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1、实验三食品中蜡样芽孢杆菌的检验第1页，共31页，编辑于2022年，星期五（一）蜡样芽胞杆菌生物学性状（一）蜡样芽胞杆菌生物学性状 1 1、形态和染色特性、形态和染色特性 该菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽胞呈该菌为革兰氏阳性的大杆菌，菌体两端较平整，芽胞呈椭圆形，位于菌体中央稍偏一端椭圆形，位于菌体中央稍偏一端,多呈链状排列多呈链状排列,无荚膜，无荚膜，有周鞭毛有周鞭毛。第2页，共31页，编辑于2022年，星期五2 2、培养特性、培养特性 （1 1）需氧菌，生长温度范围在）需氧菌，生长温度范围在10-4510-45之间。最适之间。最适 生长温度为生长温度为28-3528-35。（2
2、2）在普通培养基上生长良好。）在普通培养基上生长良好。本菌在普通琼脂平板上，生长的本菌在普通琼脂平板上，生长的菌落呈乳白色，不透明，直径菌落呈乳白色，不透明，直径4-4-6mm,6mm,边缘不整齐，表面粗糙，呈边缘不整齐，表面粗糙，呈毛玻璃状或白蜡状。毛玻璃状或白蜡状。第3页，共31页，编辑于2022年，星期五（3 3）在血液琼脂平板上形成浅）在血液琼脂平板上形成浅灰色、不透明、似毛玻璃状的菌灰色、不透明、似毛玻璃状的菌落。落。菌落周围初呈草绿色溶血菌落周围初呈草绿色溶血,时间稍长即完全透明时间稍长即完全透明。（4 4）蜡状芽胞杆菌在甘露醇卵）蜡状芽胞杆菌在甘露醇卵黄多粘菌素琼脂黄多粘菌素琼脂
3、(MYP)(MYP)上的上的菌落为菌落为粉红色粉红色(表示不发酵甘露醇表示不发酵甘露醇)，周围有粉红色的晕（表示产生，周围有粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。卵磷脂酶）。第4页，共31页，编辑于2022年，星期五（5 5）在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常）在普通肉汤内生长迅速，肉汤混浊，常常有常有菌膜或壁环菌膜或壁环，振摇易乳化。，振摇易乳化。第5页，共31页，编辑于2022年，星期五3 3、生化性状：、生化性状：（1 1）葡萄糖发酵试验：接种于酚红葡萄糖肉汤中，）葡萄糖发酵试验：接种于酚红葡萄糖肉汤中，厌氧条件下厌氧条件下3535培养培养24h24h。培养基应由红色变。培养基应由红色变 为黄
4、色。为黄色。（2 2）硝酸盐还原试验：阳性（红色）。）硝酸盐还原试验：阳性（红色）。（表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸）（表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸）（3 3）V-PV-P试验：接种于改良试验：接种于改良V-PV-P培养基中，培养基中，3535 培养培养48 h48 h。加。加V-PV-P试剂及肌酸数粒，静止试剂及肌酸数粒，静止 1h1h，应为阳性反应（，应为阳性反应（伊红色伊红色）。）。第6页，共31页，编辑于2022年，星期五（4 4）L-L-酪氨酸分解试验：接种于酪氨酸分解试验：接种于L-L-酪氨酸琼脂培酪氨酸琼脂培 养基上，养基上，3535培养培养48 h,48 h,阳性反应
5、菌落周围培阳性反应菌落周围培 养基应出现澄清透明区（表示产生酪蛋白养基应出现澄清透明区（表示产生酪蛋白 酶）。阴性时应继续培养酶）。阴性时应继续培养72 h72 h再观察。再观察。（5 5）溶菌酶试验：用直径）溶菌酶试验：用直径2mm2mm接种环取纯菌悬液接种环取纯菌悬液 一环一环,接种于溶菌酶肉汤中，接种于溶菌酶肉汤中，3535培养培养24h24h。该菌在本培养基（含该菌在本培养基（含0.0010.001的溶菌酶）中能的溶菌酶）中能 生长。如出现阴性反应生长。如出现阴性反应,应继续培养应继续培养24 h24 h。第7页，共31页，编辑于2022年，星期五4 4、致病性、致病性 蜡样芽胞杆菌引
6、起食物中毒，除必须具有大量的细菌外，肠蜡样芽胞杆菌引起食物中毒，除必须具有大量的细菌外，肠毒素也是重要的致病因素。毒素也是重要的致病因素。耐热性肠毒素：耐热性肠毒素：1003010030分钟不能被破坏，为引起分钟不能被破坏，为引起呕吐呕吐 型型中毒的致病因素中毒的致病因素,常在米饭中形成。常在米饭中形成。不耐热肠毒素：是引起不耐热肠毒素：是引起腹泻型腹泻型胃肠炎的病因，能在各种胃肠炎的病因，能在各种 食物中形成。食物中形成。第8页，共31页，编辑于2022年，星期五5 5、抵抗力、抵抗力 蜡样芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌100 20100 20分钟即可被杀死；对酸碱不分钟即可被杀死；对酸碱不敏感，敏感
