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1、实验二蛋白质的等电点测定和沉淀反应第1页，共32页，编辑于2022年，星期五 一、实验目的一、实验目的1 1、了解蛋白质的两性解离性质、了解蛋白质的两性解离性质2 2、学习测定蛋白质等电点的一种方法、学习测定蛋白质等电点的一种方法3 3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。4 4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。5 5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。、了解蛋白质变性与沉淀的关系。第2页，共32页，编辑于2022年，星期五二、实验原理二、实验原理蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中存在下列蛋白质是两性电解质。在蛋白质
2、溶液中存在下列平衡：平衡：第3页，共32页，编辑于2022年，星期五蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的碱度影响。当溶液的PHPH达到一定数值时，蛋白达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的溶液的pHpH值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋值称为此种蛋白质的等电点。不同蛋白质各有特异的等电点。白质各有特异的等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可在等电点时，蛋白质的理化性质都有变化，可
3、利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。利用此种性质的变化测定各种蛋白质的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pHpH值。值。第4页，共32页，编辑于2022年，星期五本实验通过观察不同本实验通过观察不同pHpH溶液中的溶解度以测定酪溶液中的溶解度以测定酪蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在蛋白的等电点。用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制各种不同酪蛋白溶液中）配制各种不同pHpH值的缓冲液。向值的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓诸缓冲溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的冲液的pHpH值即为酪蛋白的等电点。
4、值即为酪蛋白的等电点。第5页，共32页，编辑于2022年，星期五在在水水溶溶液液中中的的蛋蛋白白质质分分子子由由于于表表面面生生成成水水化化层层和和双双电电层层而而成成为为稳稳定定的的亲亲水水胶胶体体颗颗粒粒，在在一一定定的的理理化化因因素素影影响响下下，蛋蛋白白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。第6页，共32页，编辑于2022年，星期五蛋白质的沉淀反应可分为蛋白质的沉淀反应可分为两类。两类。第7页，共32页，编辑于2022年，星期五v可逆的沉淀反应可逆的沉淀反应 此此时时蛋蛋白白质质分分子子的的结结构构尚尚未未发发生生显显著著变变化化，除除去去引引起起沉沉淀淀的
5、的因因素素后后，蛋蛋白白质质的的沉沉淀淀仍仍能能溶溶解解于于原原来来的的溶溶剂剂中中，并并保保持持其其天天然然性性质质而而不不变变性性。如如大大多多数数蛋蛋白白质质的的盐盐析析作作用用或或在在低低温温下下用用乙乙醇醇（或或丙丙酮酮）短短时时间间作作用用于于蛋蛋白白质质。提提纯纯蛋蛋白白质质时时，常常利利用用此此类反应。类反应。第8页，共32页，编辑于2022年，星期五v不可逆沉淀反应不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金
6、属离子或某的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。些有机酸的反应都属于此类。第9页，共32页，编辑于2022年，星期五 蛋蛋白白质质变变性性后后，有有时时由由于于维维持持溶溶液液稳稳定定的的条条件件仍仍然然存存在在（如如电电荷荷），并并不不析析出出。因因此此变变性性蛋蛋白白质质并并不不一一定定都都表表现现为为沉沉淀淀，而而沉沉淀的蛋白质也未必都已变性。淀的蛋白质也未必都已变性。第10页，共32页，编辑于2022年，星期五三、试剂器材三、试剂器材1 1、实验材料：、实验材料：鸡蛋清鸡蛋清 牛乳牛乳2 2、仪器设备：、仪器设备：水浴锅水浴锅 温度计温度计锥形瓶锥形瓶 1
