装装紫紫外外灯灯，一一般般仅起杀死空气中部分微生物的作用，而不能起到完全灭菌的作用。仅起杀死空气中部分微生物的作用，而不能起到完全灭菌的作用。3 3、紫紫外外线线消消毒毒方方法法验验证证中中紫紫外外灯灯需需确确认认的
19、的参参数数主主要要有有紫紫外外线线的的波波长长、紫紫外外线线强强度、灯管的寿命。（度、灯管的寿命。（254nm254nm；90uw/90uw/;1000;1000小时）小时）4 4、紫紫外外灯灯消消毒毒的的效效果果与与紫紫外外线线强强度度、照照射射时时间间、温温度度与与湿湿度度等等因因素素有有关，还需通过验证来确定。关，还需通过验证来确定。5 5、注注意意事事项项：紫紫外外线线直直射射对对眼眼、皮皮肤肤有有损损害害。紫紫外外线线照照射射过过程程中中产产生生臭臭氧氧，臭臭氧氧过过多多对对眼眼及及鼻鼻腔腔有有刺刺激激，产产生生头头晕晕、胸胸闷闷、血血压压降降低低，所所以以无无菌菌室室及及净净化工作
20、台紫外线照射停止后，请稍等片刻，让臭氧消散，方可进行实验操作。化工作台紫外线照射停止后，请稍等片刻，让臭氧消散，方可进行实验操作。13第13页，共55页，编辑于2022年，星期六4 4、过过滤滤灭灭菌菌：以以物物理理的的方方法法除除去去介介质质中中的的微微生生物物。常常将将空空气气或或液液体体中中的的微微生生物物及及杂杂质质用用不不同同材材料料制制成成的的薄薄膜膜滤滤器器过过滤滤得得到到无无菌、无杂质的空气或液体。菌、无杂质的空气或液体。滤滤过过病病毒毒的的滤滤膜膜孔孔径径为为25 25 100100nmnm；滤滤过过细细菌菌的的滤滤膜膜孔孔径径为为0.220.220.45m0.45m。14第
21、14页，共55页，编辑于2022年，星期六l实验室在仪器设备完成相应的检定、校准、验证、确认其性能，并形实验室在仪器设备完成相应的检定、校准、验证、确认其性能，并形成相应的操作、维护和保养的标准操作规程后方可正式使用，使用要成相应的操作、维护和保养的标准操作规程后方可正式使用，使用要有记录。为保证设备处于良好工作状态，应定期维护和期间核查，并有记录。为保证设备处于良好工作状态，应定期维护和期间核查，并保存相关记录。保存相关记录。微生物实验室所用的仪器应根据日常使用的情况进行微生物实验室所用的仪器应根据日常使用的情况进行定期的校准，并记录。定期的校准，并记录。l校准的周期和校验的内容将根据仪器的
22、类型和设备在实验室产生的数据的校准的周期和校验的内容将根据仪器的类型和设备在实验室产生的数据的重要性的不同而不同。重要性的不同而不同。重要的仪器设备，如培养箱、冰箱等，应由专人重要的仪器设备，如培养箱、冰箱等，应由专人负责，保证其运行状态正常和受控，负责，保证其运行状态正常和受控，同时应有相应的备用设备以保证试验同时应有相应的备用设备以保证试验菌株和微生物培养的连续性；菌株和微生物培养的连续性；对于培养箱、冰箱、高压灭菌锅等影响实对于培养箱、冰箱、高压灭菌锅等影响实验准确性的关键设备应在其运行过程中对关键参数（如温度、压力）验准确性的关键设备应在其运行过程中对关键参数（如温度、压力）进行连续观
23、测和记录，进行连续观测和记录，有条件的情况下尽量使用自动记录装置。如果发生有条件的情况下尽量使用自动记录装置。如果发生偏差，应评估对以前的检测结果造成的影响并采取必要的纠正措施。对于一偏差，应评估对以前的检测结果造成的影响并采取必要的纠正措施。对于一些容易污染微生物的仪器设备如水浴锅、培养箱、冰箱和生物安全柜等应定些容易污染微生物的仪器设备如水浴锅、培养箱、冰箱和生物安全柜等应定期进行清洁和消毒。对试验需用的无菌器具应实施正确的清洗、灭菌措施，期进行清洁和消毒。对试验需用的无菌器具应实施正确的清洗、灭菌措施，并形成相应的标准操作规程，并形成相应的标准操作规程，无菌器具应有明确标识并与非无菌器具
24、加以无菌器具应有明确标识并与非无菌器具加以区别。区别。15第15页，共55页，编辑于2022年，星期六菌种保存、复壮及管理菌种保存、复壮及管理l保存原则保存原则l保存方法保存方法l复壮复壮l管理管理16第16页，共55页，编辑于2022年，星期六菌种的保存原则菌种的保存原则l挑选特征典型的纯菌菌落挑选特征典型的纯菌菌落l确定保存的合适菌体形态，凡能产生孢子或芽孢的微确定保存的合适菌体形态，凡能产生孢子或芽孢的微生物都用孢子或芽孢保存生物都用孢子或芽孢保存l选择最适宜的保存方法进行保存选择最适宜的保存方法进行保存l定期对保存的菌种进行检查定期对保存的菌种进行检查17第17页，共55页，编辑于20