7、，pH6-11pH6-11对本菌基本上不受影响，对本菌基本上不受影响，pH5pH5以下，生长以下，生长可受到抑制。可受到抑制。第9页，共31页，编辑于2022年，星期五（二）流行病学特点（二）流行病学特点 1 1、季节性特点：、季节性特点：以夏、秋季，尤其是以夏、秋季，尤其是6 61010月为多见。月为多见。2 2、食品种类、食品种类剩饭，特别是大米饭。剩饭，特别是大米饭。乳及乳制品、畜禽肉类制品、蔬菜、莱汤、马铃薯、豆芽、甜乳及乳制品、畜禽肉类制品、蔬菜、莱汤、马铃薯、豆芽、甜点心、调味汁、色拉。点心、调味汁、色拉。国内：与淀粉质食品相关多。国内：与淀粉质食品相关多。第10页，共31页，编辑
8、于2022年，星期五3 3、临床症状、临床症状 呕吐型中毒呕吐型中毒：多见于过剩米饭和油炒饭，由耐热性肠毒素为致：多见于过剩米饭和油炒饭，由耐热性肠毒素为致病因素；潜伏期短，一般为病因素；潜伏期短，一般为2 23 3小时，最短为小时，最短为3030分钟，最长分钟，最长5 56 6小小时；症状以呕吐，腹痉挛为主，腹泻则少见，一般经过时；症状以呕吐，腹痉挛为主，腹泻则少见，一般经过8 81010小时而治愈。小时而治愈。腹泻型中毒腹泻型中毒：由各种食品中不耐热肠毒素引起，潜伏期在：由各种食品中不耐热肠毒素引起，潜伏期在6 6小小时以上，一般为时以上，一般为6 61414小时；症状以腹泻，腹痉挛，而呕
9、吐小时；症状以腹泻，腹痉挛，而呕吐却不常见；病程却不常见；病程24243636小时。小时。第11页，共31页，编辑于2022年，星期五1.蜡样芽孢杆菌检验程序：蜡样芽孢杆菌检验程序：检样25g(ml)+225ml生理盐水中华人民共和国国家标准中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验蜡食品卫生微生物学检验蜡样芽孢杆菌检验样芽孢杆菌检验GB/T GB/T 4789.28-20034789.28-2003做成10-1-10-5的稀释液选择性培养基（菌数测定）MYP选择性培养基（分离培养）MYP37，18h-24h菌数计算营养琼脂培养基36 112h20h36 112h20h生长及菌落观察染色镜检检
10、生化试验菌株保存报 告（三）检测方法（三）检测方法第12页，共31页，编辑于2022年，星期五10-110-5的的稀释液的制备稀释液的制备 每个稀释度每个稀释度0.1mL接种于接种于2个个MYP培养基培养基361 1220h 菌落计数菌落计数361 1220h 挑取菌落接种肉汤和营养琼脂培养基（分离培养）挑取菌落接种肉汤和营养琼脂培养基（分离培养）证实试验证实试验 报报 告告 形态观察形态观察染色镜检染色镜检培养特性培养特性 生化特性生化特性 生化分型生化分型 第13页，共31页，编辑于2022年，星期五 2 2菌数测定菌数测定以无菌操作将检样以无菌操作将检样25g25g或或25 ml25 m
11、l按菌落总数测定方式，用灭菌生理按菌落总数测定方式，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成盐水或磷酸盐缓冲液做成1010-1-11010-5-5的稀释液。取各稀释液的稀释液。取各稀释液0.1ml0.1ml，接种在选择培养基（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，接种在选择培养基（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，用用L L形棒涂布于整个表面，置形棒涂布于整个表面，置3737培养培养121220h20h后，选取菌落数在后，选取菌落数在3030个左右者进行计数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的个左右者进行计数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表示不发酵甘露醇）菌落为红色（表示不发酵甘露醇）,环绕有白色至
12、淡粉红色环绕有白色至淡粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。的晕（表示产生卵磷脂酶）。第14页，共31页，编辑于2022年，星期五计数后，从中挑取计数后，从中挑取5 5个这样的菌落作证实试验。根个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该培据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。第15页，共31页，编辑于2022年，星期五 计数后，从中挑取计数后，从中挑取5 5个此种菌落做证实试验，根据证实的蜡样芽孢个此种菌落