7、00mL100mL容量瓶容量瓶吸管吸管试管及试管架试管及试管架 第11页，共32页，编辑于2022年，星期五 0.4%0.4%酪蛋白乙酸钠溶液酪蛋白乙酸钠溶液 取取0.4g0.4g酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将酪蛋白，加少量水在乳钵中仔细地研磨，将所得的蛋白质悬胶液移入所得的蛋白质悬胶液移入200mL200mL锥形瓶内，用少量锥形瓶内，用少量40405050的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶的温水洗涤乳钵，将洗涤液也移入锥形瓶内。加入内。加入10mL 1mol/L10mL 1mol/L醋酸钠溶液。把锥形瓶放到醋酸钠溶液。把锥形瓶放到5050水浴中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完水浴
8、中，并小心地旋转锥形瓶，直到酪蛋白完全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移到全溶解为止。将锥形瓶内的溶液全部移到100mL100mL容容量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。量瓶内，加水至刻度，塞紧玻塞，混匀。3、试剂、试剂第12页，共32页，编辑于2022年，星期五1.00mol/L 1.00mol/L 醋酸溶液醋酸溶液 100mL 100mL0.10 mol/L0.10 mol/L醋酸溶液醋酸溶液 300mL 300mL0.01 mol/L0.01 mol/L醋酸溶液醋酸溶液 50mL 50mL蛋白质溶液蛋白质溶液 500mL 500mL 5%5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液卵清蛋白溶液或鸡蛋清
9、的水溶液（新鲜鸡蛋清（新鲜鸡蛋清 ：水：水=1:9=1:9）第13页，共32页，编辑于2022年，星期五pH4.7 pH4.7 醋酸醋酸-醋酸钠的缓冲溶液；醋酸钠的缓冲溶液；3%3%硝酸银溶液；硝酸银溶液；5%5%三氯乙酸溶液；三氯乙酸溶液；95%95%乙醇；乙醇；饱和硫酸铵溶液；饱和硫酸铵溶液；硫酸铵结晶粉末；硫酸铵结晶粉末；0.1 M0.1 M盐酸溶液；盐酸溶液；0.1 M0.1 M氢氧化钠溶液；氢氧化钠溶液；0.05 M0.05 M碳酸钠溶液；碳酸钠溶液；0.1 M0.1 M醋酸溶液；醋酸溶液；甲基红溶液甲基红溶液第14页，共32页，编辑于2022年，星期五四、实验操作四、实验操作（一）
10、酪蛋白等电点的测定一）酪蛋白等电点的测定（1 1）取同样规格的试管）取同样规格的试管4 4支，按下表顺序分别支，按下表顺序分别 精确地加入各试剂，然后混匀。精确地加入各试剂，然后混匀。试管号试管号蒸馏水蒸馏水mL0.01 M醋酸醋酸mL0.1 M醋酸醋酸mL1.0 M醋酸醋酸mL18.40.6-28.7-0.338.0-1.047.4-1.6第15页，共32页，编辑于2022年，星期五（2 2）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液）向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1mL1mL，加加一管，摇匀一管。此时一管，摇匀一管。此时1 1、2 2、3 3、4 4管的管的pHpH依次为依次为5.95.9、5
11、.55.5、4.74.7、3.53.5。观察其混浊度。静置。观察其混浊度。静置10 10分钟后，再观察分钟后，再观察其混浊度。最混浊（有颗粒沉淀）的一管其混浊度。最混浊（有颗粒沉淀）的一管pHpH即为酪蛋即为酪蛋白的等电点。白的等电点。第16页，共32页，编辑于2022年，星期五（二）蛋白质沉淀实验（二）蛋白质沉淀实验第17页，共32页，编辑于2022年，星期五1 1蛋白质的盐析蛋白质的盐析：无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠：无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出等）的浓溶液能析出蛋白质。盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。的蛋白质也不同。如球蛋白可在半饱和硫酸
12、铵溶液中析出，而清蛋白则如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。在饱和硫酸铵溶液中才能析出。由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。第18页，共32页，编辑于2022年，星期五加加5%5%卵清蛋白溶液卵清蛋白溶液5 ml5 ml于试管中，再加等量的饱于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是的沉淀。倒出少量混浊沉淀，加少量水，