25、22年，星期六菌种保存的常用方法菌种保存的常用方法l琼脂斜面低温保存法琼脂斜面低温保存法l甘油冷冻管保藏法甘油冷冻管保藏法l半固体琼脂斜面低温保存法半固体琼脂斜面低温保存法l液体石蜡保存法液体石蜡保存法l超低温保存法（菌种）超低温保存法（菌种）l砂土砂土18第18页，共55页，编辑于2022年，星期六1.1.琼脂斜面低温保存法琼脂斜面低温保存法（1 1）方方法法：将将经经常常使使用用的的菌菌种种的的典典型型菌菌落落接接种种在在斜斜面面（某某些些特特殊殊菌菌种种可可用用液液体体培培养养基基）上上，按按规规定定的的温温度度和和时时间间培培养养，待待充充分分生生长长后后，把把培培养养好好的的新新鲜鲜
26、菌菌种种用用牛牛皮皮纸纸保保好好，为为减减缓缓培培养养基基的的水水分分蒸蒸发发，延延长长保保藏藏时时间间，可可将将菌菌种种保保藏藏管管的的棉棉花花塞塞换换成成橡橡胶胶塞塞。放放在在44左左右右的的冰冰箱箱中中保保藏藏。每每隔隔 2-32-3个个月月移移种种一一次次，继继续续进进行行保保藏藏。若若用用半半固固体体高高层层培培养养基基穿穿刺刺培培养养，一一般般可可保保藏藏半半年年 至一年。有的甚至更长时间。至一年。有的甚至更长时间。（2 2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏（3 3）特点：）特点：优优点点是是简简便便，易易于于推推广广；一一般般不不需需要要另另选选
27、择择保保藏藏用用培培养养基基；对大多数微生物都适用。对大多数微生物都适用。缺点是缺点是保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。19第19页，共55页，编辑于2022年，星期六l l4 4 4 4）注意事项：）注意事项：）注意事项：）注意事项：l l保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。l l保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流
28、体硫乙醇酸盐培保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。养基。养基。养基。l l 必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。动或生霉，如有异常应及时处理。动或生霉，如有异常应及时处理。动或生霉，如有异常应及时处理。l l 每次移植后，应
29、与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。纯度无误后再继续保藏。纯度无误后再继续保藏。纯度无误后再继续保藏。l l 保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于 2%2%2%2%为宜，以免产酸过多，为宜，以免产酸过多，为宜，以免产酸过多，为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。影响菌
30、种存活。影响菌种存活。影响菌种存活。l l 铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。20第20页，共55页，编辑于2022年，星期六2 2 2 2、液体石蜡保存法：、液体石蜡保存法：本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生
31、理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。（1 1 1 1）方法：）方法：）方法：）方法：l l 将将将将菌菌菌菌种种种种接接接接种种种种于于于于斜斜斜斜面面面面或或或或穿穿穿穿刺刺刺刺于于于于0.3-0.3-0.3-0.3-0.5 0.5 0.5 0.5%琼琼琼琼脂脂脂脂半半半半固固固固体体体体高高高高层层层层培培培培养养养养基基基基中中中中，培培培培养好备用。养好备用。养好备用。养好备用。l l取取取取化化化化学学学学纯纯纯纯的的的的液液液液体体体体石石石石蜡蜡蜡蜡装
32、装装装在在在在试试试试管管管管中中中中，每每每每管管管管1015ml1015ml1015ml1015ml，加加加加棉棉棉棉塞塞塞塞，瓶瓶瓶瓶口口口口包包包包上上上上纸纸纸纸，121121121121高高高高压压压压灭灭灭灭菌菌菌菌30min30min30min30min，取取取取出出出出置置置置37373737温温温温箱箱箱箱或或或或 110 110 110 110 170 170 170 170 烤烤烤烤箱箱箱箱中中中中 1 2 h 1 2 h 1 2 h 1 2 h 或干燥器内除去液体石蜡中的水分或干燥器内除去液体石蜡中的水分或干燥器内除去液体石蜡中的水分或干燥器内除去液体石蜡中的水分l
