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1、实验三动物性食品生物性污染的检验第1页，共18页，编辑于2022年，星期五一一.生物性污染的来源生物性污染的来源p微生物污染微生物污染 (microorganism(microorganism pollutionpollution)p寄生虫污染寄生虫污染 (parasitical pollution)(parasitical pollution)p昆虫污染昆虫污染 (insectical pollution)(insectical pollution)第2页，共18页，编辑于2022年，星期五第3页，共18页，编辑于2022年，星期五内源性污染内源性污染外源性污染外源性污染外源性生物性污染是动
2、物性食品微生物污染的主要途径外源性生物性污染是动物性食品微生物污染的主要途径第4页，共18页，编辑于2022年，星期五二二.生物性污染的评价指标生物性污染的评价指标菌落总数菌落总数细菌总数细菌总数大肠菌群值大肠菌群值（MPN）致病菌检测致病菌检测(PCR法法)其他其他第5页，共18页，编辑于2022年，星期五实验目的实验目的掌握动物性食品菌落总数、大肠菌群测定及常掌握动物性食品菌落总数、大肠菌群测定及常见致病菌见致病菌PCRPCR检测的原理、步骤和方法检测的原理、步骤和方法了解动物性食品菌落总数的卫生标准，进行卫了解动物性食品菌落总数的卫生标准，进行卫生判定生判定第6页，共18页，编辑于202
3、2年，星期五 1.1.鲜乳的微生物学检验鲜乳的微生物学检验菌落总数的测定菌落总数的测定检检 验验 处处 理理24 2h或或48 2h36 1 报报 告告菌落记数菌落记数每皿加入适量营养琼脂每皿加入适量营养琼脂选择选择3个适宜稀释度，吸取个适宜稀释度，吸取1ml加入灭菌平皿加入灭菌平皿作成几个倍数的稀释液作成几个倍数的稀释液第7页，共18页，编辑于2022年，星期五注注 意意 事事 项项无菌操作无菌操作稀释度的选择稀释度的选择平均菌落数在平均菌落数在30-30030-300之间的稀释度为宜；之间的稀释度为宜；每个稀释度作两个平皿每个稀释度作两个平皿记数要求记数要求30-30030-3003003
4、00 30 30300300或或 30 30第8页，共18页，编辑于2022年，星期五2.2.鲜乳大肠菌群值的测定鲜乳大肠菌群值的测定第9页，共18页，编辑于2022年，星期五报报 告告根据证实为大肠菌群阳性的管数，查根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPNMPN检索表，报告每检索表，报告每100mL(g)100mL(g)检样中大肠菌群的最可能数。检样中大肠菌群的最可能数。判定标准判定标准第10页，共18页，编辑于2022年，星期五3.常见致病菌的快速检测常见致病菌的快速检测 SE的的PCR检测检测原原 理理 以扩增的以扩增的DNADNA分子为模板，以一对分别与模板互补的分子为模板，以一对分别与
5、模板互补的寡核苷酸片段为引物，在寡核苷酸片段为引物，在DNADNA聚合酶的作用下，按半保留聚合酶的作用下，按半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的DNADNA合成。不断合成。不断重复这一过程，可使目的重复这一过程，可使目的DNADNA片段得到扩增。因为新合成片段得到扩增。因为新合成的的DNADNA也可以作为模板，因而也可以作为模板，因而PCRPCR可使可使DNADNA的合成量呈指数的合成量呈指数增长。增长。第11页，共18页，编辑于2022年，星期五PCRPCR的基本成分的基本成分模板模板DNADNA特异性引物特异性引物(SEF14)(SEF14)热稳定
6、热稳定DNADNA聚合酶聚合酶dNTPdNTP二价阳离子二价阳离子缓冲液缓冲液过过 程程(高温变性、低温退火、中温延伸高温变性、低温退火、中温延伸)第12页，共18页，编辑于2022年，星期五引物设计引物设计 利用引物设计软件利用引物设计软件Primer5.0Primer5.0针对针对SEF14SEF14主要结构亚单主要结构亚单位位sefAsefA的基因序列设计引物的基因序列设计引物:上游引物上游引物Usef AUsef A为为5-5-ATGCGTAAATCAGCATCTGATGCGTAAATCAGCATCTG-3-3；下游引物；下游引物LsefALsefA为为5-5-TTAGTTTTGATA
7、CTGCTGAACTTAGTTTTGATACTGCTGAAC-3-3第13页，共18页，编辑于2022年，星期五样品处理（模板制备）样品处理（模板制备）以以12000rpm12000rpm离心离心5min,5min,上清液即含基因组上清液即含基因组DNADNA待检肉样乳待检肉样乳1g/mL1g/mL以以9mL9mL增菌液混合研碎，增菌液混合研碎，制成食品匀浆液制成食品匀浆液3737振荡培养振荡培养3 3小时小时取样液取样液1mL1mL以以2000rpm2000rpm离心离心2min,2min,取上清液取上清液以以8000rpm8000rpm离心离心5min,5min,沉淀以沉淀以50uL50u
8、L悬浮悬浮沸水浴沸水浴10min10min后迅后迅速置冰浴速置冰浴5min5min第14页，共18页，编辑于2022年，星期五反应体系反应体系10Buffer 2.5uLdNTP 2.0MgCl2 2.0上游引物（上游引物（20uM）1uL下游引物（下游引物（20uM）1uL模模 板板 2uLTaq DNA Polymerase 0.25 灭灭菌菌ddH2O up to 25uL第15页，共18页，编辑于2022年，星期五反应参数反应参数1.Initial denature 95 5 min 2.Denature 95 60s3.Anealing 47 60s 4.Elongation 72 60sReturn to 2 for 30 cycle5.Final elongation 72 10 minKeep 4 5 min第16页，共18页，编辑于2022年，星期五琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳电泳条件：电泳条件：argrose 1%U 80V T 50minPCR产物产物+Loading buffer琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳分析结果分析结果第17页，共18页，编辑于2022年，星期五 E-mail: Mobile-phone:15823280210第18页，共18页，编辑于2022年，星期五