13、观察是否溶解，为什么？将管中内容物过滤，向滤液中否溶解，为什么？将管中内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。淀为清蛋白。取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。溶解。第19页，共32页，编辑于2022年，星期五2 2重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子沉淀蛋白质：重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。物。取取1 1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 ml2 ml，再加，再加3%3%硝酸银溶液硝酸银溶液1212滴，振荡试
14、管，有沉淀产滴，振荡试管，有沉淀产生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加生。放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？入少量的水，沉淀是否溶解？为什么？第20页，共32页，编辑于2022年，星期五3 3有机酸沉淀蛋白质：有机酸沉淀蛋白质：取取1 1支试管，加入蛋白质溶液支试管，加入蛋白质溶液2 ml2 ml，再加，再加1 1 ml5%ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加生成。放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。入少量水，观察沉淀是否溶解。第21页，共32页，编辑于2022
15、年，星期五4 4有机溶剂沉淀蛋白质：有机溶剂沉淀蛋白质：取取1 1支试管，加入支试管，加入2 ml2 ml蛋白质溶液，再加入蛋白质溶液，再加入2 ml95%2 ml95%乙醇。混匀，观察沉淀的生成。乙醇。混匀，观察沉淀的生成。第22页，共32页，编辑于2022年，星期五5 5乙醇引起的变性与沉淀乙醇引起的变性与沉淀：取取3 3支试管，编号。依下表顺序加入试剂：支试管，编号。依下表顺序加入试剂：试剂试剂 mL管号管号 5%卵卵清蛋白清蛋白0.1 M氢氧化氢氧化钠钠0.1 M盐酸盐酸95%乙乙醇醇 pH4.7缓冲液缓冲液 111121113111第23页，共32页，编辑于2022年，星期五振摇混匀
16、后，观察各管有何变化。放置片振摇混匀后，观察各管有何变化。放置片刻，向各管内加水刻，向各管内加水8 ml8 ml，然后在第，然后在第2 2、3 3号管号管中各加一滴甲基红，再分别用中各加一滴甲基红，再分别用0.1 M0.1 M醋酸溶醋酸溶液及液及0.05 M0.05 M碳酸钠溶液中和之。观察各管颜碳酸钠溶液中和之。观察各管颜色的变化和沉淀的生成。每管再加色的变化和沉淀的生成。每管再加0.1 M0.1 M盐盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。解释各管发生的全部现象。管发生的全部现象。第24页，共32页，编辑于2022年，星期五 五、实验结果五、实验结果管号 pH值
17、混浊度 解释现象1234（一）蛋白质等电点测定（一）蛋白质等电点测定第25页，共32页，编辑于2022年，星期五（二）蛋白质的盐析（二）蛋白质的盐析 第26页，共32页，编辑于2022年，星期五1 1蛋白质的盐析蛋白质的盐析 现现 象象 解解 释释蛋白质溶液中蛋白质溶液中加硫酸铵溶液加硫酸铵溶液 加水加水上清液中加硫上清液中加硫酸铵粉末酸铵粉末 加水加水第27页，共32页，编辑于2022年，星期五2 2重金属离子沉淀蛋白质重金属离子沉淀蛋白质现现 象象解解 释释蛋白质溶液蛋白质溶液中加硝酸银中加硝酸银沉淀中加水沉淀中加水第28页，共32页，编辑于2022年，星期五3 3有机酸沉淀蛋白质有机酸沉
18、淀蛋白质现现 象象解解 释释蛋白质溶液中蛋白质溶液中加三氯乙酸加三氯乙酸沉淀中加水沉淀中加水第29页，共32页，编辑于2022年，星期五4 4有机溶剂沉淀蛋白质有机溶剂沉淀蛋白质现现 象象解解 释释第30页，共32页，编辑于2022年，星期五5 5乙醇引起的变性与沉淀乙醇引起的变性与沉淀管管 号号操作操作现现 象象解解 释释1振荡混匀振荡混匀加数滴盐酸加数滴盐酸2振荡混匀振荡混匀醋酸中和醋酸中和加数滴盐酸加数滴盐酸3振荡混匀振荡混匀碳酸钠中和碳酸钠中和加数滴盐酸加数滴盐酸第31页，共32页，编辑于2022年，星期五思考题思考题1.1.鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？2.2.氯化汞为何能做为杀菌剂？氯化汞为何能做为杀菌剂？3.3.什么是蛋白质的等电点？什么是蛋白质的等电点？4.4.在在等等电电点点时时，蛋蛋白白质质溶溶液液为为什什么么容容易易发发生生沉淀沉淀？第32页，共32页，编辑于2022年，星期五