33、l将将将将上上上上述述述述液液液液体体体体石石石石蜡蜡蜡蜡加加加加入入入入培培培培养养养养好好好好的的的的菌菌菌菌种种种种试试试试管管管管内内内内，液液液液体体体体石石石石蜡蜡蜡蜡液液液液面面面面以以以以高高高高出出出出培培培培养养养养基最上端基最上端基最上端基最上端 1 1 1 1 为宜，将试管直立，放入为宜，将试管直立，放入为宜，将试管直立，放入为宜，将试管直立，放入4444冰箱中保藏。冰箱中保藏。冰箱中保藏。冰箱中保藏。l l适适适适用用用用范范范范围围围围：适适适适用用用用于于于于保保保保藏藏藏藏部部部部分分分分霉霉霉霉菌菌菌菌，酵酵酵酵母母母母菌菌菌菌和和和和放放放放线线线线菌菌菌菌
34、，对对对对细细细细菌菌菌菌保保保保藏藏藏藏效果较差。效果较差。效果较差。效果较差。（3 3 3 3）特点：）特点：）特点：）特点：本本本本方方方方法法法法简简简简便便便便易易易易行行行行，是是是是实实实实验验验验室室室室常常常常用用用用的的的的一一一一种种种种保保保保藏藏藏藏方方方方法法法法，该该该该法法法法主主主主要要要要使使使使菌种与空气隔绝。菌种与空气隔绝。菌种与空气隔绝。菌种与空气隔绝。21第21页，共55页，编辑于2022年，星期六（4 4）注意事项：）注意事项：保保藏藏时时，用用新新鲜鲜培培养养物物接接种种，应应检检查查纯纯度度和和特特征征后后，方方可可进进行行保藏。保藏。保藏过程
35、中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥,需重新移种。需重新移种。使使用用菌菌种种时时，先先将将菌菌种种管管倾倾斜斜使使液液体体石石蜡蜡流流至至一一 边边，再再用用接接种种针针挑挑取取培培养养物物接接种种到到新新鲜鲜斜斜面面上上培培养养，待待长长出出新新培培养养物物后后，再再移移种种一一次到新斜面上次到新斜面上 即可使用。即可使用。将沾有少量液体石蜡的接种针浸于将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。液体石蜡在
36、菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面以高出斜面1 1 为宜。为宜。制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。中易造成污染。22第22页，共55页，编辑于2022年，星期六3 3 3 3、半固体琼脂培养基（、半固体琼脂培养基（、半固体琼脂培养基（、半固体琼脂培养基（0.5%0.5%0.5%
37、0.5%）4 4 4 4、40%40%40%40%甘油保存法：甘油保存法：甘油保存法：甘油保存法：23第23页，共55页，编辑于2022年，星期六菌种的复壮菌种的复壮l分离纯化：琼脂平板分离、单细胞（菌体或孢子）分离纯化：琼脂平板分离、单细胞（菌体或孢子）的分离的分离l通过宿主复壮通过宿主复壮l淘汰退化淘汰退化l理化因素诱变理化因素诱变24第24页，共55页，编辑于2022年，星期六沙门菌沙门菌SSSS琼脂平板琼脂平板大肠埃希菌大肠埃希菌EMBEMB琼脂平板琼脂平板25第25页，共55页，编辑于2022年，星期六铜铜铜铜绿绿绿绿假假假假单单单单胞胞胞胞菌菌菌菌溴化十六烷三甲铵琼脂培养基溴化十六
38、烷三甲铵琼脂培养基溴化十六烷三甲铵琼脂培养基溴化十六烷三甲铵琼脂培养基l金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌甘露醇氯化钠琼脂培养基甘露醇氯化钠琼脂培养基26第26页，共55页，编辑于2022年，星期六菌种的管理菌种的管理l专人管理，加锁保存在冰箱内，保存菌种的冰箱不得放置食品及易专人管理，加锁保存在冰箱内，保存菌种的冰箱不得放置食品及易挥发性试剂及有机溶媒等。挥发性试剂及有机溶媒等。l定期有专人按操作规程进行传代接种。并做纯度、特性等实验室所定期有专人按操作规程进行传代接种。并做纯度、特性等实验室所需关键诊断指标的确认，并记录；每支菌种都应适当标注，注明其需关键诊断指标的确认，并记录；每支菌种都应适当
39、标注，注明其名称、标准号、接种日期、所传代数；菌种生长的培养基和培养条名称、标准号、接种日期、所传代数；菌种生长的培养基和培养条件。件。l菌种定期检查，发现染菌及变异现象应及时报告，研究处理。菌种定期检查，发现染菌及变异现象应及时报告，研究处理。l实验菌种不得任意带出。实验菌种不得任意带出。l使用致病菌时应及时通知保管人员，用后必须及时处理。使用致病菌时应及时通知保管人员，用后必须及时处理。27第27页，共55页，编辑于2022年，星期六菌菌 种种金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)CMCC(B)26003(Staphylococcus aureus)CM