13、做证实试验，根据证实的蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该平板上的菌落数，然后乘其稀释倍数，即得杆菌的菌落数，计算出该平板上的菌落数，然后乘其稀释倍数，即得每克（毫升）样品中所含蜡样芽胞杆菌数。每克（毫升）样品中所含蜡样芽胞杆菌数。例如将例如将0.1mL 100.1mL 10-4-4样品稀释液涂布于样品稀释液涂布于MYPMYP平板上，其可疑菌落为平板上，其可疑菌落为2525个，取个，取5 5个鉴定，证实四个菌落为蜡样芽孢杆菌，则个鉴定，证实四个菌落为蜡样芽孢杆菌，则1g1g（mLmL）检样中）检样中所含蜡样芽孢杆菌数为：所含蜡样芽孢杆菌数为：选取具有选取具有15-15015-150个典型或可疑蜡样芽
14、孢杆菌菌落的平板个典型或可疑蜡样芽孢杆菌菌落的平板,进行计进行计数。计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。数。计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。254/510254/5104 410102102106 6第16页，共31页，编辑于2022年，星期五 3 3分离培养分离培养 将检样或其稀释液划线于上述选择性培养基平板上，置将检样或其稀释液划线于上述选择性培养基平板上，置3737培养培养121220h20h，挑取可疑蜡样芽孢杆菌的菌落接种，挑取可疑蜡样芽孢杆菌的菌落接种于于肉汤和营养琼脂培养基上肉汤和营养琼脂培养基上做纯培养，然后做证实试验。做纯培养，然后做证实试验。第17页，共31页，编辑于20
15、22年，星期五4 4证实试验证实试验（1 1）形态观察）形态观察本菌应为本菌应为G G杆菌，宽度在杆菌，宽度在1m1m或或1m1m以上，芽孢呈卵圆形，不以上，芽孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。（2 2）培养特性）培养特性本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，振摇易乳化。本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃状或琼脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。融蜡状且边缘不齐。第18页，共31页，编辑于2022年，星期五 （3 3）生化特性）生化特性本菌有动力；
16、产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；能液化明胶和还验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。第19页，共31页，编辑于2022年，星期五(4)(4)生化分型生化分型 根据蜡样芽孢杆菌对根据蜡样芽孢杆菌对柠檬酸盐利用、硝酸盐还柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、原、淀粉水解、V-PV-P反应、明胶液化的试验，反应、明胶液化的试验，分成不同型别，分成不同型别，见表见表1 1。第20页，共31页，编辑于2022年，星期五表表1 1 蜡样芽孢杆
17、菌生化分型蜡样芽孢杆菌生化分型型型别别生生 化化 试试 验验柠檬酸盐利用柠檬酸盐利用硝酸盐还原硝酸盐还原淀粉水解淀粉水解V-PV-P反应反应明胶液化明胶液化1 12 23 34 45 56 67 78 89 9101011111212131314141515第21页，共31页，编辑于2022年，星期五（4 4）与类似菌鉴别）与类似菌鉴别本菌与其他类似菌的鉴别见表本菌与其他类似菌的鉴别见表2 2。第22页，共31页，编辑于2022年，星期五 5.5.结果报告结果报告 报告报告1g1g（mLmL）检样中所含蜡样芽孢杆菌数量）检样中所含蜡样芽孢杆菌数量 个个/g(mL)/g(mL)。第23页，共31
18、页，编辑于2022年，星期五实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验实验三、食品中蜡样芽孢杆菌的检验一、实验目的一、实验目的1学习蜡样芽孢杆菌检验的原理和方法。学习蜡样芽孢杆菌检验的原理和方法。2了解蜡样芽孢杆菌形态特征、培养特性了解蜡样芽孢杆菌形态特征、培养特性和生化特性。和生化特性。第24页，共31页，编辑于2022年，星期五v蜡样芽孢杆菌为需氧、能产生芽孢的革兰氏阳性蜡样芽孢杆菌为需氧、能产生芽孢的革兰氏阳性杆菌，在自然界分布较广，食品在正常情况下就可杆菌，在自然界分布较广，食品在正常情况下就可能有此菌存在，因而易从各种食品中检出。蜡样芽能有此菌存在，因而易从各种食品中检出。蜡样芽孢杆菌能发酵麦
