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1、药实验四:线粒体和细胞核的制备与观察 细胞器标记酶的测定是评价细胞器内膜组分和分离纯度的主要依据,如线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶,该酶使詹纳斯绿B染料保持在氧化状态呈现蓝绿色,从而使线粒体显色,而胞质中的染料被还原成无色。詹纳斯绿B是一种活体染料,能对动植物的细胞或组织在活体状态下进行无毒害的染色。由于染料(碱性染料)的胶粒表面带有阳离子,酸性染料的胶粒表面带有阴离子,而被染部分本身具有阳离子或阴离子,这样,它们彼此之间发生吸引作用,染料就被堆积下来。染色法可以显示出活细胞内的某种天然结构存在的真实性,且不影响细胞的生命活动。Gimesa是一种复合染料,即为酸性染料与碱性染料的结合物。在水
2、溶液中电离为带正电和负电的染料离子。三、实验材料、用品三、实验材料、用品1.器材:解剖刀,剪刀,漏斗,玻璃匀浆器玻璃匀浆器,尼龙织物,离心管,显微镜,冷冻高速离心机等。2.材料:兔肝脏,玉米黄化苗3.试剂:(1)0.25mol/L蔗糖-0.01mol/L三羟甲基氨基甲 烷(Tris)-盐酸缓冲液(pH7.4)(2)1%詹纳斯绿B(Janus green B)染液。(3)姬姆萨染液(Giemsa)。(4)1/15 mol/L磷酸缓冲液(pH6.8)(5)卡诺(Cornay)固定液。(6)生理盐水四、实验步骤四、实验步骤(一一)兔肝细胞线粒体及细胞核的分离兔肝细胞线粒体及细胞核的分离(动物材料)1
3、.制备肝细胞匀浆:实验前将白兔空腹12小时,脱臼处死,剖腹取肝,迅速用生理盐水洗净血水,用滤纸吸干水,称取肝组织0.3g,剪碎;用预冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。然后加1.5 ml预冷的0.25mol/L蔗糖溶液,分数次添加蔗糖溶液,冰浴中用玻璃匀浆器将肝制成匀浆,肝匀浆用双层纱布过滤(滤液制两张涂片滤液制两张涂片).涂片过程:涂片过程:3.3.分离物鉴定:分离物鉴定:(1 1)细胞核:将涂片细胞核:将涂片(不加盖玻片)(不加盖玻片)自然干燥后自然干燥后加入加入CarnoyCarnoy固定液固定液15min15min,晾干。,晾干。GiemsaGiemsa染液染染液染10min10m
4、in,蒸馏水漂洗数秒,用滤纸吸干水,用显微镜(蒸馏水漂洗数秒,用滤纸吸干水,用显微镜(4040)检)检查,查,细胞核呈紫红色,混杂的细胞质为浅蓝色碎片。细胞核呈紫红色,混杂的细胞质为浅蓝色碎片。(2 2)线粒体:取线粒体沉淀滴在载玻片上,得涂片线粒体:取线粒体沉淀滴在载玻片上,得涂片,勿太密。滴加,勿太密。滴加1-21-2滴滴1%1%詹纳斯绿詹纳斯绿B B溶液染色,溶液染色,1010分分钟后钟后加盖玻片,吸水纸吸走多余染料,加盖玻片,吸水纸吸走多余染料,用光学显微镜观用光学显微镜观察,察,线粒体呈蓝绿色,小棒状或哑铃状。线粒体呈蓝绿色,小棒状或哑铃状。(二二)玉米线粒体及细胞核的分离玉米线粒体
5、及细胞核的分离(植物材料)(植物材料)从植物细胞分离线粒体,除了作线粒体功能研究外,在植物细胞遗传工程中,常用于分离核外基因线粒体DNA等目的。分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差数离心。介质中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二价阳离子,Ca2+除去后细胞间粘着解体,促使组织分散成单个细胞。牛血清白蛋白(BSA)能包在细胞外面,并作为竞争性底物削弱蛋白酶的作用。1.试剂1)分离介质:0.25mol/L蔗糖,50mmol/L的 Tris-HCl缓冲液(pH7.4),3 mmol/L EDTA,0.75 mg/ml BSA。2)保存液:0.3 mol/L 甘露
6、醇(pH7.4)。3)20%NaClO溶液。4)1%詹纳斯绿B染液,用生理盐水配制。2.器材剪刀,漏斗,研钵研钵,纱布,离心管,显微镜,冷冻高速离心机等。3.实验方法1)剪取12cm长的幼苗黄化苗0.5g,剪碎;加2.0 ml预冷的分离介质,冰浴上研磨成匀浆。2)匀浆用双层纱布过滤(滤液制两张涂片滤液制两张涂片).3)滤液700g离心10分钟,除去核和杂质沉淀。4)上清夜10000g离心15分钟,沉淀为线粒体制涂片制涂片5)涂片未干时,立即滴加1%詹纳斯绿B染液,染色10分钟,盖上盖玻片盖上盖玻片,用显微镜观察,线粒体是蓝绿色圆形颗粒。五、实验结果五、实验结果光学显微镜观察,线粒体呈蓝绿色,小棒状或光学显微镜观察,线粒体呈蓝绿色,小棒状或哑铃状。哑铃状。六、实验报告六、实验报告1.分别描述2张细胞核涂片的结果(如平均每个视野中 所见完整的细胞核数量,完整的细胞或带有残留细 胞质的细胞核的约占多少等)2.分别描述鼠和水稻黄化苗的两张线粒体装片的观察 结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体的 纯度如何?3.绘图:动物材料涂片绘图:动物材料涂片,植物材料涂片,植物材料涂片,并并比较动物和植物线粒体的差异。此课件下载可自行编辑修改,仅供参考!此课件下载可自行编辑修改,仅供参考!感谢您的支持,我们努力做得更好!谢谢感谢您的支持,我们努力做得更好!谢谢