40、CC(B)26003铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B)10104(Pseudomonas aeruginosa)CMCC(B)10104生孢梭菌生孢梭菌(Clostridium sporogenes)CMCC(B)64941(Clostridium sporogenes)CMCC(B)64941白色念珠菌白色念珠菌(Candida albicans)CMCC(F)98001(Candida albicans)CMCC(F)98001黑曲霉黑曲霉(Aspergillus niger)CMCC(F)98003(Aspergillus niger)
41、CMCC(F)98003大肠埃希菌大肠埃希菌(Escherichia coli)CMCC(B)44102(Escherichia coli)CMCC(B)44102枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CMCC(B)63501(Bacillus subtilis)CMCC(B)63501乙型副伤寒沙门菌（乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi BSalmonella paratyphi B）CMCC(B)50094CMCC(B)5009428第28页，共55页，编辑于2022年，星期六菌液的制备（菌液的制备（1）l接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜接
42、种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤中，绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤中，30303535培养培养18-2418-24小时，取此培养液小时，取此培养液1ml1ml加加0.90.9无菌氯化钠溶液无菌氯化钠溶液9ml9ml，采用，采用1010倍递增稀释法，稀释至倍递增稀释法，稀释至1010-5-5 1010-7-7，使细，使细菌数约为菌数约为1010100cfu/ml100cfu/ml。29第29页，共55页，编辑于2022年，星期六菌液的制备（菌液的制备（2）l接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，丁培养基中，232328
43、28 培养培养18-2418-24小小时，取此培养物时，取此培养物1ml1ml加加0.90.9无菌氯化无菌氯化钠溶液钠溶液9ml9ml，采用，采用1010倍递增稀释法，稀倍递增稀释法，稀释至释至1010-5-5-10-10-7-7，使细菌数约为，使细菌数约为50-50-100cfu/ml100cfu/ml。30第30页，共55页，编辑于2022年，星期六菌液的制备（菌液的制备（3）l接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，斜面培养基上，23 2328 28 培养培养5 57 7天，天，加加3-5ml0.93-5ml0.9无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢无菌
44、氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸取出菌液，取子，吸取出菌液，取1 ml1 ml加加0.90.9无菌氯化无菌氯化钠溶液钠溶液9ml9ml，采用，采用1010倍递增稀释法，稀释至倍递增稀释法，稀释至1010-4-4-10-10-6-6，使细菌数约为，使细菌数约为5050100cfu/ml100cfu/ml。31第31页，共55页，编辑于2022年，星期六药品微生物限度检查方法药品微生物限度检查方法微生物限度检查法：检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料微生物限度检查法：检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。是判定药品受到微生物污染程受微生物污染程度的方法。是判定药品受到微生物污染程度的重要指