19、芽糖、蔗糖和水杨苷，不发酵乳糖、孢杆菌能发酵麦芽糖、蔗糖和水杨苷，不发酵乳糖、甘露醇、木糖、阿拉伯糖、山梨醇和侧金盏花醇甘露醇、木糖、阿拉伯糖、山梨醇和侧金盏花醇,卵卵磷脂酶和酪蛋白酶，过氧化氢酶试验阳性，溶血，磷脂酶和酪蛋白酶，过氧化氢酶试验阳性，溶血，能在能在24h 内液化明胶和还原硝酸盐，在厌氧条件下内液化明胶和还原硝酸盐，在厌氧条件下能发酵葡萄糖。能发酵葡萄糖。二、实验原理二、实验原理第25页，共31页，编辑于2022年，星期五三、实验方法与步骤三、实验方法与步骤1蜡样芽孢杆菌检验程序蜡样芽孢杆菌检验程序 第26页，共31页，编辑于2022年，星期五2菌数测定菌数测定以无菌操作将检样以
20、无菌操作将检样25g或或25 ml按菌落总数测定方式，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲按菌落总数测定方式，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成液做成10-110-5的稀释液。取各稀释液的稀释液。取各稀释液0.1ml，接种在选择培养基（甘露醇卵黄，接种在选择培养基（甘露醇卵黄多黏菌素琼脂）平板上，用多黏菌素琼脂）平板上，用L形棒涂布于整个表面，置形棒涂布于整个表面，置37培养培养1220h后，选后，选取菌落数在取菌落数在30个左右者进行计数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为个左右者进行计数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为红色（表示不发酵甘露醇）红色（表示不发酵甘露醇）,环绕有白色至淡粉红色的晕（
21、表示产生卵磷脂环绕有白色至淡粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。计数后，从中挑取酶）。计数后，从中挑取5个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数，计算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克杆菌的菌落数，计算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。第27页，共31页，编辑于2022年，星期五将检样或其稀释液划线于上述选择性培养将检样或其稀释液划线于上述选择性培养基平板上，置基平板上，置37培养培养1220h，挑取可疑，挑取可疑蜡样芽孢杆菌的
22、菌落接种于肉汤和营养琼脂蜡样芽孢杆菌的菌落接种于肉汤和营养琼脂培养基上做纯培养，然后做证实试验。培养基上做纯培养，然后做证实试验。3分离培养分离培养第28页，共31页，编辑于2022年，星期五（1）形态观察）形态观察本菌应为本菌应为G杆菌，宽度在杆菌，宽度在1m或或1m以上，芽以上，芽孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏孢呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。于一端。（2）培养特性）培养特性本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，振本菌在肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环，振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明，表摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。面粗糙，似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。4证实试验证实试验第29页，共31页，编辑于2022年，星期五（3）生化特性）生化特性本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶本菌有动力；产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；能液化明胶和试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；能液化明胶和还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。还原硝酸盐；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。第30页，共31页，编辑于2022年，星期五四、实验结果四、实验结果 根据以上实验作出检验报告。根据以上实验作出检验报告。第31页，共31页，编辑于2022年，星期五