45、标，也是对生产企业的设备器具、工艺流程、度的重要指标，也是对生产企业的设备器具、工艺流程、生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据生产环境和操作者的卫生状况进行卫生学评价的综合依据之一。之一。药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料的药品的生产、贮存、销售过程中的检验，原料及辅料的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度检查均以本量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度检查均以本标准为依据。标准为依据。检查项目：细菌数、霉菌数、酵母菌数及检查项目：细菌数、霉菌数、酵母菌数及 控制菌的检查
46、。控制菌的检查。32第32页，共55页，编辑于2022年，星期六实验中的注意事项实验中的注意事项l培养基配制的注意事项：培养基配制的注意事项：l采用干燥培养基，按说明配制，灭菌后对培养基采用干燥培养基，按说明配制，灭菌后对培养基pHpH值进行校验。值进行校验。l配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后配制的培养基不应有沉淀，如有沉淀，应于溶化后趁热过滤，灭菌后使用。使用。l培培养养基基的的分分装装量量一一般般不不超超过过容容器器的的1/31/3，以以免免灭灭菌菌时时溢溢出出。包包装装时时，塞塞子子必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。必须塞紧，以免松动或脱落造成染菌。l培养基配
47、制后在培养基配制后在2h2h内灭菌，避免细菌繁殖，影响灭菌效果。内灭菌，避免细菌繁殖，影响灭菌效果。l灭菌后的培养基在冷暗处保存备用，放置时间不能过长，一般不超过灭菌后的培养基在冷暗处保存备用，放置时间不能过长，一般不超过1 1个月，倒好的碟子不过个月，倒好的碟子不过3 35 5天，以免水分散失及染菌。已熔化的培养基应天，以免水分散失及染菌。已熔化的培养基应一次用完，不能反复使用。一次用完，不能反复使用。l不不用用电电炉炉直直接接熔熔化化，以以免免局局部部过过热热营营养养成成份份被被破破坏坏。应应用用水水浴浴或或微微波波炉炉加热。加热。33第33页，共55页，编辑于2022年，星期六操作技术中
48、的注意事项操作技术中的注意事项l将物品一次准备完全，避免来回出入操作台、无菌室，全过程必须符合无菌技术将物品一次准备完全，避免来回出入操作台、无菌室，全过程必须符合无菌技术要求。要求。l不溶于水的样品，必须加乳化剂、助溶剂等溶解后操作不溶于水的样品，必须加乳化剂、助溶剂等溶解后操作 。l勿在乙醇灯焰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭。加完稀释剂后，试管塞就立即勿在乙醇灯焰正上方操作，以免灯焰将供试液中菌细胞杀灭。加完稀释剂后，试管塞就立即塞上。塞上。l快速吸管、吹打，不能用嘴吹吸，吸管内放棉花快速吸管、吹打，不能用嘴吹吸，吸管内放棉花l管尖不许接触可能污染的任何容器或用具管尖不许接触可能
49、污染的任何容器或用具l稀释时每一级换管（原吸管不要吹洗），上一级吸管不能接触下一级稀释液稀释时每一级换管（原吸管不要吹洗），上一级吸管不能接触下一级稀释液34第34页，共55页，编辑于2022年，星期六l取均匀供试液稀释、注平皿（特别注意研细）上清液和沉淀物影响测定结取均匀供试液稀释、注平皿（特别注意研细）上清液和沉淀物影响测定结果果l注平皿时，要求管内不残留溶液注平皿时，要求管内不残留溶液l3.33.3制最准确，即制最准确，即3 3级稀释，级稀释，3 3个平皿，但厂方也可根据自己品种选择个平皿，但厂方也可根据自己品种选择l培养基严格控制在培养基严格控制在451451，水浴。，水浴。l培养基摇
50、合快速、均匀，不要溅到皿边和皿盖上。培养基摇合快速、均匀，不要溅到皿边和皿盖上。l从稀释到倾注培养基全部操作在从稀释到倾注培养基全部操作在1 1小时内全部完成。小时内全部完成。35第35页，共55页，编辑于2022年，星期六结果判断的注意事项结果判断的注意事项l不要漏计细小的（可适当延长培养时间）、琼脂内和平皿不要漏计细小的（可适当延长培养时间）、琼脂内和平皿边缘生长的菌落。边缘生长的菌落。l注意细菌、酵母菌及霉菌的区别，以及菌落与药渣、培注意细菌、酵母菌及霉菌的区别，以及菌落与药渣、培养基沉淀、药物结晶的区别。养基沉淀、药物结晶的区别。l平均菌落在平均菌落在1515个以下时，二个平皿的菌落数